Name: Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 Agrobacterium tumefaciens와 Agrobacterium rhizogenes를 이용한 감자 유전자 변환 기법을 GUS 염색으로 프로모터 활성을 평가하는 방법입니다. 이 프로토콜은 뿌리 생리학 연구에 활용됩니다.

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이 작품 정부의 드 Innovación y 많은 (AGL2009-13745, PB FPI 부여), 정부의 드 Economía y Competitividad 페더 (AGL2012-36725, AGL2015-67495-c 2-1-R), 자금 및 지로 나의 대학 (박사 학위 부여 SF, 그랜트를 지원 했다 SING11/1). A. rhizogenes , A. tumefaciens 긴장을 제공 하는 저자는 박사 디트로이트 Broer (토지 이용, 대학 로스 토크, 로스 토크, 독일 연구소) 및 박사 Salomé 프라 트 (센트로 나시오날 드 Biotecnología, 마드리드, 스페인)에 게 감사 각각, 및 박사 Marçal 순간 및 도움말 및 A. rhizogenes 변환 실험 시작에서 받은 지원에 대 한 박사 안 나 플 라 센 시아 (툴루즈 III 폴 Sabatier 대학-CNRS, 식물 연구 실험실 (LRSV), Castanet 돌 루 잔, 프랑스)입니다. 저자는 실험실 작업을 수행 하 고 돌보는 식물, Ferran Fontdecaba 및 지원 칼라 산체스의 일부 실험 하 고 있던 동안에 그녀의 귀중 한 도움에 감사 사라 고메스 (Departament de Biologia, UdG, 지로 나) 그들의 최종 학위 프로젝트입니다.

A. rhizogenes 변환 프로토콜 적응 되었고 경적 외.7 에서 수정 되었고 유전자 테스트 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레). A. tumefaciens 변환 프로토콜은 적응 배너 외.22 에서 수정 하 고 테스트 genotypes 했다 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레) 및 미 tuberosum ssp. andigena. 두 절차의 주요 단계는 각각 그림 1과 그림 2에요약 됩니다.
참고: 전송 생체 외에서 수행 하는 절차의 모든 단계에서, 그렇게 하 고 가능한 경우, 접시 또는 냄비, 식물 시 들고 및 오염 방지 하기 위해 공기 노출 최소화를 유지 합니다. 모든 공장 외피 캐비닛의 어두운 20 ° C와 67 µmol m-1의 -1의 24 ° C 빛/12 h 12 h의 조건에서 수행 되었다. 층 류 후드에서 무 균 조건에서 모든 박테리아 조작 및 체 외에서 공장 전송을 수행 합니다. Agrobacterium 그리고 생체 외에서 공장 문화에 대 한 모든 미디어 조리법 테이블 s 1에 제공 됩니다.
주의: 모든 유전자 변형된 박테리아와 식물 충당된 폐기물 컨테이너에 입금.
1. Agrobacterium 문화 변화에 대 한 사용
참고: A. rhizogenes 변환에 사용 되는 변형 했다 (친절 하 게 박사 디트로이트 Broer에서 제공) C58C1:Pri15837 그리고 A. tumefaciens 에 대 한 그 (친절 하 게 박사 Salomé 프라 트에 의해 제공 되는) GV2260. A. rhizogenes PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-지난 신사에서 식물 시스템 생물학 학과; http://gateway.psb.ugent.be) T-DNA 변환 마커를 들고 털이 루트를 모니터링을 포함 하는 바이너리 벡터와 변형 되었다 형성입니다. A. rhizogenes , A. tumefaciens에 의해 생성 된 변형 된 뿌리 비교를 둘 다 들고 운전 β-glucoronidase (거 스) 취재 원 유전자 FHT 발기인 T-DNA를 포함 하는 이진 벡터 pKGWFS7로 변형 되었다 그리고 선택 가능한 마커15대 저항 유전자.
<ol><li>Agrobacterium 의 식민지를 선택 하 고 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 50 mL 원심 분리기 튜브에서 항생제 (테이블 S1)로 보충 하는 YEB 매체의 5 mL에서 하룻밤 (O/N) 그것을 성장.</li>
	<li>A. tumefaciens 변환에 대 한 OD600 는 광학 밀도 측정 = 0.6-1.0.<ol>
<li>광학 밀도 높은 경우 확인 OD600 낮추는 subculture 문화 OD600 에 도달할 때까지 신선한 미디어와 대기 0.3 = 0.6-1 =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 벤치 가기 원심 분리기에서 3000 x g 에서 Agrobacterium 문화 1 mL 원심</li>
	<li>Pipetting, 여는 상쾌한을 제거 하 고 항생제 없이 신선한 YEB 매체의 1 mL에 셀 resuspend. 항생제의 완전 한 제거를 보장 하기 위해이 단계를 반복 합니다.<ol>
<li>A. tumefaciens 변환에 대 한 마지막 물의 resuspension 추가 OD600 의 최종 광학 밀도 얻기 위해 적절 한 YEB 볼륨 0.8 =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염 된 것으로 식물을 준비 하는 동안 얼음에 셀을 계속.</li>
</ol>2. 식물 재료 변환에 대 한
<ol><li>하나 또는 두 개의 노드 줄기 절단 중 하나는 꼭대기 또는 멸 균 시험관에 감자 식물 (기증자 식물);에서 보조 새싹을 포함 하 게 (그림 1A 및 그림 2A) 3 ~ 4 주 동안 그들을 냄비에 단단한 2MS 매체에 성장.</li>
</ol>3. A. rhizogenes (그림 1)를 사용 하 여 변환 설치
참고:이 절차는 털이 변형 된 뿌리의 취득 수 있습니다. Transgene 식 평가, 부정적인 컨트롤 필요 하다. 부정적인 제어를 준비 하려면 키 또는 변환 마커 유전자를 포함 하는 빈 벡터와 변형 A. rhizogenes 긴장을 사용 하 여 절차를 따릅니다.
<ol><li>사용 신선한 미디어 판; 또는, 판 보관할 수 있습니다, 뚜껑 쪽으로 4 ° C에서 미디어 탈수를 피하기 위해 투명 필름으로 단단히 밀봉. 광장 미디어 접시를 준비 하려면 그들에 경사 ~ 15 °, ms, 40 mL로 채우기와 응고 하자. 이 매체를 가진 식물의 공중 부분의 접촉을 최소화 합니다.</li>
	<li>매우 신중 하 게 기증자 공장에서에서 전송 2MS 매체 120 x 120 mm 사각 접시.</li>
	<li>A. rhizogenes 문화 수술 바늘을 사용 하 여 한 줄기 위치인 3 μ에 주사 하십시오 하 고 가능 하면 다른 internodes 공장 당 두 번 반복 합니다. 참고: 독립 변환 이벤트 (그림 1B)로 각 주입을 고려 하십시오.</li>
	<li>전송 즉시 전체 공장 사각형 접시에 0.1 m m acetosyringone와 함께 보충 하는 단단한 MS 매체. 접시 당 2 식물을 수용 합니다. 참고: 1 M acetosyringone 재고 솔루션 DMSO에 준비 하 고-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>외과 테이프를 사용 하 여 접시를 봉인 하 고 4 일 동안 성장 캐비닛 안에 그것을 수직으로 정렬.</li>
	<li>A. rhizogenes를 죽 일 cefotaxime 나트륨 [500 µ g/mL] 보충 하는 MS 매체와 새로운 사각형 접시에 공장을 전송.</li>
	<li>10 월 12 일, 후 털 뿌리 (그림 1C,1d)를 표시 하기 시작 합니다. 그리고 식물의 기본 뿌리를 삭제할 cefotaxime 나트륨 [500 µ g/mL] 보충 하는 MS 매체와 새로운 사각형 접시에 공장을 전송 합니다. 참고: 변환 된 털이 뿌리 DsRed 변환 표식 (그림 3D)를 사용 하는 경우 빨간색 형광에 의해 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>Cefotaxime 나트륨 [500 μ g/mL] 보충 하는 MS 매체에서 3-4 주 동안 성장 유전자 변형 털 뿌리 게 복합 공장 (그림 1E)를, (매체 매주 변경).</li>
	<li>목적에 따라 다음과 같이 유전자 변형 털 뿌리와 부정적인 컨트롤을 전파 합니다.<ol>
<li>전체 복합 식물 수경 (테이블 S2) 또는 토양 매체에 대규모 개발에 대 한 허용 하는 전송.</li>
		<li>개별적으로 전파 변환된 털 뿌리, 빨간 형광 변환 마커 (DsRed 단백질)을 표현 하는 뿌리를 잘라 메스를 사용 하 여 때 그들은 4-8 cm 긴 (그림 1E) 이며 Gamborg B5 고체 매체와 페 트리 접시에 그들을 전송 2% 자당 및 cefotaxime 나트륨 [500 μ g/mL] 보충. 플라스틱 실험실 영화와 번호판을 봉인 하 고 20 ° c.에 어둠 속에서 그들을 성장합니다 참고: 뿌리 ( 재료의 표참조) 무 균 조건 하에서 형광을 검출 하는 stereomicroscope에서 조작할 수 있습니다.</li>
		<li>바이오 매스 생산 (즉, 유전자 표정 분석), 5 cm 긴 털이 루트를 잘라내어 2% 자당 및 cefotaxime 나트륨 [500 µ g/mL] 보충 하는 Gamborg B5 액체 매체의 20 mL와 함께 150 mL 삼각 플라스 크에에서 전파. 20 ° C와 60 rpm에서 어둠 속에서 6 주 동안 그것을 성장.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3.jpg"> 그림 1: 시간 표시 막대 감자 A. rhizogenes를 사용 하 여 유전자 변형 털 뿌리를. 변환 프로세스 및 털이 뿌리 성장 이후 단계의 각 단계에 도달 하는 누적 주 표시 됩니다. 다른 단계의 대표 이미지 표시 됩니다: 3 주 된에서 생체 외에서 사용 하는 프로세스의 개시 A. rhizogenes (B)는 증식의 형성을 주입 하 여 (A), 다음 감염 식물의 식물 신흥 털 뿌리 (D), 조직 (C, 화살표) 그리고 빨간 형광 변환 마커 DsRed (E) 표현 개발된 털이 뿌리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
4. A. tumefaciens (그림 2)를 사용 하 여 변환 설치
참고:이 절차는 변형 된 식물의 취득을 수 있습니다. Transgene의 효과 평가, 부정적인 컨트롤 필요 하다. 빈 벡터와 변형 A. tumefaciens 를 사용 하 여 절차에 따라 하나의 옵션이입니다. 또는, 야생 타입 식물을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>고 페 트리 접시에 3-4 주-오래 된 식물 (그림 2A)에서 잎을 배치. 메스를 사용 하 여는 잎 자루를 제외 고 통과 상처 (잎 크기에 따라 1-3) 잎의 센터에서 그들을 잘라 (그림 2B) 피 가장자리에.</li>
	<li>즉시를 abaxial 면 배양 접시에서 액체 미디어 10 mL 신선한 2MS의에 떠 있는 잎을 배치 하 고 접시를 닫습니다. 최대 15 수용 단계 cv. 데지레에 대 한 나뭇잎과 25 ssp 단풍 (잎 크기)에 따라서ndigena 를 반복 합니다.</li>
	<li>즉시 세600 A. tumefaciens 문화의 80 µ L를 추가 액체 매체에서 0.8 = 고 균질 수동으로 세균 솔루션을 배포 하는 1 분에 대 한 접시.</li>
	<li>신중 하 게 씰링 필름으로 밀봉 하 고 알루미늄 호 일 커버 변환 발생할 수 있도록 24 ° C에서 약 실에 있는 2 일 동안 품 어.</li>
	<li>CIM 매체 (그림 2B)까지 abaxial 측면을 유지 하는 잎을 전송 하 고 성장 캐비닛에 1 주 동안 그들을 품 어.<ol>
<li>잎은 미디어에 더 수용 될 수 있도록 핀셋으로 CIM 매체를 다쳤어요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SIM 매체 (그림 2C)까지 abaxial 측면을 유지 하는 잎을 전송 하 고 성장 캐비닛, 상쾌한 매체는 촬영은 약 2 ㎝ 높이 모든 7-10 일에에서 그들을 품 어.<ol>
<li>잎 미디어에 의해 완전히 둘러싸여 수 있도록 핀셋으로 SIM 매체를 다쳤어요. 등장된 촬영 뚜껑에 도달, 키 큰 접시를 사용 (100 x 20 mm, 높이 x 직경). 참고:는 굳은 살은 6-7 주 (그림 2E) 후 SIM 매체 (그림 2D)에 촬영 2-3 주 후에 형성할 것 이다. 쏘고 그들은 독립적인 상처에서 형성 하는 굳은 살에서 나타날 때 독립 변환 이벤트로 간주 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 컷 촬영 각 굳은 살 (동일한 변환 이벤트로 간주)에서 등장 (그림 2E), 전송 MG 매체와 문화 플라스 크를 들 수 있도록 cefotaxime 나트륨 [250 mg/L] 보충 숫자 하위 집합 레이블 응원, 그리고 성장 캐비닛 또는 쏘고 활발 한 (그림 2F) 될 때까지 3-4 주 동안에 품 어. 참고: 자를 쏘고 때 제거 잘 굳은 살 그렇지 않으면 루트를 형성 하지 것입니다.<ol>
<li>독립적인 라인 필요한 만큼 여러 번 단계를 반복 합니다. 5 다른 변환 최대 이벤트는 다른 이벤트에서 식물 혼합 하지는 전체 신뢰에서 작동 하도록 8 cm의 직경을 가진 문화 플라스 크에 놓일 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 이벤트의 가장 활발 한 식물을 선택 하 고 3-4 internodes와 촬영의 꼭대기 세그먼트를 잘라 cefotaxime 나트륨 [250 mg/L] 보충 2MS 매체와 새로운 문화 플라스 크에 배치. 참고: 3-6 주 공장 효율적으로 성장할 것입니다, 활기찬 촬영 및 루트 개발.<ol>
<li>돌려 약 실에 선택 되지 않은 촬영 선택 식물은 완전히 개발 될 때까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하나 이상 있을 또는 꼭대기 꽃 봉 오리와 공장에서 줄기 세그먼트를 잘라내어 새로운 2MS 매체 cefotaxime [250 mg/L] 보충에 그들을 전송. 장 성장에 그들을 품 어.<ol>
<li>생체 외에서 변형 라인 설정 하 매 3-4 주를 복제 합니다. 참고: cefotaxime 나트륨 필요 2MS 매체에 적어도 3 명의 후속 전송에 확실 하 게 죽 일 A. tumefaciens; 나중에, A. tumefaciens 자라 난 관찰 되는 경우 전송 식물 다시 2MS 미디어 cefotaxime 나트륨 보충.</li>
	</ol>
</li>
	<li>식물 형의 특성, 그들의 전체 특성에 대 한 토양 또는 루트 검사에 대 한 수경 법 문화 식물을 전송.<ol>
<li>계속 전파 하 고 설립된 라인을 유지 하는 토양에서 생산 tubers.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig2.jpg"> 그림 2: 감자를 타임 라인 변형 A. tumefaciens를 사용 하 여 식물. 변환 프로세스 및 식물을 성장 하기 위하여 후속 단계의 각 단계에 도달 하는 누적 주 표시 됩니다. 다른 단계의 대표 이미지 묘사 된다: 사용 하 여 프로세스의 개시 3 주 된 생체 외에서 식물 (A)에서 출발, CIM 미디어 (B)를 전송할 때 잎을 나뭇잎 상처와 감염의 전송 SIM 미디어 (C), 2-3 주 후에 SIM 미디어 (D), SIM 미디어 (전자), 9-11 주 후 촬영 형성 및 MG 미디어 (F)을 전송 후 촬영 부상된 영역 주위 굳은 살의 시각화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
5. 수경 문화
<ol><li>반 힘 교류가 솔루션을 준비 (0.5 x) (테이블 S2) 10 L 물통에.</li>
	<li>적절 한 산소 조건 동질성을 유지 하기 위해 수족관 펌프를 담가.</li>
	<li>어두운 조건에서 뿌리 성장에 알루미늄 호 일 양동이의 벽을 커버.</li>
	<li>루트 손상 방지, 생체 외에서 식물 수경 문화 전송. 참고: 신중 하 게 물에 뿌리를 흔들어 잠복기 동안 미생물 확산을 피하기 위해 뿌리에서 모든 나머지 체 외에 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>적절 한 순응 및 성장 챔버에 품 어 유리 공장 처럼 투명 한 필름으로 식물을 커버.</li>
	<li>3 일 후 영화에서 구멍을 확인 하 고 1 주일 후 완전히 제거.</li>
	<li>10 일 마다 신선한 미디어를 바꿉니다.</li>
</ol>6. 거 스 조직화 학적인 취재 원 유전자 분석 결과
참고: 우리의 경우에 거 스 분석 2-3 주 수경 법 또는 체 외에서 성장 뿌리와 수행 되었다.
<ol><li>냉장 90% 아세톤 (v/v)과 뿌리를 해결 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>증류수와 두 빨 래를 수행 합니다.</li>
	<li>신선한 거 스 솔루션 (표 1) 얼룩을 추가 하 고 진공 적용 (-70 Pa) 20 분.</li>
	<li>감광 성 스 4 h 또는 파란 색은 표시 될 때까지 보호 하기 위해 어둠 속에서 37 ° C에서 품 어. 참고: ferri-및 거 스 솔루션에서 ferrocyanide 반응 제품의 확산을 최소화 하 고 더 정확한 지역화를 제공. 주의: 연기 후드를 사용 하 고 거 스 솔루션 (칼륨 ferricyanide 그리고 칼륨 ferrocyanide) 독성 시안 화물 파생 상품을 취급할 때 보호복을 착용. 거 스 기판 및 처리 자료 안전 하 게 처분 되어야 한다.</li>
	<li>거 스 솔루션 얼룩을 제거 하 고 적절 한 용기에 그것을 폐기.</li>
	<li>에탄올 70% (v/v) 2 빨 래를 수행 합니다.</li>
	<li>밝은 분야 현미경으로 관찰 합니다. 참고: 거 스 얼룩은 안정적인 몇 주; 그러나, 첫 주 동안 거 스 신호 분명 하 고 인접 한 셀에는 더 적은 확산. 더 이상 저장소에 대 한 튜브를 봉인 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
</ol><img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59119/59119tbl1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 표 1: 거 스 얼룩 솔루션 제조 법입니다.

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

감자, 안정 되어 있는 완전 한 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 일반적인 시스템 변환 사용 하 여 organogenesis 외 인 phytohormones를 사용 하 여 필요한 Agrobacterium tumefaciens 종자로. Agrobacterium 기반 프로토콜 비 T DNA 벡터 시퀀스25통합 가능성이 있다, 하지만이 방법론 이며 쉬운 아직 덜 비싼 감자 식물을 변환 하는 데 사용할 수 있습니다. 지난 년 동안, A. rhizogenes에 관심-중재 변환 A. tumefaciens를 사용 하 여 보다 짧은 기간에 유전자 변형 뿌리를 허용에 대 한 연구자의 관심을가지고 있다. A. rhizogenes 는 아직도 phytohormone auxin 제어 및 시 토 키 닌 생 합성을 위한 효소를 암호화 하는 유전자의 집합을 전달 하는 유도 하는 루트 (Ri) 플라스 미드를 유지 하 고<sup clas...

경제 관심, 이외에도 유전자 변형 식물의 발생 유전자의 궁극적인 기능을 설명 하 고 이해 식물 생리학 및 개발 연구에 그것의 자신의 관련성을 있다. 가장 널리 사용 되는 방법 식물 DNA 삽입은 Agrobacterium-변화를 중재. Agrobacterium tumefaciens 그 종양 유도 (Ti) 플라스 미드의 행동에 의해 많은 식물 종의 감염된 조직에 크라운 혹을 생성할 수 있다. 플라스 미드는 식물 게놈에 통합 될 것 이다 조직 dedifferentiation1,2를 유도 하는 유전자의 세트와 함께 T-DNA 영역을 포함 합니다. 이 유전자는 transgene로 T DNA 내에서 교환 특정 공장 수정 피하 phenotypic 효력3의 생성을 허용 했다. Transgene T DNA로 복제를 촉진 하기 위하여 T-DNA 영역 Ti 플라스 미드의 유전자의 나머지 부분 동안 이진 플라스 미드 라는 독립적인 플라스 미드에 excised 되어 있다 (T DNA 전송 및 삽입 메커니즘을 수 있는 독성 유전자) 되었습니다 도우미 플라스 미드에 배치. 식물 생명 공학 연구에 대 한 A. tumefaciens 에 의해 변환 여러 이점이 있다: 그것은 비싼 장치를 필요 하지 않습니다, 안정적이 고 일시적인 공장 변환, 및 복사본에 통합 하는 유전자의 낮은 수를 생성할 수는 염색체4. 그러나, 대부분 식물, 하지만 하지 애기, 에 대 한 안정적인 transformants의 세대에서 단일 또는 외 인 phytohormones, 힘들고 시간이 걸리는이 과정을 만들기를 사용 하 여 몇 가지 셀 공장 재생이 필요 합니다. A. rhizogenes 는 또한 식물 게놈 수정 수 털이 뿌리 또는 감염 사이트 루트 유도 (Ri) 플라스 미드5에 인코딩된 rol (루트 loci) 유전자의 표현 때문에 우발적인 뿌리를 생산. 비록 적은 A. tumefaciens보다 공부, A. rhizogenes 또한 유전자 변형 뿌리를 얻기 위해 사용 됩니다. 이 경우에, A. rhizogenes 는 원래 T-DNA Ri 플라스 미드와 이진 플라스 미드에서 두 번째 T dna는 transgene 운반 포함 되어 있습니다. 감염 사이트 줄기 또는 hypocotyls에 있을 때, 합성 공장 얻어질 수 있다, 새로운 털이 유전자 변형 뿌리 야생 타입 촬영에서 신흥. 또는, 털이 변형 된 뿌리에서 체 외에 탄소 소스 입력 미디어에서 자율적으로 성장할 수 있다. A. rhizogenes A. tumefaciens 유전자 변형 조직을 생산 하는 대신를 사용 하 여 때 루트 대상 기관 공장 재생 필요 하지 않습니다 및 따라서 그것은 빠르고 적은 비용 때문에 관련성을 얻고 있다. 이전 연구는 루트 특정 유전자6,7,,89phenotypic 특성에 대 한 충당이 방법론을 증명 하고있다.
감자 (푸른 풀밭 tuberosum) 이후는 결 절은 되는 비타민의 좋은 소스에 대 한 인간의 소비에 대 한 영양 관련 식품 및 농업 기구의 국제 연합 (FAO)에 따르면 세계에 있는 제 4 가장 중요 한 작물은 그리고 미네랄입니다. 그 이유로, 감자 농업 생명 공학의 스포트라이트에 배치 되었습니다 고도 유전과 발달에 대 한 좋은 생물 학적 모델10,11으로 여겨진다. 감자 전이 유전자의 특성을 통해 기본 suberized 조직 suberin에 관여 하 고 생 합성12,13,14 왁 스 분자 메커니즘의 이해에 크게 기여 ,15,,1617, suberin 단위체 전송18 및 녹음 방송 규칙19. Suberin feruloyl 전이 효소 유전자, FHT, 이러한 특징이 생 합성 유전자; 중 하나입니다. 그것의 downregulation suberin의 ferulate 에스테 르에 강한 감소 및 감자 괴 경14왁 스와 상관 periderm 보호의 강한 손상에 상승을 제공 합니다. 수반, 뿌리와 애기의 씨앗, 그것의 상 상속 orthologue (ASFT/RWP1)의 녹아웃 suberin20,21에서 알 킬 ferulates 생산의 역할 또한 보여주었다. 감자, FHT transcriptional 기자 선 그리고 FHT 항 체를 보였다 각각는 발기인 활동 및 단백질 exodermis, endodermis, phellogen-파생 상품 및 부상된 조직을15.
이 작품에서는, 우리는 야생 타입 촬영에 유지 되는 유전자 변형 털 뿌리를 생산 하기 위해 A. rhizogenes 를 사용 하 여, 복합 감자 식물, 생성 또는 자율적 에 체 외성장에 excised 프로토콜 선발. 우리는 또한 완전 한 유전자 변형 감자 식물을 얻기 위해 A. tumefaciens 를 사용 하 여 프로토콜을 제공 합니다. 사례 연구로 A. rhizogenes , A. tumefaciens 동일한 바이너리 벡터와 변형 거 스 기자 유전자 발현 운전 FHT 발기인과 함께 뿌리를 얻기 위해 사용 됩니다. 결과 보고 하 고 비교.

<table><tbody><tr><td> 아세톤 </td><td> Panreac </td><td> 1.310.071.21 < </td><td></td></tr><tr><td> p>아세토시링곤 < </td><td> p>아크로스 </td><td> 115540050 </td><td></td></tr><tr><td> 수족관 펌프 </td><td> Prodac </td><td> MP350 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclave </td><td> Ragpa Strelimatic </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> 세균 한천 </td><td> Lab Conda </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> BAP </td><td> Duchefa </td><td> B0904 </td><td></td></tr><tr><td> 쇠고기 추출물 </td><td> Lab Conda </td><td> 1700 </td><td></td></tr><tr><td> 식물 성장 캐비닛 </td><td> Nuaire < </td><td> p> < </td><td></td></tr><tr><td> p>카르베니실린 </td><td> Duchefa </td><td> C0109 </td><td></td></tr><tr><td> Cefotaxime 나트륨 </td><td> Duchefa </td><td> C0111 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Merck </td><td> 1029310161 </td><td></td></tr><tr><td> Ecotron infors </td><td> HT </td><td> 29378 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Merck </td><td> 1,009,831,011 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Falcon tube </td><td> Control tecnica </td><td> CFT011500 </td><td></td></tr><tr><td> 페리시아네이트<td> > 시그마 </td><td> 101001081 </td><td></td></tr><tr><td> 페로시아네이트 </td><td> 시그마 < </td><td> p>100979088 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스크(직경 8.06cm, 높이 11.3cm) 및 체외 배양용 플라스틱 뚜껑 </td><td> Apiglass </td><td> ref16 </td><td></td></tr><tr><td> GA3 < </td><td> p>Sigma </td><td> G7645 </td><td></td></tr><tr><td> Gamborg B5 media </td><td> Duchefa </td><td> G0210 </td><td></td></tr><tr><td> Gelrite < </td><td> p>Duchefa </td><td> G1101 </td><td></td></tr><tr><td> 글루코사 </td><td> 시그마 < </td><td> p>G5767 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin < </td><td> p>Sigma </td><td> K1377 </td><td></td></tr><tr><td> Leukopor 테이프 </td><td> BSN Leukopor < </td><td> p>BDF47467 </td><td></td></tr><tr><td> Lupe </td><td> Wild-Heerbrugg </td><td> M420 </td><td></td></tr><tr><td> Magnetic shaker </td><td> Agimatic < </td><td> p>7000243 </td><td></td></tr><tr><td> MES 수화물 </td><td> Sigma </td><td> M2933-25G </td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td> Panreac </td><td> 131404 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> Olympus </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Minufugue 원심분리기 5415R </td><td> Eppendorf </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Murashige and Skoog media </td><td> Duchefa </td><td> M0254.0050 </td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td> Panreac </td><td> 131679 </td><td></td></tr><tr><td> NAA </td><td> Duchefa<td> > N0903 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Panreac </td><td> 131659 </td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td> Sigma < </td><td> p>58282 </td><td></td></tr><tr><td> NightSea Stereo </td><td> SFA Moonting Adapter </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Anorsa </td><td> PRFL-001-001 </td><td></td></tr><tr><td> 펩톤 </td><td> Lab Conda < </td><td> p>1616 </td><td></td></tr><tr><td> 페트리 접시 (90 x 14) </td><td> Anorsa </td><td> 200200 < </td><td></td></tr><tr><td> p>pHmetre </td><td> Crison < </td><td> p> </td><td></td></tr><tr><td> Phytotron </td><td> Inkoa </td><td> RFTI-R5485 </td><td></td></tr><tr><td> 식물 한천 </td><td> Duchefa </td><td> P1001 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Refrigeratot </td><td> Liebherr Medline </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Rifampicin </td><td> Duchefa </td><td> R0146 </td><td></td></tr><tr><td> 스펙티노마이신 </td><td> Sigma </td><td> 59007 </td><td></td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> Shimadzu < </td><td> p> </td><td></td></tr><tr><td> 사각 플레이트(120 x 120) </td><td> Deltalab </td><td> 200204 </td><td></td></tr><tr><td> 스트렙토마이신 </td><td> 시그마 </td><td> S6501 </td><td></td></tr><tr><td> 설탕 < </td><td> p>Panreac </td><td> 131621 </td><td></td></tr><tr><td> 수술용 칼날 </td><td> Swann-Morton </td><td> 201 </td><td></td></tr><tr><td> 수술용 바늘 </td><td> NIPRO </td><td> 015/0204 </td><td></td></tr><tr><td> Triptone < </td><td> p>Lab Conda </td><td> 1612 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Triton </td><td> Serva </td><td> 37240 </td><td></td></tr><tr><td> Unimax 1010 shaker </td><td> Heidolph</p</td><td> > </td><td></td></tr><tr><td> 진공 </td><td> Dinko </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> x-GlcA(5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt ancountus) </td><td> Biosynth < </td><td> p>B-7398 </td><td></td></tr><tr><td> 효모 추출물 </td><td> Lab Conda </td><td> 1702.00.00 </td><td></td></tr><tr><td> Zeatin riboside </td><td> Sigma<td> > 1001042850 </td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium tumefaciens 및 agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 suberin 유전자의 발기인 활동

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. 그것이 능력을 전송 하 고 식물의 게놈으로 통합 하는 그것의 자신의 T-DNA 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 널리 사용 되는 방법 중 하나입니다. 여기, 선물이 감자 (푸른 풀밭 tuberosum) 식물 유전자 수정 두 변환 시스템. A. tumefaciens 변환에서 잎에 감염 하 고 변환 된 셀이 선택 된 새로운 완전 한 변환된 공장 18 주에 phytohormones를 사용 하 여 다시 생성 됩니다. A. rhizogenes 변환, 줄기에 바늘으로 박테리아를 주입 하 여 감염 하 고 새로운 등장된 변환된 털 뿌리는 빨간색 형광 마커를 사용 하 여 검색 한 변형 비 뿌리 제거 됩니다. 5-6 주, 결과 공장에서는 완전 개발된 변형된 털 뿌리는 야생 타입 촬영의 합성입니다. 바이오 매스를 증가, 변형 된 털이 뿌리는 excised 고 자체 전파 될 수 있습니다. 우리는 그것이 suberin 생 합성 유전자 발기인에 의해 주도 거 스 취재 원 유전자를 표현 하는 뿌리를 모두 Agrobacterium-중재 변환 방법 적용. 거 스 얼룩 절차 제공 되 고 발기인 유도의 셀 지역화를 수 있습니다. 두 방법에서 변형 된 감자 뿌리 거 스 GUS 활동 suberized endodermis와 exodermis, 그리고 또한, A. rhizogenes 변형 뿌리에 얼룩이 지기 옆 뿌리 출현에 감지 했다 보여주었다. 이 결과 A. rhizogenes 뿌리에 표현 되는 유전자 연구를 빨리 대체 도구가 될 수 있습니다 것이 좋습니다.

Agrobacterium rhizogenes -감자 전이 중재
이 원고에 A. rhizogenes 와 변환된 루트를 설정 하는 단계별 절차를 제공 됩니다. 그림 1 는 전부 (완전 개발된 털 뿌리를 얻기에 A. rhizogenes 의 주입)에서 약 5-6 주 소요 절차의 개요를 제공 합니다. 다음, 식물 합성 (야생 타입 촬영, 유전자 변형 루트) 또는 유전자 변형 털이 루트 클론 excised 고 자율적으로 2% 자당으로 보충 하는 단단한 Gamborg B5 매체에 성장 수로 공부 될 수 있다. 또는, 털 뿌리 수 대규모 전파 액체 Gamborg b 5 미디어를 사용 하 여. 제시 하는 절차 S...

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

농균 매개 변환은 유전자 변형 감자 식물을 생산하는 쉬운 방법입니다. 특정 유전자 기능 및 장기 생리학에 그들의 기여를 이해 하기 위해. 농균 균 류 균 에 의해 변환 신속 하 게 작동 하는 뿌리를 평가 하기 위한 강력한 도구, 유사한 결과 농업 박테리움 tumefaciens 변환에 의해 얻을 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 산드라 페르난데스-피난, 포스트 닥터, 그리고 제니퍼 로페즈, 우리 실험실에서 maste5r의 학생입니다. 효모 추출물 국물 5밀리리터 또는 YEB 배지에서 하룻밤 사이에 단일 아그로박테리움 식민지를 섭씨 28도에서 섭씨 28도에서 항생제로 보충하여 분당 200회전으로 성장하십시오. tumefaciens 변환을 위해, 다음 날 아침 광학 밀도를 측정합니다.600 나노미터 또는 OD 600의 광학 밀도가 0.6 내지 1에 도달하면, 농균 배양의 원심분리기 1밀리리터및 항생제 없이 신선한 YEB 배지의 1밀리리터로 펠릿을 재보종한다. 두 번째 세척 후, 항생제 없이 신선한 YEB 배지에서 펠릿을 재연하여 0.8의 최종 OD 600을 획득하고 세균세포를 얼음 위에 놓는 적절한 농도로 재차한다. A.rhizogenes를 이용한 식물 변환의 경우, 기증자 공장을 2MS 중간 배양에서 120 x 120 밀리미터 평방 플레이트로 신중하게 이전하고, 외과 바늘을 사용하여 A.rhyzogenes 배양에서 다른 줄기 간극에 3 개의 마이크로리터를 주입합니다.그런 다음 즉시 0.1 밀리머아 아세토시링존으로 보충된 솔리드 MS 배지를 함유한 새로운 사각형 플레이트로 공장 전체를 즉시 이송합니다. 두 번째 식물을 동일한 플레이트에 배치한 후 동일한 방식으로 변형된 후, 수술용 테이프로 플레이트를 밀봉하고 4일 동안 접시를 성장 캐비닛 내부에 수직으로 놓습니다. A.rhizogenes를 죽이고 4 일 동안 성장 캐비닛 내부에 수직으로 밀봉 된 플레이트를 배치하는 cefotaxime 나트륨으로 보충 MS 매체와 사각형 접시에 식물을 전송합니다.10~12일 후에는 새로운 털이 많은 뿌리가 나타납니다. 그들의 변환은 형광 스테레오 현미경에 의해 확인될 수 있습니다. 이때, 각 식물의 토착 뿌리를 소비하고, Ms 배지를 가진 새로운 사각형 접시로 식물을 옮기고, 세포메 나트륨으로 보충하여 A.rhizogenes을 죽입니다.복합 식물을 얻으려면, 형질 털이 뿌리는 CEfotaxime 나트륨으로 보충 된 MS 배지에서 또 다른 3 ~ 4 주 동안 자랄 수 있습니다. A.tumefaciens를 사용하여 식물 변환을 위해. 3~4주 된 식물의 잎을 페트리 접시에 담아 잘라내고 메스를 사용하여 잎 의 중심에서 가장자리까지 1~3개의 가로 컷을 만듭니다.그리고 페티올을 제외합니다. 즉시 잎을 신선한 2MS 액체 매체의 10 밀리리터가 들어있는 페트리 접시에 넣고 축축한 면을 위로 올려 놓고 접시를 덮습니다. A.tumefaciens 배양의 80 마이크로리터를 액체 배지에 빠르게 추가하고 1분 동안 배지를 부드럽게 저어 세균용 용액을 균질적으로 분배합니다.그런 다음 조심스럽게 밀봉하고 24도 섭씨 챔버에서 2 일 배양 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다. 변환 기간이 끝나면 잎을 축축측으로 위로 옮기고, 냉담한 유도 매체로 옮기고, 성장 캐비닛에서 1주일 동안 핀셋으로 긁어냅니다. 인큐베이션의 끝에서 잎, 축면을 위로 옮기고, 트위저 스크랩 된 촬영 유도 매체에 옮기고, 성장 캐비닛에 잎을 배양한다.등장 슈트가 약 2센티미터 높이일 때, 각 냉담한 슈트 세 개를 잘라냅니다. 최대 5개의 서로 다른 슈트 변환 이벤트를 세포로메 나트륨으로 보충한 MG 배지를 함유한 개별 배양 플라스크로 배치하고, 슈트가 활발해질 때까지 성장 캐비닛에서 3~4주 간 배양에 적합한 서브세트를 라벨링한다. 인큐베이션이 끝나면 각 이벤트의 가장 활발한 식물을 선택하고 각 플랜트에서 3~4개의 상호 노드로 슈트의 정량 세그먼트를 잘라냅니다.세그먼트를 세포로메 나트륨으로 보충한 2MS 매체를 포함하는 배양 플라스크에 넣고 활발한 슈트와 뿌리를 개발할 때까지 식물을 재배합니다. 베타 글루쿠로니다제 또는 GUS 히스토케미컬 리포터 유전자 분석작업을 수행하기 위해 2~3주 간 체외식물 배양에 90%의 차가운 아세톤으로 얼음 위에서 20분간 뿌리를 정한다. 고정의 끝에서, 증류수에 뿌리를 두 번 세척하고 20 분 동안 진공 상태에서 신선한 GUS 염색 용액으로 뿌리를 처리합니다.진공 처리의 끝에, 약 4 시간 동안 어둠 속에서 섭씨 37도에 뿌리를 놓습니다. 파란색이 보이면 70%에탄올로 뿌리를 두 번 씻고 밝은 필드 현미경으로 염색을 시각화합니다. 변형된 털이 많은 뿌리는 녹색 빛으로 조명될 때 붉은 꽃집, 변형되지 않은 아그로박테리움은 이러한 꽃집을 보여주지 않으며, 이는 형질형 털이 많은 뿌리를 식별하기 위한 DS 빨간 변형 마커의 적합성을 나타냅니다.여기서, A.tumefaciens및 A.rhizogenes에 의해 얻어진 형질형성 털이 뿌리에 의해 얻어진 형질형성 식물의 뿌리에서 GUS 염색이 도시된다. 관찰된 바와 같이, 뿌리는 A, tumefaciens 및 시험관 내 에서 자란, 내피질과 stele 사이 세포 층, 내피에서 파란 얼룩을 보여줍니다. 더 발달된 뿌리에서, 파란색 라벨링은 외신에 대응하는 외부 층의 패치입니다.A.rhizogenes에 의해 얻어지고, 수경재배에서 자란 변형된 털이 뿌리에서, GUS 마커는 특히 상처부위와 외수성에서 측면 뿌리의 출현에 내분비 내에 위치한다. 빠른 방법 이외에, 아그로박테리움 뿌리겐으로 얻은 형질전환 뿌리는 또한 일부 직접 제어 된 프로세스를 조절 할 수있는 뿌리 유도 플라스미드에서 DNA를 운반했다. 아그로박테리움 맥균유전자로 얻은 형질전환뿌리는 촬영 중에 유지될 수 있지만, 대규모 대중교통 생산을 위해 시험관내로 전파될 때까지 현장에서 사용할 수 있다.감자 변환은 유전자 기능 및 프로모터 활성화를 확인하고, 또한 높은 농업 적 관심의 종에서 방법론 규칙을 생산하는 좋은 도구를 제공합니다. 유전자 변형 유기체는 환경 오염을 피하기 위해 사용 후 안전하게 폐기해야합니다. 또한 가스 용액에는 독성 시안화물 유도체가 포함되어 있으므로 보호를 착용하고 용액을 안전하게 폐기하십시오.

agrobacterium-tumefaciens-agrobacterium-rhizogenes-mediated

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

Agrobacterium 중재 변환 꽃 딥 메서드를 사용 하 여 성공적으로 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula의 안정적인 유전자 변형 라인을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 선물이 프로토콜에서 애기 thaliana, 다른 성장 습관을 고려 하 고는 extremophyte의 생리 적 특성에 대 한 수정.

식물 성장 및 Extremophyte Schrenkiella parvula 의 꽃-딥 변환 Agrobacterium 중재

여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

식물 형태 유전자는 반발성 유전자형의 유전적 변형을 개선하는 데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 것은 3개의 중요한 공공 옥수수 근친선에 대한 아그로박테리움-매개유전형형(QuickCorn) 프로토콜이다.

아그로박테리움-형태유전자를 이용한 리칼시트 옥수수 근친선 미성숙 배아 변형 중재

우리는 아그로박테리움 뿌리줄기유전자-타르타르메밀(Fagopyrum tataricum)에서매개 변형된 변종에 의해 털이 많은 뿌리를 유도하는 방법을 설명합니다. 이 유전자 기능 및 타르타리 메밀에서 이차 대사 산물의 생산을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다., 어떤 유전 변환에 대 한 채택, 또는 개선 후 다른 약용 식물에 대 한 사용.

아그로박테리움 뿌리줄기에의한 털이 많은 뿌리 유도 -타르타르 메밀의 매개 변형(파고피룸 타타리쿰)

다양한 연구 분야에서 모델 종으로 다용도로 적용되기 때문에 좁은 잎 질경이 (Plantago lanceolata)의 유전자 변형 툴킷이 필요합니다.  여기에서 Agrobacterium tumefaciens 매개 형질전환을 사용하여 형질전환 효율이 20%인 안정적인 형질전환 계통을 생성하는 프로토콜이 제시됩니다.

Agrobacterium tumefaciens - 좁은 잎 질경이의 매개 유전자 변형

여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

여기에서는 복합 식물을 생산하기 위해 Agrobacterium tumefaciens 가 매개하는 원스텝 형질전환 방법의 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Agrobacterium rhizogenes 기반 털이 많은 뿌리 형질전환에 의한 복합 식물 생산을 위한 효율적이고 재현 가능한 방법

우리는 P. capsici  에도 적용 가능한 Phytophthora palmivora의 아그로박테리움 매개 변형을 위한 간단하고 효과적이며 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다.

아그로박테리움 매개 피토프토라 팜미보라의 변형을 위한 간소화된 방법

학습하세요 Agrobacterium tumefaciens와 Agrobacterium rhizogenes를 이용한 감자 유전자 변환 기법을 GUS 염색으로 프로모터 활성을 평가하는 방법입니다. 이 프로토콜은 뿌리 생리학 연구에 활용됩니다.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

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