마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

여기에서, 우리는 마우스 두개안면 조직을 사용하여 면역 염색에 의해 두개안면 형태 형성/병인 동안 단백질 수준을 검출하고 정량화하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 면역 염색을 위한 젊은 마우스에게서 decalcified 되지 않은 단단한 조직의 준비 그리고 저온 절제를 위한 방법을 기술합니다.

여기서는 단면 물질에 대한 단백질에 대한 면역 형광 검출을 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 항원 회수가 필요하지 않습니다. 우리는 변형되지 않은 단단한 조직을 포함하여 마우스 머리를 사용합니다.

이 기술의 주요 장점은 항원 회수 및 하드 조직의 탈화를 건너 뛰는 것입니다. 그 면역 염색 결과의 좋은 품질로 이어질. 이 방법은 또한 시간과 노동을 모두 절약합니다.

이 방법은 적절한 수정이 가능한 다른 조직에도 적용됩니다. 탈균되지 않은 조직에서 좋은 섹션을 만들려면 대상 조직을 더 해부하여 주변 조직을 다듬고 필요한 경우 냉동 보호 전에 2 일 동안 섭씨 4도에서 10 %EDTA로 샘플을 치료하십시오. 시각적 데모는 이 방법의 절차에 대한 상세하고 명확한 설명을 제공합니다.

우선, PBS가 포함된 10센티미터 및 3.5센티미터 요리 1개와 임신한 마우스 각각의 4%PFA 2밀리리터를 포함하는 12웰 배양 플레이트 1개를 PBS에 각각 양으로 준비하고 모두 얼음 위에 놓습니다. 임신 한 마우스에서 배아를 해부하려면, 집게와 안락사 마우스의 배의 중심 아래 피부를 잡아, 피부를 통해 잘라, 다음 부드럽게 기본 복근 벽에서 분리 피부를 당겨. 피부 절개의 동일한 라인을 따라, 복강으로 잘라.

배아의 문자열을 포함하는 자궁을 제거합니다. 그런 다음, 자궁 벽을 부드럽게 절단하여 배아를 제거하여 노른자 낭및 양막과 같은 외화 조직을 제거합니다. 각 배아로부터 머리를 자르고 분리하고, 집게가 각 머리를 4%의 PFA를 포함하는 12웰 플레이트의 분리된 우물로 옮기는다.

4시간 동안 섭씨 4도에서 배양하여 수정합니다. 12시간 동안 부드러운 흔들림으로 PBS에서 머리를 섭씨 4도에서 헹구는 다. 머리를 보호하려면 PBS에서 30 % 자당 2 밀리리터가 들어있는 새로운 12 웰 플레이트로 집게를 사용하여 전송하십시오.

머리가 접시의 바닥에 가라 앉을 때까지 섭씨 4도에서 부드러운 동요로 배양하십시오. 냉동 보호 헤드를 포함하려면 최적의 절삭 온도 화합물이 들어있는 금형으로 옮기고 몇 분 동안 평형합니다. 집게를 사용하여 샘플의 트리밍 측이 포함 금형의 바닥을 향하도록 샘플의 위치와 방향을 조정합니다.

그런 다음 금형을 드라이 아이스에 놓고 동결하고 냉동 절전을 준비할 때까지 비닐 봉지에 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 산후 조직의 경우, 안락사된 3개월에서 3개월까지의 마우스의 피부와 조직을 제거한 후 머리를 자르고 분리하고 하악을 제거합니다. 그런 다음, 배아 헤드와 같이 머리를 고정하고 냉동 보호합니다.

10월에 배아 헤드와 비슷한 방식으로 8%젤라틴을 포함하고, 극저온이 저온까지 영하 80도의 비닐봉지에 극저온을 보관합니다. 적절한 저온 온도를 설정합니다. 저온 온도에 평형하기 위해 약 30 분 동안 냉동 챔버에 샘플을 놓습니다.

Cryomold의 샘플로 블록을 제거하고 10월 드롭을 시편 척에 장착하여 동결하여 샘플의 트리밍 된 면을 척에서 가장 멀리 유지하고 작업자를 향하도록하십시오. 블록 장착 척을 극저스트 오브젝트 홀더에 로드합니다. 블레이드 홀더를 조정하여 블레이드 각도가 시료에 비해 3~5도되도록 합니다.

코팅 된 현미경 슬라이드에 10 마이크로 미터 섹션을 수집합니다. 완전히 건조 할 때까지 실온에서 섹션을 두고, 다음 영하 80도에서 저장합니다. 염색으로 시작하려면 영하 80도에서 슬라이드를 꺼내 실온에서 1 시간 동안 유지하여 섹션을 공기 건조시하십시오.

슬라이드를 0.1%PBST로 3회 3회 헹구어 각 5분간 10월을 씻어내고 섹션을 투과화합니다. 각 슬라이드에 블로킹 솔루션 200마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 헹구지 않고 차단 용액을 제거합니다.

각 슬라이드에 차단 용액에 희석 된 1 차 성 항체의 100 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 실온에서 각각 10분 동안 PBS로 슬라이드를 세 번 헹구십시오. 차단 용액에 희석된 이차 항체 100마이크로리터를 추가하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

실온에서 각각 10분 동안 PBS에서 세 번 헹구면 여전히 빛으로부터 보호됩니다. 슬라이드를 장착하려면 각 슬라이드에 DAPI가 있는 페이드 방지 매체 2방울을 추가하고 커버슬립으로 덮고 이미지준비될 때까지 섭씨 4도에 저장합니다. 대조군 배아의 정면 골격은 pSmad1/5/9, 다운스트림 BMP 신호인자 및 세포 증식 마커인 Ki67에 대해 양성이었습니다.

신경 문장 별에서, 구성적으로 활성화 된 BMPR1A 돌연변이 배아, 그러나, PSmad1/5/9 수준은 Ki67 수준이 감소하는 동안 증가했다. 더욱이, 더 많은 세포세포는 대조군 배아의 세포보다는 돌연변이 배아의 정면 뼈에서 관찰되었다. 젤라틴 임베디드 헤드의 관상 극저섹션은 비강 뼈와 비강 조직의 tdTomato 카세트에서 GFP 신호 및 RFP 신호를 명확하게 보여주며 젤라틴이 형광 신호를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다.

이러한 섹션이 SOX9 또는 Osterix 및 E11/Podoplanin에 대해 면역 염색되었을 때, 3주 간의 단단한 조직의 대부분에서 양질의 섹션을 얻을 수 있었습니다. 한편, 3개월 된 시료로, 대퇴골의 궤적 구획, 비강 조직, 두개골 등 일부 단단한 조직에서만 양질의 섹션을 얻을 수 있었는데, 여기에는 비강-프리맥스야 봉합사및 머리의 주변 뼈가 포함되었다. SOX9 양성 세포는 대퇴골과 비강 중격으로부터 성장판과 조인트의 연골세포에서 구체적으로 검출되었다.

3주 된 절개에서 SOX9는 중간엽 세포에서 검출되었습니다. Osterix와 E11 이중 염색 결과 Osterix는 골세포에서 검출된 것을 보여주고, E11은 대퇴골과 머리에서 뼈의 골다귀에서 검출되었습니다. 3 주 절개에서, Osterix는 오돈토 블라스트에서 긍정적이었다, E11여포 중간 엽 세포에서 긍정적이었다 동안.

4%의 PFA로 샘플을 과대수정하지 마십시오. 젤라틴에서 탈균화되지 않은 단단한 조직의 단면에 대 한, 최고의 온도 영하 25 섭씨 낮은. 이 절차에 따라, 형광의 수준은 우리의 프로토콜에 설명된 대로 정량화될 수 있습니다.

이러한 측정은 서로 다른 그룹 간의 단백질의 상대적 수준의 차이를 보여주기 위해 유익한 데이터를 제공합니다. 개발 후, 이 기술은 다른 단백질의 공동 발현 패턴을 얻기 위해 이중 또는 삼중 염색을위한 길을 열었습니다. 4% PFA는 위험합니다.

그것은 피부 알레르기, 심각한 눈 손상, 장기 손상, 또는 암을 일으킬 수 있습니다. 취급 후 개인 보호 장비를 사용하고 피부를 철저히 씻어 주세요.