Name: Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 배우세요 Astyanax mexicanus 배아에서 유전자 발현을 시각화하는 제자리 교잡법을 최소 배경 염색으로 단순화된 프로토콜로 수행하는 방법을 알아보세요. 이 기법은 발달생물학 연구에 재현성을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자가이 원고에 도움이 의견에 대 한 총 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 4 고 등 학생 들은 여름 인턴쉽 2017, 2018, 크리스틴 카오, 마이클 소장, 아키 리, 데이비드 은완코 등 동안이 프로토콜을 활용 하 길. HL은 UC 생물학 줄기 친목 2017의 여름 동안에 지원 됩니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457630 JBG에), 그리고 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIH;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 JBG에 DE025033)입니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학 신시내티 (프로토콜 #10-01-21-01)에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 고정
<ol><li>번 식 탱크에서 Astyanax mexicanus 배아의 원하는 번호를 분리 하 고 한 번에 ~ 50 배아를 수정. 태아는 크고 오래 된, 경우 25도 고정 되도록 한 번에 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>태아의 나이 따라 마 취의 IACUC 승인 방법을 이용 한다. 작동 신 시스템으로 이전 배아에 대 한 마 취 과다 통해 배아를 희생. 따라서 통증과 유기 체에 대 한 불편을 최소화 하기 위해 ~ 1 %tricaine (pH 7.4에 버퍼링)의 솔루션에 배아를 배치 합니다.</li>
	<li>배아, 터치 응답 하지 일단 대체 시스템 물 tricaine를 포함 하 고 ~ 1 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 1 추가 합니다.</li>
	<li>PBS 솔루션을 제거 하 고 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정 주의: PFA (즉, 그것은 가연성 이며 피부와 폐 자극) 유해 하, 주의 처리.</li>
</ol>2입니다. 탈수
<ol><li>배아, 탈수 통 솔루션을 제거 하 고 1 mL의 PBS로 씻어. 린스 하는 동안 플랫폼 통에 각도 (30 °와 45 °) 사이 포함 하는 태아 튜브를 놓습니다. 계속 씻어 두 번 배아 세척 당 5 분.</li>
	<li>배아는 chorion 아직도 가진다면 모든 50 배아는 100 x 25 mm 페 트리 접시에 놓고 조심 스럽게 시계의 겸 자 (예: #5 집게) 현미경의 2 세트를 사용 하 여 chorions에서 그들을 분리 합니다. 참고: 아래, 그리고 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 설명 하는 단계 동안 신중 하 게 제거 모든 액체 깨끗 한를 사용 하 여 이전 단계에서 다음 솔루션을 추가 하기 전에 유리 파스퇴르 펫</li>
	<li>메탄올 (MeOH) 아래에 설명 된의 점점 집중된 세척의 시리즈에 배아를 탈수. 희석 솔루션 각 4 mL 유리 유리병에가의 500 µ L 1 mL 전체 볼륨을 기반으로 합니다. 플랫폼 통에 상 온 (RT)에서 모든 탈수 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>조심 스럽게 PBS 솔루션 제거. 25 %MeOH 솔루션 (MeOH의 250 µ L) + PBS의 750 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.</li>
		<li>조심 스럽게 제거 25 %MeOH 솔루션. 50 %MeOH 솔루션 (MeOH의 500 µ L) + PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.</li>
		<li>조심 스럽게 제거 50 %MeOH 솔루션. 75 %MeOH 솔루션 (MeOH의 750 µ L) + PBS의 250 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분 동안 플랫폼 통에 흔들.</li>
		<li>조심 스럽게 제거 75 %MeOH 솔루션. 100 %MeOH 솔루션 (MeOH의 1 mL)을 추가 합니다. 부드럽게 5 분이 단계 3 번 반복에 대 한 플랫폼 통에 흔들.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이 시점에서,-20 ° C (장기)에 그들의 유리 튜브에 필요에 따라 탈수 배아를 저장 합니다. 또는 하루 1 프로토콜의 직접 진행 합니다.</li>
</ol>3. 주 1: 재
<ol><li>-20 ° C 냉장고에서 탈수 배아를 얻기 (또는 단계 2.5에서 직접 진행).</li>
	<li>배아는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 정렬 합니다. 하나에 따라 morphotype (즉, 동굴 및 표면)를 정렬할 수 있습니다 그리고 유전자의 수는 각 실험에서 평가. 한 번 정렬 유리병 당 일반적으로 더 이상 12 배아가 있다. 조직 유지, 병 및 각 유전자에 대 한 펫을 지정 하 컬러 랩 테이프를 사용 합니다. 배아는 전체 프로토콜을 통해 같은 유리병에 있을 것입니다. 참고: 장소 100%에서 파스퇴르 피 펫의 끝 사이 소독 EtOH를 사용 합니다.</li>
	<li>이후 단계에서 사용 될 70 ° C에 떨고 물 목욕을 설정 합니다. 정렬 된 배아의 튜브에 MeOH 밖으로 신중 하 게, 그리고 새로운 100%의 500 µ L를 바꿉니다 MeOH. 세척 짧게 (~ 1 분) 플랫폼 통에.</li>
	<li>플랫폼 통에 트윈 20 (PBT, 아래 참조)와 1 x PBS의 증가 농도에 배아 리하이드레이션 희석은 바탕 1 mL 최종 희석 볼륨 500 µ L 각 유리병에가.<ol>
<li>25 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 750 µ L의 250 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.</li>
		<li>조심 스럽게 제거 25 %PBT 솔루션. 50 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 500 µ L의 500 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.</li>
		<li>조심 스럽게 제거 50 %PBT 솔루션. 75 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 250 µ L의 750 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.</li>
		<li>조심 스럽게 제거 75 %PBT 솔루션. 100 %PBT 솔루션 (PBT의 1 mL)을 추가 합니다. 부드럽게 5 분이 단계 3 번 반복에 대 한 플랫폼 통에 흔들.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 주 1: 소화와 고정
<ol><li>PBT의 2 개 mL를 PK (20 mg/mL)의 1 µ L을 추가 하 여 가수분해 K (PK) 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>후속 단계의 기대에,-20 ° C 저장에서 교 잡 버퍼 (Hyb-및 Hyb +; 보완 파일 2 와 보조 파일 3참조)와 PFA의 냉동된 aliquots를 가져옵니다.<ol>
<li>PFA 실시간에서 해빙 하는 것을 허용합니다</li>
		<li>Hyb-및 Hyb +의 aliquots 회전 70 ° C의 물 욕조에 배치 합니다. 모든 시 약 및 작은 "개 스" 메쉬 바닥 부동 목욕 정수기 내부 내부 튜브를 배치 합니다. 간단한 추가 및 제거의 튜브와 튜브 회전 70 ° C 물 탕에서 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부드럽게 추가 배아 모든 조직 확보의 vial(s)에 PK 솔루션 솔루션으로 완전히 덮여 있다. 태아 ~ 12 분 PK 작업 솔루션 플랫폼 셰이 커에 대 한 다이제스트. 참고: 소화의 길이 최적의 결과 보장 하기 위해 수 사관에 의해 변화 될 수 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 PK 솔루션에서 그리고 모든 나머지 PK. 희석 PBT와 유리병을 간단히 홍수</li>
	<li>PBT 솔루션에서 그리고 새로운 PBT의 500 µ L를 바꿉니다. 5 분에 대 한 플랫폼 셰이 커에 린스에 솔루션을 수 있습니다.</li>
	<li>PBT에서 그리고 해 동된 4%의 500 µ L를 바꿉니다 PFA. 실시간에서 플랫폼 통에 20 분 동안 품 어 배아 있도록</li>
	<li>4% 그리기 PFA, 짧게 어떤 나머지 PFA 희석 PBT와 유리병을 홍수. PBT, 떨어져 그리고 신선한 PBT의 500 µ L를 바꿉니다. 배아 플랫폼 통에 5 분 동안 린스를 허용 합니다. 이 단계 4 번 더 반복 합니다.</li>
</ol>5. 주 1: Prehybridization
<ol><li>유리병으로 미리 데워 Hyb 솔루션의 장소 500 µ L. 신중 하 게는 70 ° C 물 (가스 켓) 내부 목욕 없이 5 분 동안 흔들어에 유리병을 배치 합니다.</li>
	<li>Hyb 솔루션에서 그리고 미리 데워 Hyb + 솔루션의 500 µ L로 유리병을 홍수. 다시 흔들어 (40 rpm)와 70 ° C 물 목욕으로 유리병을 놓습니다. 어느 4 h incubate 나 밤새. 참고: 4 h 인큐베이션 총에서 4 일 동안 지속 될 것 이다 완전 한 현장에서 프로토콜을 얻을 것입니다. 여기,이 단계는 총에서 5 일 지속 되는 프로토콜을 보장할 하룻밤 부 화도 제공 됩니다.</li>
</ol>6. 주 2: 교 잡
<ol><li>5 분 동안 흔들어 뜨거운 물 목욕으로-20 ° C 냉동 고에서의 Hyb + 약 수를 놓습니다.</li>
	<li>유리병에서 떨어져 Hyb + 그리고 미리 데워 Hyb + 500 µ L를 바꿉니다. 이 솔루션을 신중 하 게 각 유리병에 RNA 프로브 2 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 프로브 분배 되도록 유리병을 소용돌이 친다.</li>
	<li>40 rpm에서 떨고 있는 동안 70 ° C 온수 목욕에서 Hyb + (추가 조사)와 솔루션 밤새 품 어. 참고: 하나 다시 Hyb + (프로브) 솔루션을 사용할 수 있습니다. 이 위해 걸릴 Hyb + 프로브 처음부터 실행-20 ° C 냉동 고에서 장소 5 분 바꾸기 Hyb + 1 일에서에 대 한 뜨거운 물 목욕에 프로브 Hyb + 프로토콜 고 뜨거운 물 목욕에서 하룻밤 배양.</li>
</ol>7. 주 3: 솔루션 준비
<ol><li>Microcentrifuge 튜브 "유전자의 관심" RNA 프로브 Hyb + 표시를 준비 합니다. 3 일 동안 사용할 수 있는 희석의 시리즈를 준비 합니다.<ol>
<li>Hyb-및 염 분 나트륨 시트르산 (SSC, 0 ~ 100%)의 희석의 다음 시리즈를 준비 6 별도 튜브를 사용 하 여, 1 mL 볼륨, 그리고 장소에서 떨고 70 ° C에 물 목욕: 1 = 100% 튜브 Hyb-(1 mL의 Hyb-): 2 = 25% 튜브 2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L); 3 = 50 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-500 µ L의 500 µ L); 4 = 75 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-250 µ L의 750 µ L); 튜브 5 = 100 %2 배 SSC (2 x SSC의 1 mL); 6 = 100 %0.2 x SSC (0.2 x SSC의 2 개 mL) 튜브. 참고: 심하지 SSC의 농도의 0.2 2 x에서 변경 x.</li>
		<li>튜브를 분리 1 mL 볼륨에 PBT와 SSC의 희석의 다음 시리즈를 준비 하 고 RT에 4를 사용 하 여: 1 = 25% 튜브 PBT (PBT, 0.2의 750 µ L의 250 µ L x SSC); 2 = 50 %PBT 튜브 (PBT, 0.2 x SSC의 500 µ L의 500 µ L); 3 = 75 %PBT 튜브 (PBT, 0.2 x SSC의 250 µ L의 750 µ L); 4 = 100 %PBT (PBT의 1 mL) 튜브.</li>
		<li>포함 된 트윈 20 (MABT) 작업 솔루션 maleic 산 버퍼의 2 mL 튜브를 준비 합니다.</li>
		<li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브 차단 솔루션의 준비. 각 관에서 MABT의 10 mL를의 차단 시 약 0.2 g을 추가 ( 추가 파일 4참조). (최대 3 h) 솔루션에 완전히 녹아 때까지 nutating 믹서 (또는 플랫폼 통)에 모두 관을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 주 3: 조사 제거
<ol><li>유리 피 펫 파스퇴르 Hyb + (프로브) 솔루션에서 그립니다 고 그것은 살 균, microcentrifuge 튜브를 표시 합니다. (프로브 라벨 성공 하면) 나중에 사용-20 ° C 냉동 실에이 관을 유지 합니다.</li>
	<li>신중 하 게는 따뜻한 SSC/Hyb-희석 (아래 표시)의 500 µ L를 추가 합니다. 각 70 ° C 떨고 물 탕에서 10 분 다음 솔루션의 각에서 품 어.<ol>
<li>100% 순차적으로 품 어 Hyb-Hyb-(1 mL), 25 %2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L), 50 %2 x SSC (500 µ L 2의 x SSC의 Hyb-500 µ L), 75 %2 x SSC (750 µ L 2의 x SSC, 250 µ L의 Hyb-), 100 %2 x SSC (2의 1 mL x SSC) 100 %0.2 x SSC (0.2의 2 mL x SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>마지막 단계, 10 분에 대 한 다음 솔루션의 각에서 품 어. 다음 외피의 모든 플랫폼 셰이 커에 RT에서 열릴: 25 %PBT (PBT, 0.2의 750 µ L의 250 µ L x SSC), 50 %PBT (PBT, 0.2의 500 µ L의 500 µ L x SSC), 75 %PBT (PBT, 0.2의 250 µ L의 750 µ L x SSC) 100 %PBT (PBT의 1 mL).</li>
	<li>10 분 부 화 후 100% 제거 PBT, 각 유리병에 MABT의 500 µ L을 추가 하 고. 5 분 동안 두 번이 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>9. 주 3: 차단
<ol><li>각 유리병 및 튜브 (준비 단계 7.1.4에서에서) 중 하나에서 premixed 차단 솔루션 홍수에서 MABT를 제거 합니다. 실시간에서 ~ 4 h nutating 믹서에 장소 유리병</li>
	<li>2 추가 안티 DIG AP 팹의 µ L 10 mL 차단 솔루션 (준비 단계 7.1.4에서에서) 그리고 짧게 소용돌이의 두 번째 약 병을 조각.</li>
	<li>채워 각 유리병 거의 완전히 차단 솔루션 (~ 5 mL)와 4 ° c.에 냉장고에 하룻밤 nutating 믹서에</li>
</ol>10. 주 4: MABT 린스
<ol><li>MABT에 10% 정상 염소 혈 청 (NGS)의 재고 유리병을 준비 (900 µ L MABT의 NGS의 100 µ L 추가).</li>
	<li>각 유리병에 차단 솔루션에서 그리고 각 유리병에 500 µ L NGS/MABT 혼합물의 추가. 플랫폼 셰이 커에 RT에 25 분 동안 품 어 배아를 허용 합니다.</li>
	<li>100%의 500 µ L NGS/MABT 혼합물 바꿉니다 MABT. 플랫폼 셰이 커에 RT에서 30 분 동안 품 어. 이 린스 11 번 이상 하루 30 분 마다 수행 합니다.</li>
	<li>100 %MABT와 4 ° c.에 냉장고 또는 대형 챔버에 하룻밤 nutating 믹서에 유리병을 채우기</li>
</ol>11. 주 5: 프로브 시각화
<ol><li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 버퍼의 약 50 mL 수 준비 ( 보충 파일 5참조). 50 mL 원뿔 튜브 빛 노출을 제한에 알루미늄 호 일에 싸여 다음 결합: 1 M Tris (pH 9.5), 50 mM MgCl2, 1%의 5 mL의 5 mL의 5 mL 트윈 20, 1 M NaCl, ddH2O의 30 mL의 5 mL.</li>
	<li>MABT를 제거 하 고 AP 버퍼 (호 일에 싸여 튜브) 1 mL를 바꿉니다. 5 분 동안 씻어 보자. MABT의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 두 번 이렇게.</li>
	<li>AP 버퍼를 제거 하 고 AP 버퍼 3.5 μ 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) 및 4.5의 1 mL를 바꿉니다 니트로 블루 tetrazolium (NBT)의 μ. 매 시간 마다 반응까지 완료 되 면 갓된 AP 버퍼/NBT/BCIP로 바꿉니다. 매 15 분, 채색 반응 얼룩의 원하는 수준을 달성 때까지 자리를 차지할 수 있도록 검사, 밀접 하 게 모니터링 합니다. 침전 양식 하기 시작, 빨리 솔루션을 교체 합니다.</li>
	<li>들러 채색 반응 (NBT/BCIP) 없이 신선한 100 %AP 버퍼에 배아를 rinsing PBT에서 5 분 계속 린스에 대 한 신호 (배경 얼룩의 최소 금액)와 최적의 수준을 달성 하는 때까지. 린스 표본 같습니다 AP 버퍼에 PBT의 희석을 증가 함께 계속: 25 %PBT (PBT, AP 버퍼의 750 μ의 250 μ), 린스 5 분; 50 %PBT (PBT, AP 버퍼의 500 μ의 500 μ), 린스 5 분; 75 %PBT (PBT, AP 버퍼의 250 μ의 750 μ), 5 분 동안 씻어.</li>
	<li>PBT nutating 믹서 최소 배경 얼룩이 지 원하는 때까지에 도달 하는 100%의 ~ 5 mL에 배아를 씻어. 스위치 밖으로 신선한 PBT 여러 번. 이것은 몇 일 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>때 플랫폼 통에 살 균 PBS의 500 μ에 완료, 세척 배아 rinsing. 5 분 동안 두 번이 린스를 수행 합니다. PBS 세척 후 4%의 500 μ에는 표본에 수정 후 PFA 플랫폼 통에 RT에 1 시간에 대 한. 4%의 1 mL에서 하룻밤 수정 또는, 4 ° c.에 냉장고에는 PFA</li>
	<li>신선한, 함께 정착 액을 대체 살 균 PBS. 수행이 린스 5 분 장소에 적어도 두 번 배아 100% 살 균 PBS의 ~ 4 ml에서와 4 ° c.에 긴 기간 저장</li>
</ol>12입니다. 영상
<ol><li>3 %agarose 및 태 버퍼를 사용 하 여 페 트리 접시에 이미징 접시를 확인 합니다. 참고: 수량 얼마나 많은 접시는 필요에 따라 달라 집니다. 접시 여러 번 다시 사용할 수 있습니다. 젤 접시에 배아를 포함 하는 우울증을 만들려면 냉각 하는 동안 얕은 직사각형 형 페 트리 접시에 배치 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>배아는 PBS에서 접시에 놓습니다. 참고:이 부드럽게 그들을 밖으로 그들은 플라스틱 펫의 내부에 붙어 것입니다 발견 되었습니다 때문에 pipetting 대신 접시에 배아를 부 어 좋습니다.</li>
	<li>가벼운 현미경 검사 법 사용 하 여 각 배아를 시각화. 무딘 프로브를 사용 하 여 원하는 위치로 배아를 책략.</li>
	<li>태아는 원하는 위치에 이미지를 가져가 라. 참고 완료 얼룩 얼룩의 잠재적인 저하를 방지 하는 몇 주 이내 태아의 이미지를가지고 하는 것이 중요 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%3A+Application+to+neurobiology%22">In situ hybridization: Application to neurobiology</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1987).</li>
<li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cranial+patterning+in+the+direct%E2%80%90developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li>
<li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li>
<li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).</li>
<li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1-chemokine%2C+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2C+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li>
<li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+%28Adcyap1%29+and+its+receptor+subtypes+%28Adcyap1r1%2C+Adcyap1r2%2C+and+Adcyap1r3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li>
<li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li>
<li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).</li>
<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

저하로 RNA의 취약점 때문 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 RNA 조사 살 균 합성을 염려 한다. 그러나, 경우는 조사 신중 하 게 생성 되 고 좋은 결과 제공 합니다, 그것은 이후의 착 반응에 활용할 수 있습니다. 두 번째 중요 한 단계는 프로토콜에서 사용 하는 모든 시 약의 주의 생산 이다. 이 프로토콜 포함 하므로 몇 일 및 많은 작은 단계, 그것은 필수적인 모든 시 약은 정확 하 게, 생산과 살 균 방식에서으로 저장. 또한, 그것은 근본적으로 중요 한 탐정 프로토콜에서 각 단계의 주의 트랙을 유지입니다. 우리는 단계 제공 된 검사 목록을 매우 정확 하 고 정확한 준공이이 프로토콜의 각 부분을 확보에 유용할 수 있습니다 나타났습니다.
우리는 종종 우리가 여기에 제시 된 프로토콜을 수정 하지 마십시오. 그러나, 조사자는 제안 하는 것 보다 서로 다른 온도에서 프로브 외피를 수행할 수 있습니다 (즉, 70 ° C). 교 잡 온도에서 약간의 변화는 RNA 프로브, 바인...

제자리 교 잡 착 고정된 조직 유전자 표현 패턴1을 시각화 하는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 다양 한 생물 학적 연구에 대 한 다른 전통적인2 및 비 전통적인3 모델 시스템에서 년간 수행 되었습니다. 그러나, 여러 단계 및 시 약은이 절차를 성공적으로 수행 하는 데 필요한. 결코이 방법을 수행한 조사 과정을 시작 될 수 있습니다 많은 단계 때문에 협박. 또한,이 절차의 긴 자연에 빌려준다 기술적인 오류를 해결 하기 어려울 수 있습니다.
이 글의 전반적인 목표는이 교 잡 기술은 다양 한 연령층에 접근할 수 렌더링 하는 간단 하 고 간단한 방법을 제시. 오류에 대 한 소개를 줄이기 위해, 선물이 고품질 유전자 식 얼룩 및 일반적인 배경 신호를 최소화 하는 간단한 접근. 이 절차는 다른 접근 Danio rerio4와 같은 전통적인 모델 시스템에서 개발 유사 합니다. 여기, 우리는 프로토콜의 주의 구현할 다운로드 점검 (보충 파일 1)를 사용 하 여 각 단계의 주의 구현 촉진을 목표로 합니다. 이 일에 대 한 근거가이 절차에 관련 된 여러 단계를 통해 조직 촉진 것입니다. 이 문서 전체 마운트 제자리 교 잡 배아 개발 수행에 관심이 있는 연구자에 적합 하지만 아직 절차 수행 하지. Astyanax 연구에 대 한 선택된 방법의 장점은 것 그것이 테스트 되 고 cavefish에 따라서 비교 식 분석을 촉진 하는 표면 물고기 변경해 입증. Astyanax 및 다른 시스템에 대 한 연구에서 연구자에 의해 제시 메서드를 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 여과 장치</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 여과 장치</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔</td>형 <td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500mL 여과 장치</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>안티-디곡시제닌-AP, 팹 단편</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1g</td></tr><tr><td>차단 용액</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50g</td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>DIG RNA 라벨링 키트(SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>유리 드람 바이알</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 Dr</td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500mL</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘-결정질</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>말레산</td><td>시그마</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>분자 등급 물(RNase-free)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3kg</td></tr><tr><td>NaOH 펠릿</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>NBT 기질 분말</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1g</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>너트 믹서</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>158127-500g</td><td>500g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K(200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10mL</td></tr><tr><td>플라스틱 피펫</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250mL</td></tr><tr><td>쉐이킹 수조 12L</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12L</td></tr><tr><td>표준 아날로그 쉐이커</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500g</td></tr><tr><td>tRNA 효모</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25mg</td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P9416-50mL</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>염화리튬(LiCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>203637-10G</td><td>10g</td></tr></tbody></table>

wholemount astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

최근 몇 년 동안에서 맹인 멕시코 cavefish (Astyanax mexicanus)에 대 한 초안 게놈이 나왔다, 유전자의 수천의 시퀀스 id를 공개. 이 신흥 모델 시스템에 대 한 사전 연구는 다양 한 동굴 관련 고기와 관련 된 수많은 양적 특성 loci (QTL) 식별 포괄적인 게놈 넓은 조사에 대문자. 그러나, phenotypic 변화에 대 한 상속 기초에 관심사의 유전자를 연결할 수는 중요 한 도전 남아 있습니다. Troglomorphic 진화에서 개발의 역할의 더 깊은 이해를 촉진 수 있는 하나의 기술은 전체 마운트 제자리 교 잡 이다. 이 기술은 직접 동굴 및 표면 주거 형태 사이의 유전자 발현을 비교, 지명 후보 유전자 설립된 QTL 기본, 다음-세대 시퀀싱 연구에서 유전자 식별 또는 다른 개발을 구현할 수 있다 검색 기반 접근입니다. 이 보고서에서 우리는 널리 제시 연구 시스템을 넘어 잘 사용 하기 위해 적용할 수 있는 유연한 검사 목록에서 지 원하는 간단한 프로토콜을 제시. 그것은 기대 Astyanax 지역 사회를 넘어이 프로토콜 광범위 한 자원으로 사용할 수 있습니다.

이 보고서에서 우리는 높은-품질 유전자 표정 분석에 대 한 미 발달 Astyanax 표본의 라벨 수행 하는 단순 하 고 간단 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 4 개 또는 5 일에 실시 될 수 있습니다 하 고 절차의 각 주요 단계 색된 순서도 (그림 1)에 표시 됩니다. 완료 되 면, 얼룩진된 배아 관심사의 특정 유전자를 표현 하는 조직에서 어두운 자주색 반음계 레이블을 항구 합니다. 우리는 성공적으로 Pachón cavefish (그림 2A-B, E)에 표면 물고기 (그림 2C-D, F) 배아가이 프로토콜을 실행 했다.
<p class="jove_content" f...

이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

당사의 시투 프로토콜은 최소한의 배경 염색으로 유전자 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술을 사용하면 복잡하고 긴 프로토콜을 비교적 쉽게 수행할 수 있습니다. Benchtop은 제공된 제안 및 체크리스트를 설정하여 이 프로토콜을 올바르게 수행하고 재현하기가 더욱 쉬워졌습니다.여기에 표시된 기술은 Astyanax 멕시코인에 만연하지만 프로토콜을 조금씩 조정하는 비교적 크기의 개인의 다른 시스템에 적응 할 수 있습니다. 첫째, 각 유전자에 대한 바이알과 파이펫을 지정하기 위해 컬러 실험실 테이프를 사용합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 배아를 정렬합니다.일반적으로 바이알 당 12 배아, 한 번 정렬 되지 않습니다. 다음으로 흔들리는 수조를 섭씨 70도까지 설정합니다. 정렬된 배아의 바이알에 메탄올을 조심스럽게 꺼내 신선한 100% 메탄올 500 마이크로리터로 대체하십시오.플랫폼 셰이커에서 약 1분 동안 배아를 잠깐 씻으시다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플랫폼 셰이커에 Tween 20을 가진 1x PBS의 증가 된 농도에서 배아를 재수화하십시오. 먼저 메쉬 바닥이 있는 작은 개스킷을 섭씨 70도까지 예열된 회전수 욕조에 놓습니다.혼성화 버퍼 마이너스 및 혼성화 버퍼의 알리쿼트와 개스킷에 넣습니다. 모든 조직이 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하는 배아 의 바이알에 준비된 PK 솔루션을 부드럽게 추가합니다. 바이알을 플랫폼 셰이커로 옮기고 단백질Ae K 작업 용액에서 약 12분 동안 소화하게 하십시오.그 후 PK 용액을 부드럽게 뽑아 내고 PBT로 바이알을 잠깐 범람하여 나머지 PK를 희석시합니다. PBT 솔루션을 500마이크로리터의 신선한 PBT로 교체하고 5분 동안 플랫폼 셰이커에 용액이 헹구도록 합니다. 그런 다음 PBT 솔루션을 해동 된 4 % PFA의 500 마이크로 리터로 대체하십시오. 배아가 실온에서 플랫폼 셰이커에 20분 동안 배아를 배양하게 하십시오.사전 혼성화를 시작하려면, 배아 함유 바이알에 미리 따뜻해지는 혼성화 완충액 마이너스 용액의 500마이크로리터를 추가한다. 조심스럽게 5 분 동안 흔들리지 않고 70섭씨에 수조에 개스킷에 바이알을 배치합니다. 다음으로 혼성화 버퍼 마이너스 솔루션을 빼고 500 마이크로리터의 미리 웜된 혼성화 버퍼 플러스 솔루션으로 바이알을 범람시합니다.바이알을 수조의 개스킷에 다시 넣고 4시간 또는 하룻밤 동안 흔들어 서배양합니다. 혼성화를 시작하려면 하이브리드화 버퍼를 바이알에서 빼내고 500마이크로리터의 신선한 미리 따뜻힌 혼성화 버퍼 플러스로 바꿉니다. 각 유리병에 RNA 프로브의 마이크로리터 2개를 조심스럽게 추가하고 부드럽게 소용돌이어 프로브의 분포를 보장합니다.40 RPM에서 흔들면서 하룻밤 사이에 70도의 수조에서 배양하십시오. 시작하려면, 마이크로 원심 분리구를 텍스트 프로토콜에 설명한 대로 관심 RNA 프로브의 유전자와 플러스 혼성화 버퍼로 라벨을 붙인 마이크로 원심 분리관을 준비한다. 두 개의 15 밀리 리터 원콘 튜브를 설정하고 차단 시약의 0.2 그램과 MABT의 10 밀리리터를 추가합니다.시약이 용액에 완전히 용해 될 때까지 두 튜브를 누두 믹서에 놓습니다. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 혼성화 버퍼 플러스 및 프로브 용액을 빼내고 멸균 라벨이 부착된 미세 센심분리기 튜브에 넣습니다. 이 튜브를 냉동실에 보관하여 영하 20도의 냉동고에 보관하여 향후 사용시 사용합니다.조심스럽게 디플루언스를 뺀 희석제의 따뜻한 식염수 나트륨 및 혼성화 버퍼의 500 마이크로리터를 추가합니다. 흔들리는 수조에서 각각 10분 동안 순차적인 솔루션을 인큐베이션한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플랫폼 셰이커의 실온에서 배양합니다. 마지막 인큐베이션 후 각 바이알에서 100% PBT를 MABT의 500 마이크로리터로 교체하십시오.이 과정을 각각 5분 동안 두 번 반복합니다. 먼저 각 유리병에서 MABT를 제거하고 15밀리리터 원뿔형 튜브 중 하나에서 미리 혼합된 차단 용액으로 범람하십시오. 양유리를 양수 믹서에 4시간 동안 실온에서 놓습니다.준비된 차단 용액의 두 번째 튜브에 항체 조각의 마이크로리터 2개를 추가하고 잠시 소용돌이를 냅니다. 그런 다음 각 유리병을 블로킹 용액으로 거의 완전히 채우고 섭씨 4도의 냉장고에 하룻밤 동안 누두믹서에 놓습니다. 시작하려면 MABT에서 10 % NGS의 주식 바이알을 준비하십시오.각 유리병의 차단 솔루션을 이 NGS 솔루션의 500 마이크로리터로 교체합니다. 플랫폼 셰이커의 실온에서 25분 동안 배양합니다. 그 후 NGS 혼합물을 100%MABT의 500 마이크로리터로 교체하십시오.실온에서 플랫폼 셰이커를 30분 동안 배양합니다. 이 헹구는 것을 하루 종일 11 번, 30 분마다 반복하십시오. 그런 다음 각 유리병을 100 % MABT로 채우고 섭씨 4도의 냉장고에 하룻밤 동안 누두믹서에 놓습니다.먼저 각 유리병의 MABT를 AP 버퍼 1밀리리터로 교체하고 5분간 세척합니다. 이 세척을 두 번 반복하여 MABT를 완전히 제거하십시오. 그런 다음 AP 버퍼를 BCIP 3.5 마이크로리터와 MBT의 4.5 마이크로리터를 포함하는 신선한 AP 버퍼 1밀리리터로 교체합니다.반응이 완료될 때까지 매시간 BCIP 및 MBT를 포함하는 AP 버퍼의 신선한 혼합물로 교체하여 반응을 면밀히 모니터링하고 원하는 수준의 염색이 이루어질 때까지 15분마다 확인하십시오. 프로토콜에 설명된 바와 같이 AP 버퍼에서 1X PBT의 농도가 증가함에 따라 배아를 헹구어 착색 반응을 중단한다. 원하는 최소 배경 염색에 도달할 때까지 영양가 믹서에 100% PBT의 약 5밀리리터에서 배아를 헹구는다.헹구는 것이 완료되면 플랫폼 셰이커에 멸균 PBS 500 마이크로리터로 배아를 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표본을 후지합니다. 배아를 헹구고 100% 멸균 PBS의 4밀리리터에 배치하고 필요한 경우 섭씨 4도에서 장기 보관하십시오. 이 연구에서 배아 Astyanax 표본은 고품질 유전자 발현 분석을 위해 표지됩니다.이 과정은 파촌 동굴물고기와 표면 물고기 배아 모두에서 성공적으로 구현되었습니다. Sox9 발현에 표지된 Cavefish 배아는 개발 된 분기 아치와 가슴 지느러미에서 명확한 라벨을 보여줍니다. 노른자 낭이나 측면의 개발 중인 솜트에는 얼룩이 거의 없습니다.유사하게, Tfap2a 발현은 배아의 등쪽 측면 영역을 따라 조기 이주 신경 문장 세포로서 개발 헤드의 부분에서 분명하다. 동굴 배아인 Phf20a를 위해 제시된 세 번째 유전자는 뼈 조직을 야기할 운명인 체세포 중구및 후방 머리의 부분에서 보입니다. CXCR에 표지된 표면 물고기 배아는 머리와 측면의 고립된 부위뿐만 아니라 노른자 낭을 덮치는 몇몇 개별 세포에서 양성 라벨을 표시합니다.유전자 Adcyap1a는 뇌하수체 세포를 포함하는 중추 신경계의 영역에서 발현된다. 배아의 등쪽 양상에 있는 세포의 쌍쌍 양측 클러스터에 있는 높게 특정한 발현, 뿐만 아니라 중간선 발현의 더 큰 지구에 주의하십시오. 동굴 배아를 위해 검토된 마지막 유전자인 Sox10은 등쪽 배아의 왼쪽과 오른쪽에 있는 신경 문장의 초기 마커로서 분명합니다.시투에서 완료 한 후, 우리는 일반적으로 가벼운 현미경 을 사용하여 결과를 이미지. 염색의 저하를 피하기 위해 완료 후 2 주 이내에이 작업을 수행하는 것이 가장 좋습니다.

wholemount-in-situ-hybridization-for-astyanax-embryos

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

이 동영상은 모든 마운트 immunohistochemistry, 항원의 공간 및 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 태아의 시각 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다.

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

Xenopus laevis 배아는 크기가 크고 조작이 용이하기 때문에 초기 발달 연구에 매우 유용합니다.   이 모델 시스템에서 특정 장기를 식별하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 in situ hybridization 프로토콜에 대한 단순화된 프로토콜이 제공됩니다.

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

노드 및 notochordal 플레이트는 일시적 이며, 여러 가지 기술을 사용 하 여 시각 될 수 있는 마우스 배아 개발 주최 신호 여기, 우리가 자세히 설명 두 그들의 구조 및 morphogenesis 연구 기법을 수행 하는 방법: 1) 스캐닝 전자 현미경 (SEM); 그리고 2) 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

여기서 제시된 것은 혈관 형성에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포에서 제브라피쉬 및 튜브 형성 분석에서 의 제브라피시 및 튜브 형성 분석에서 전체 마운트에 대한 프로토콜이다.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

배우세요 Astyanax mexicanus 배아에서 유전자 발현을 시각화하는 제자리 교잡법을 최소 배경 염색으로 단순화된 프로토콜로 수행하는 방법을 알아보세요. 이 기법은 발달생물학 연구에 재현성을 제공합니다.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

더 많은 동영상 탐색