Name: 마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 마우스 두개안면 조직의 면역형광 검출법을 통해 항원 회수와 탈석화 없이 고품질 면역 염색을 수행하는 방법을. 이 기법은 연구자들이 뼈 조직에서 단백질 수준을 효율적으로 분석할 수 있게 합니다.

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이 작품은 국립 보건원 (R01DE020843 ~ Y.M.), 국제 FOP 협회 (Y.M.), 중국 국립 자연 과학 재단 (31500788 ~ J.Y.)의 보조금 지원으로 지원되었습니다.

모든 마우스 실험은 연구에서 동물의 인도적 관리 및 사용을 다루는 미시간 대학 지침에 따라 수행되었다. 이 연구에서 사용된 모든 동물 절차는 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 #PRO00007715).
1. 조직 준비
<ol><li>
배아 조직의 준비
	<ol>
<li>10cm 접시 1개, 인산완충식염수(PBS)를 함유한 3.5cm 접시 1개, 임신한 마우스마다 PBS에 2 mL 4% 파라포름알데히드(PFA)가 들어있는 12웰 배양 플레이트 1개를 준비한다. 모든 페트리 요리와 접시를 얼음 위에 놓습니다. 참고: 연기 후드에 4% PFA를 처리합니다.</li>
		<li>앞서 설명한 바와 같이 집게와 가위로 얼음 차가운 PBS에서 임신 한 마우스에서 배아를 해부14.<ol>
<li>간단히, CO2로 임신 마우스를 안락사, 집게로 배의 중심 아래 피부를 잡고 피부를 통해 잘라, 다음 부드럽게 기본 복근 벽에서 분리 피부를 당겨.</li>
			<li>다음으로, 피부 절개의 동일한 라인을 따라 복강으로 잘라. 배아의 문자열을 포함하는 자궁을 제거하고 자궁 벽을 부드럽게 절단하여 배아를 제거합니다. 노른자 낭 및 양수와 같은 배아 조직은 제거됩니다.</li>
			<li>각 배아에서 머리를 자르고 분리합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>플라스틱 전사 파이펫 또는 집게로 4% PFA를 포함하는 12웰 플레이트의 각 웰에 각 헤드를 옮김을 옮김을 넣습니다. 4°C에서 4°C의 PFA에서 4%의 시료를 4°C에서 PBS에서 헹구고 12시간 동안 부드럽게 흔들어 시료를 고정합니다. 참고: 배아일 16.5(E16.5)보다 어린 배아의 경우, 분리 후 직접 4% PFA로 배아 머리를 고정합니다. E16.5 이상 배아의 경우, 피부와 지방 조직을 머리에서 제거하고 고정하기 전에 얼음 차가운 PBS에서 여러 번 헹구십시오.</li>
		<li>냉동 보호 헤드.<ol>
<li>플라스틱 전사 파이펫 또는 집게를 사용하여 PBS에서 30% 자당의 2 mL을 포함하는 새로운 12 웰 플레이트에 각 헤드를 옮김을 옮김. 머리가 접시의 바닥에 가라 앉을 때까지 4 °C에서 부드럽게 교반.</li>
		</ol>
</li>
		<li>헤드를 포함합니다.<ol>
<li>최적 절삭 온도(OCT) 화합물이 포함된 금형으로 냉동 보호 헤드를 옮니다. OCT에서 몇 분 동안 샘플을 평형화합니다. 집게로 샘플의 위치와 방향을 조정합니다.</li>
			<li>금형을 드라이 아이스 위에 놓고 얼립니다. 냉동 절편이 준비될 때까지 -80°C의 비닐 봉지에 극저온을 보관하십시오. 참고: 시료의 트리밍 된 면은 임베딩 금형의 바닥을 향해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
출생 후 분신되지 않은 경조직의 준비
	<ol>
<li>CO2를 가진 3 주 또는 3달 오래된 마우스에서 안락사 . 피부와 지방 조직을 제거하십시오. 머리 또는 긴 뼈를 마우스에서 자르고 분리합니다.</li>
		<li>단계 1.1.3-1.1.4에 기재된 바와 같이 마우스의 머리 또는 긴 뼈를 고치고 냉동 보호한다.</li>
		<li>1.1.5단계와 유사한 방식으로 8% 젤라틴에 포함시다. 냉동 부조가 될 때까지 - 80 °C에서 비닐 봉지에 cryomolds을 유지합니다. 참고: 여기서는 탈석화가 필요하지 않습니다. 8% 젤라틴을 준비하려면 8 g의 젤라틴을 PBS 100 mL와 섞고 전자레인지를 사용하여 끓입니다. 혼합물이 쉽게 끓는다는 점에 유의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 냉동 부속
<ol><li>OCT 또는 -25°C에 내장된 연조직을 위해 저온 온도를 -18°C로 설정하고 젤라틴에 내장된 비정형 경질 조직을 위해 더 낮게 설정합니다. 저온 온도에 평형을 위해 약 30 분 동안 저온 유지 챔버에 샘플을 유지합니다.</li>
	<li>극저온에서 블록을 추방하십시오. OCT 드롭으로 장착하여 시편 척(티슈 홀더)에 블록을 고정시. 샘플의 트림된 면을 척에서 가장 멀리 유지합니다(작업자를 향하게 함).</li>
	<li>블록 장착 척을 저온 극저온 물체 홀더에 로드합니다. 블레이드 홀더를 조정하여 시료를 기준으로 블레이드의 각도를 3°-5°로 만듭니다.</li>
	<li>코팅 된 현미경 슬라이드에 10 μm 섹션을 수집합니다. RT에서 완전히 건조 된 다음 -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>3. 조직학적 염색 및 현미경 이미징
<ol><li>면역형광 염색
	<ol>
<li>-80 °C에서 슬라이드를 꺼내십시오. RT에서 1시간 동안 에어드라이 섹션에 슬라이드를 유지합니다. 0.1% PBST(0.1% 폴리에틸렌 글리콜 테르트-옥틸페닐 에테르PBS; 재료 표참조)에서 0.1%의 슬라이드를 헹구어 OCT를 세척하고 섹션을 투과시하기 위해 각각 5분 동안 세 번 참조하십시오.</li>
		<li>선택적으로, 항원 회수(선택사항)를 수행한다.<ol>
<li>구연산염 완충제 (10 mM 구연산 나트륨 pH 6)를 스테인딩 접시에 증기또는 수조로 95-100 °C로 예열합니다. 구연산염 버퍼에 슬라이드를 담그고 10 분 동안 배양하십시오.</li>
			<li>스티머 나 수조에서 염색 접시를 RT로 가져 가라. 참고: 대안으로, Tris-EDTA 버퍼(10 mM Tris base, 1mM EDTA, 0.05% 트웬트 20, pH 9.0) 또는 EDTA 버퍼(1 mMEDTA, 0.05% 트웬20, pH 8.0)를 열 유도 항원 회수에 사용한다. 뜨거운 증기선 이외에 열 유도 항원 회수를 위해 압력 밥솥, 전자 레인지 또는 수조를 사용하십시오. 트립신 또는 펩신을 이용한 효소 유도 항원 회수는 또 다른 대안이다. 효소 검색의 농도 및 처리 시간을 최적화하여 손상된 부분을 방지합니다. 각 항체/항원 조합에 대한 항원 검색 방법을 최적화합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 슬라이드에 200 μL의 차단 용액 (5 % 당나귀 혈청을 0.1 % PBST로 희석)으로 30 분 동안 RT에서 인큐베이션한 다음 헹구지 않고 차단 용액을 제거하십시오.</li>
		<li>1차 항체 또는 4°C에서 RT 또는 O/N에서 1시간 동안 차단 용액으로 희석된 100 μL의 각 슬라이드를 배양합니다. RT에서 각각 10분 동안 PBS로 슬라이드를 세 번 헹구십시오.</li>
		<li>RT. Rinse 슬라이드에서 1시간 동안 차단 용액에 희석된 이차 항체 100 μL로 각 슬라이드를 10분 동안 PBS에서 10분 동안 3회 배양합니다.</li>
		<li>슬라이드를 마운트합니다.<ol>
<li>슬라이드에 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole)와 함께 페이드 방지 매체 2방울을 넣습니다. 그런 다음 커버슬립으로 덮습니다.</li>
			<li>이미지가 준비될 때까지 어두운 4°C에서 보관하십시오. 참고: 대안으로, DAPI 또는 Hoechst 33324 염료로 핵을 라벨을 붙인 후 RT에서 PBS에서 1:2,000을 희석한 다음 글리세롤로 장착합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>단말 디옥시클레오디딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 염색. 참고: 3'-하이드록실 테르미니(3'OH DNA termini)를 가진 이중 가닥 DNA는 세포에 있는 세포자멸 도중 형성될 것입니다. 여기서, 우리는 상용 키트를 사용하여 특정 염색에 의해 말단 디옥시뉴클레오디딜 트랜스퍼라제(TdT)를 활용한 디곡시게닌-뉴클레오티드와 DNA 단편라벨링을 통해 자리에 자유 3'OH DNA 테르미니를 라벨링하는 프로토콜을 제공한다(재료표 참조) ).<ol>
<li>선택적으로, TUNEL 염색 전에 1차 및 알렉사 플루오르-488 표지된 이차 항체를 가진 얼룩 섹션. 슬라이드를 PBS에서 10분 동안 세 번 헹구십시오. 참고: 이 단계는 동일한 슬라이드에서 단백질과 TUNEL의 이중 염색에 대한 선택 사항입니다.</li>
		<li>RT. 린스 슬라이드에서 RT. 린스 슬라이드에서 5분 동안 100 μL Proteinasae K(10 mMS pH 7.5 및 5 mM EDTA)로 각 슬라이드를 100μl 씩 인큐베이션합니다. 참고: 각 조직 유형에 대한 단백질분해아제 K의 배양 시간 및 온도를 조정합니다. 4% PFA에 고정된 배아 헤드의 10 μm 섹션의 경우 RT에서 5분 동안 배양합니다. 프로틴라제 K를 사용하는 방법 이외에, 필요에 따라 대체 요법을 사용, 포함 하 여 (1) 갓 제조 0.1% 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르, 0.1% 구연산 나트륨, 37°C에서 10 분; (2) HCl (pH 2) 또는 0.25 % 트립신에서 0.25 % 펩신, 37 °C에서 10 분; (3) 0.1 M 구연산염 완충제 (pH 6)로 전자 레인지 조사.</li>
		<li>각 슬라이드에 차단 용액 200 μL (0.1 % PBST로 희석 된 5 % 당나귀 혈청)을 바르고 RT에서 30 분 동안 배양하고 헹구지 않고 차단 용액을 탭하십시오.</li>
		<li>키트에서 공급되는 평형 버퍼의 50 μL을 RT의 각 슬라이드에 10s 이상 적용합니다.</li>
		<li>TdT 효소와 키트에 의해 공급되는 반응 완충액을 3:7의 비율로 혼합하여 반응 혼합물(작동 강도 TdT 효소)을 준비합니다. 각 슬라이드에 반응 혼합물의 50 μL을 적용하고, 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 헹구지 않고 완충액을 탭합니다.</li>
		<li>각 슬라이드에 키트에 의해 공급되는 스톱 버퍼(1:30ddH 2O에서 희석된 1:30)의 200 μL을 적용한 다음 RT에서 10분 동안 인큐베이션합니다.</li>
		<li>로다민 항체로 라벨.<ol>
<li>각 슬라이드에 미리 온난(RT) 안티 디곡시겐 응고체(로다민)(블로킹 용액에 희석된 1:1)를 50 μL을 적용합니다. RT에서 30분 동안 어두운 환경에서 배양합니다.</li>
			<li>PBS로 슬라이드를 10분 동안 세 번 헹구십시오. 슬라이드를 3.1.6 단계로 마운트합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>4. 이미징 획득
<ol><li>양성 대조군(표적 항원에 대해 양성 조직)을 사용하여 신호 라벨링 및 음성 대조군(표적 항원에 대한 1차 항체, 등형 조절 또는 음성 조직 제외)을 확인하여 형광 아래이미지의 배경을 평가합니다. 현미경.</li>
	<li>음극 및 포지티브 컨트롤의 신호 강도를 기반으로 이미징을 위해 장비 및 카메라 조건(노출 및 기타 일반 설정)을 설정합니다. 참고: 이러한 조건은 (1) 이미징에 사용되는 카메라 및 현미경, (2) 항체 및 (3) 각 실험에 대한 조직에 따라 다릅니다. 두개안면 조직에 사용되는 일반적인 조건은 ISO 200이며 1/100s에서 1s까지의 노출 시간은 항체의 품질과 특이성에 따라 다릅니다. 적절한 배율은 샘플의 크기와 실험 목적에 따라 달라집니다.</li>
	<li>기존의 에피오레소레전스 현미경 또는 공초점 현미경으로 이미지를 수집합니다. 각 색상 채널에 대해 동일한 조건에서 이미지(해당 컨트롤 포함)를 수집합니다. 동일한 형식으로 이미지를 저장합니다(tiff는 정보를 보존하는 것이 가장 좋습니다).</li>
</ol>5. 형광 정량화
참고: 통계적으로 다른 그룹 사이의 얼룩을 비교하는 것은 많은 경우에 더 유익할 것입니다. 면역형광 이미지를 사용하면 신호 밀도를 측정하거나, 양성 세포를 계산하거나, 양성 영역을 계산하여 단백질의 상대적 수준을 정량화합니다. 통계 분석을 위해, 생물학적으로 독립적인 샘플의 최소 수는 3이다. 일반적인 방법은 각 샘플에서 적어도 3개의 섹션을 생성하고 각 섹션에서 적어도 3개의 대표 영역에 대한 이미지를 찍는 것입니다.
<ol><li>
ImageJ를 사용하여 형광 강도 정량화
	<ol>
<li>소프트웨어를 열고 분석 > 측정 설정(값)을 사용하여 면적 및 통합 밀도만 선택되어 있는지 확인합니다. 파일 > 열림을 사용하여 이미지를 열어 분석합니다.</li>
		<li>도구 모음을 사용하여 맨 왼쪽에 있는 사각형 또는 원 아이콘을 선택합니다. 선택 도구를 사용하여 이미지에서 분석할 영역을 선택합니다. 분석 > 측정을 사용하여 선택한 영역의 판독값과 결과 창에서 통합 밀도를 가져옵니다. 배경을 읽을 형광이 없는 양전지 옆의 영역을 선택합니다.</li>
		<li>5.1.2단계를 반복하여 다른 이미지를 분석합니다. 분석할 영역을 첫 번째 이미지의 이미지와 일치하도록 조정했습니다.</li>
		<li>분석이 끝나면 결과 창의 모든 데이터를 복사하고 스프레드시트에 붙여넣습니다.</li>
		<li>보정된 형광 강도(CTCF)를 통합 밀도로 계산합니다(선택한 셀 영역 x 배경 판독값의 평균 형광 영역). 시료 간의 교정된 총 세포 형광의 차이를 비교하고 그래프를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ImageJ를 사용하여 형광 이미지의 양성 세포 수의 정량화
	<ol>
<li>수동 셀 카운트.<ol>
<li>셀 카운터 플러그인을 설치하려면 ImageJ > 플러그인 > 분석을 사용합니다.</li>
			<li>파일 > 열림을 사용하여 이미지를 열어 분석합니다. 플러그인 > 분석 > 셀 카운터를 사용하여 카운터 창과 결과 창을 엽니다. 참고: 셀 카운터는 스택에서 작동하지 않습니다. 스택 을 계산하려면 플러그인 플롯 Z 축프로파일을 사용한 다음 이미지 > 스택 > 플롯 Z 축 프로파일을 사용하여 파티클 추적 도구를 사용하여 움직이는 ROI의 강도를 모니터링합니다. 이 도구는 수동 또는 자동 중 하나가 될 수 있습니다.</li>
			<li>카운터 창 하단에 있는 버튼 중 하나를 클릭하여 계산을 시작합니다. 셀/오브젝트를 직접 클릭하여 완료될 때까지 계산합니다.</li>
			<li>카운트 창에서 결과 단추를 클릭합니다. 계산된 총 셀 수는 결과 창에 표시됩니다. 결과 로그를 스프레드시트로 저장하고 분석합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>자동 셀 카운트.<ol>
<li>파일 > 열림을 사용하여 이미지를 열어 분석합니다. 계속하기 전에 RGB 이미지를 회색 배율 이미지로 변환합니다.</li>
			<li>이미지 > 조정 > 임계값을 사용하여 계산해야 하는 모든 영역을 선택합니다.</li>
			<li>분석 > 입자 를 분석하여 셀/파티클 수를 가져옵니다. 특정 범위 내의 셀/파티클을 계산하기 위해 0-Infinity의 기본값 대신 유효한 입자 크기(예: 100-무한대)의 범위를 설정합니다. 결과 로그를 스프레드시트로 저장하고 분석합니다. 참고: 영역에서 다른 정보를 얻으려면 영역 외에 분석 > 측정 설정으로 이동하여 필요한 정보 옆에 있는 상자를 선택합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서 우리는 마우스 헤드 및 dedecalcified 뼈 조직의 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 세포 증식, 세포 사멸 및 BMP 신호 마커의 면역 염색을 위한 냉동 부피. 우리는 또한 면역 형광 이미지에서 정량적 데이터를 얻기위한 전략을 자세히 설명합니다. 그 방법은 또한 적절한 수정을 가진 그밖 조직에 적용될 수 있습니다.
조직 준비를위한 조건은 조직의 크기와 유형에 따라 다릅니다. 고정 및 냉동 보호 시간은 일반적으로 하룻밤에 몇 시간이 필요합니다. 고정 후, 조직은 파라핀에 내장되어 마이크로토메16으로단면화 될 수 있습니다. 파라핀과 OCT 는 면역 염색에 잘 작동하지만, 그들 사이에는 몇 가지 차이점이 있습니다. 파라핀 블록은 RT에서 수년 동안 보관할 수 있으며 OCT 블록은 -80 °C에서 1 년 동안 유지됩니다. 파라핀은 조직 형태를 보존하며, OCT 포함 중에 형성된 얼음 결정은 조직 구조에 부정적인 영향을 ...

얼굴은 인간 정체성의 중요한 부분이며 상피, 근육, 뼈, 연골, 치아와 같은 여러 가지 유형의 조직으로 구성됩니다. 그 조직은 모든 3개의 세균 층에서 파생됩니다: ectoderm, 내배엽및 중배엽 1,2. 두개안면 조직의 적절한 패터닝 및 개발을 위해서는 Wnt, Fgf, Hh 및 Bmp 경로3,4와 같은 특정 신호 경로에 의해 세포 증식, 사망 및 분화가 고도로 조정되고 조절되어야 합니다. ,5. 세포의 증식, 생존 또는 분화의 결함은 가장 자주 발생하는 선천성 선천성 선천적 인 결함 중 하나 인 두개안면 기형으로 이어질 것입니다. 형질전환 마우스는 두개안면 형태 형성 및 병인의 메커니즘을연구하는 데 유용한 도구1, 2,3,4,5. 발달과 병인 동안 두개안면 구조의 변화를 이해하는 것은 주요 발달 원리뿐만 아니라 두개안면 기형의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 것입니다1,2,3 ,4,5.
특정 항체를 가진 전체 마운트 또는 단면 조직의 염색은 관심 있는 단백질의 공간 분포를 결정하기 위한 귀중한 기술이다 6. 공식적으로, 조직 면역 염색은 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 형광 (IF)에 의존 할 수 있습니다. IHC에 의해 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)과 같은 발색성 기질로 생성된 불투명 반응 생성물과 비교하여, IF는 형광 현미경 검사법에 의해 보이는 형광 접합체의 사용을 포함한다. 따라서 IF는 배경 잡음으로부터 양성 세포를 명확하게 구별할 수 있으며, ImageJ 및 Adobe Photoshop7,8과같은 소프트웨어에 의해 이미지를 정량적으로 분석하고 향상시킬 수 있다. 전체 마운트 염색 접근법은 작은 조직 블록 (두께 5mm 미만)에서 작동하며섹션9, 10에서 재건 할 필요없이 단백질 / 항원의 위치에 대한 3 차원 정보를 제공 할 수있습니다. . 그러나, 조직 단면도와 비교해, 전체 마운트 면역 염색은 시간이 오래 걸리고 항체 해결책의 대량을 요구합니다. 모든 항체가 기본 전체 마운트 접근법과 호환되는 것은 아닙니다. 또한, 항체의 불완전한 침투는 고르지 못한 염색 또는 거짓 음성 염색을 초래할 것이다. 여기에서 우리는 단면조직에 단백질/항원의 면역형광 검출에 집중할 것입니다. 단단한 조직(예를 들어, 머리, 치아, 긴 뼈)의 경우, 발달/병인 동안 칼슘 침착은 면역 염색 치료 동안 시료를 단면화하기 어렵게 하고 쉽게 헹구게 한다11,12. 현재 이용 가능한 대부분의 프로토콜은 절편을 쉽게 하기 위해 삽입하기 전에 단단한 조직을 decalcify, 이는 시간이 많이 걸리고 부적절하게 처리하는 경우 샘플의 형태 및 항원을 파괴 할 수있다11,12. 문제를 극복하기 위해, 우리는 decalcification없이 단단한 조직의 냉동 절제에 대한 접근 방식을 최적화, 그들의 형태와 신호 단백질의 분포의 개선 시각화로 이어지는.
여기서 기술된 프로토콜은 BMP 형질전환 마우스의 두개안면 조직에서 형태측정 및 조직학적 변화를 결정하는 데 사용되고 있다. 구체적으로, 이 프로토콜은 (1) 두체 조직을 수확및 해부하는 것, (2) 실험 마커의 절편 및 면역염색(Ki67, pSmad1/5/9)과 TUNEL 염색, (3) 형광 현미경을 사용하여 단면을 이미징하고, 마지막으로 (4) 결과를 분석하고 정량화합니다. 탈석없이 경조직을 준비하고 저온절하는 프로토콜도기재되어있다. 그 방법은 두개안면 조직에 최적화되어 있습니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 견본의 각종 나이에서 그밖 조직에 적용가능합니다.

<table><tbody><tr><td>접착 테이프</td><td>Leica</td><td>#39475214</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Antifade Mountant with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Brand</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr> 현장 현미경&<tr><td>nbsp; 세포 사멸 감지 키트</td><td>Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher 브랜드</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>OCT 화합물</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜&nbsp; tert-옥틸페닐 에테르</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2542</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ki67 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9129</td><td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td></tr><tr><td>토끼 anti-pSmad1/5/9 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>13820</td><td>Lot#:3; RRID : AB_2493181</td></tr><tr><td>구연산 나트륨</td><td>시그마</td><td>1613859</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마</td><td>10708976001</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

조직 면역 염색은 주어진 조직 내의 관심 있는 단백질의 고도로 특이하고 믿을 수 있는 검출을 제공합니다. 여기에서 우리는 예를 들면 마우스 두개안면 조직을 사용하여 두개안면 형태 형성/병인 도중 단백질 발현을 검출하는 완전하고 간단한 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 조직의 준비 및 냉동 부피, 간접 면역 형광, 이미지 수집 및 정량화로 구성됩니다. 또한 면역 염색을위한 비해짐 경조직의 준비 및 냉동 절제 방법은 두개안면 조직과 긴 뼈를 예로 들수 있습니다. 그 방법은 두개안면 형태 형성/병인 동안 다양한 조직에서 단백질 발현 및 형태학적/해부학적 변화를 결정하는 데 핵심적인 것입니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 그밖 조직에 적용가능합니다. 연구 결과에 대한 지식과 섹션의 높은 품질은 실험 결과에서 과학적 결론을 도출하는 데 중요합니다. 이 방법론의 잠재적 한계는 항체의 특이성 및 정량화의 어려움에 한정되지 않으나, 이는 또한 여기에서 논의된다.

배아 두개안면 조직 섹션 상기 단계에 따라, 머리는 배아의 날(E) 16.5 또는 18.5에서대조군(P0-Cre)또는 돌연변이체(신경 문장 세포에서 Bmpr1a, P0-Cre; caBmpr1a)에서배아를 해부하였다. 4 시간 동안 4 % PFA에 고정 한 후, 샘플을 OCT에 내장하고 코로나절하였다. 결과된 절편은 프로토콜에 따라 항원 검색 없이 pSmad1/5/9(다운스트림 BMP 신호 인자) 또는 Ki67(세포 증식 마커)에 대한 항체로 면역화되었다. 도시된 바와 같이, pSmad1/5/9 (도1A)및 Ki67 (그림1C)은대조군 배아의 정면 뼈에서 양성이었다. 돌연변이 배아에서, pSmad1/5/9의 수준이 증가하였다 (그림1B),Ki67의...

여기에서, 우리는 마우스 두개안면 조직을 사용하여 면역 염색에 의해 두개안면 형태 형성/병인 동안 단백질 수준을 검출하고 정량화하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 면역 염색을 위한 젊은 마우스에게서 decalcified 되지 않은 단단한 조직의 준비 그리고 저온 절제를 위한 방법을 기술합니다.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

여기서는 단면 물질에 대한 단백질에 대한 면역 형광 검출을 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 항원 회수가 필요하지 않습니다. 우리는 변형되지 않은 단단한 조직을 포함하여 마우스 머리를 사용합니다.이 기술의 주요 장점은 항원 회수 및 하드 조직의 탈화를 건너 뛰는 것입니다. 그 면역 염색 결과의 좋은 품질로 이어질. 이 방법은 또한 시간과 노동을 모두 절약합니다.이 방법은 적절한 수정이 가능한 다른 조직에도 적용됩니다. 탈균되지 않은 조직에서 좋은 섹션을 만들려면 대상 조직을 더 해부하여 주변 조직을 다듬고 필요한 경우 냉동 보호 전에 2 일 동안 섭씨 4도에서 10 %EDTA로 샘플을 치료하십시오. 시각적 데모는 이 방법의 절차에 대한 상세하고 명확한 설명을 제공합니다.우선, PBS가 포함된 10센티미터 및 3.5센티미터 요리 1개와 임신한 마우스 각각의 4%PFA 2밀리리터를 포함하는 12웰 배양 플레이트 1개를 PBS에 각각 양으로 준비하고 모두 얼음 위에 놓습니다. 임신 한 마우스에서 배아를 해부하려면, 집게와 안락사 마우스의 배의 중심 아래 피부를 잡아, 피부를 통해 잘라, 다음 부드럽게 기본 복근 벽에서 분리 피부를 당겨. 피부 절개의 동일한 라인을 따라, 복강으로 잘라.배아의 문자열을 포함하는 자궁을 제거합니다. 그런 다음, 자궁 벽을 부드럽게 절단하여 배아를 제거하여 노른자 낭및 양막과 같은 외화 조직을 제거합니다. 각 배아로부터 머리를 자르고 분리하고, 집게가 각 머리를 4%의 PFA를 포함하는 12웰 플레이트의 분리된 우물로 옮기는다.4시간 동안 섭씨 4도에서 배양하여 수정합니다. 12시간 동안 부드러운 흔들림으로 PBS에서 머리를 섭씨 4도에서 헹구는 다. 머리를 보호하려면 PBS에서 30 % 자당 2 밀리리터가 들어있는 새로운 12 웰 플레이트로 집게를 사용하여 전송하십시오.머리가 접시의 바닥에 가라 앉을 때까지 섭씨 4도에서 부드러운 동요로 배양하십시오. 냉동 보호 헤드를 포함하려면 최적의 절삭 온도 화합물이 들어있는 금형으로 옮기고 몇 분 동안 평형합니다. 집게를 사용하여 샘플의 트리밍 측이 포함 금형의 바닥을 향하도록 샘플의 위치와 방향을 조정합니다.그런 다음 금형을 드라이 아이스에 놓고 동결하고 냉동 절전을 준비할 때까지 비닐 봉지에 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 산후 조직의 경우, 안락사된 3개월에서 3개월까지의 마우스의 피부와 조직을 제거한 후 머리를 자르고 분리하고 하악을 제거합니다. 그런 다음, 배아 헤드와 같이 머리를 고정하고 냉동 보호합니다.10월에 배아 헤드와 비슷한 방식으로 8%젤라틴을 포함하고, 극저온이 저온까지 영하 80도의 비닐봉지에 극저온을 보관합니다. 적절한 저온 온도를 설정합니다. 저온 온도에 평형하기 위해 약 30 분 동안 냉동 챔버에 샘플을 놓습니다.Cryomold의 샘플로 블록을 제거하고 10월 드롭을 시편 척에 장착하여 동결하여 샘플의 트리밍 된 면을 척에서 가장 멀리 유지하고 작업자를 향하도록하십시오. 블록 장착 척을 극저스트 오브젝트 홀더에 로드합니다. 블레이드 홀더를 조정하여 블레이드 각도가 시료에 비해 3~5도되도록 합니다.코팅 된 현미경 슬라이드에 10 마이크로 미터 섹션을 수집합니다. 완전히 건조 할 때까지 실온에서 섹션을 두고, 다음 영하 80도에서 저장합니다. 염색으로 시작하려면 영하 80도에서 슬라이드를 꺼내 실온에서 1 시간 동안 유지하여 섹션을 공기 건조시하십시오.슬라이드를 0.1%PBST로 3회 3회 헹구어 각 5분간 10월을 씻어내고 섹션을 투과화합니다. 각 슬라이드에 블로킹 솔루션 200마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 헹구지 않고 차단 용액을 제거합니다.각 슬라이드에 차단 용액에 희석 된 1 차 성 항체의 100 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 실온에서 각각 10분 동안 PBS로 슬라이드를 세 번 헹구십시오. 차단 용액에 희석된 이차 항체 100마이크로리터를 추가하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 배양합니다.실온에서 각각 10분 동안 PBS에서 세 번 헹구면 여전히 빛으로부터 보호됩니다. 슬라이드를 장착하려면 각 슬라이드에 DAPI가 있는 페이드 방지 매체 2방울을 추가하고 커버슬립으로 덮고 이미지준비될 때까지 섭씨 4도에 저장합니다. 대조군 배아의 정면 골격은 pSmad1/5/9, 다운스트림 BMP 신호인자 및 세포 증식 마커인 Ki67에 대해 양성이었습니다.신경 문장 별에서, 구성적으로 활성화 된 BMPR1A 돌연변이 배아, 그러나, PSmad1/5/9 수준은 Ki67 수준이 감소하는 동안 증가했다. 더욱이, 더 많은 세포세포는 대조군 배아의 세포보다는 돌연변이 배아의 정면 뼈에서 관찰되었다. 젤라틴 임베디드 헤드의 관상 극저섹션은 비강 뼈와 비강 조직의 tdTomato 카세트에서 GFP 신호 및 RFP 신호를 명확하게 보여주며 젤라틴이 형광 신호를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다.이러한 섹션이 SOX9 또는 Osterix 및 E11/Podoplanin에 대해 면역 염색되었을 때, 3주 간의 단단한 조직의 대부분에서 양질의 섹션을 얻을 수 있었습니다. 한편, 3개월 된 시료로, 대퇴골의 궤적 구획, 비강 조직, 두개골 등 일부 단단한 조직에서만 양질의 섹션을 얻을 수 있었는데, 여기에는 비강-프리맥스야 봉합사및 머리의 주변 뼈가 포함되었다. SOX9 양성 세포는 대퇴골과 비강 중격으로부터 성장판과 조인트의 연골세포에서 구체적으로 검출되었다.3주 된 절개에서 SOX9는 중간엽 세포에서 검출되었습니다. Osterix와 E11 이중 염색 결과 Osterix는 골세포에서 검출된 것을 보여주고, E11은 대퇴골과 머리에서 뼈의 골다귀에서 검출되었습니다. 3 주 절개에서, Osterix는 오돈토 블라스트에서 긍정적이었다, E11여포 중간 엽 세포에서 긍정적이었다 동안.4%의 PFA로 샘플을 과대수정하지 마십시오. 젤라틴에서 탈균화되지 않은 단단한 조직의 단면에 대 한, 최고의 온도 영하 25 섭씨 낮은. 이 절차에 따라, 형광의 수준은 우리의 프로토콜에 설명된 대로 정량화될 수 있습니다.이러한 측정은 서로 다른 그룹 간의 단백질의 상대적 수준의 차이를 보여주기 위해 유익한 데이터를 제공합니다. 개발 후, 이 기술은 다른 단백질의 공동 발현 패턴을 얻기 위해 이중 또는 삼중 염색을위한 길을 열었습니다. 4% PFA는 위험합니다.그것은 피부 알레르기, 심각한 눈 손상, 장기 손상, 또는 암을 일으킬 수 있습니다. 취급 후 개인 보호 장비를 사용하고 피부를 철저히 씻어 주세요.

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Research

연구

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