Name: ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 학습하세요 인간 CD4+ T 세포에서 미토콘드리아 DNA 오염을 50%에서 3% 미만으로 감소시키는 개선된 ATAC-seq 프로토콜을. 이 방법은 염색질 가용성 연구의 데이터 품질과 비용 효율성을 높입니다.

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우리는 기술 지원에 대 한 Atsede Siba를 감사합니다. C.S.C.는 NIH 그랜트 1R61DA047032에 의해 지원 됩니다.

이 향상 된 프로토콜 데이터 분석 (그림 1)을 통해 전체 혈액의 시작 물자에서 CD4 + 세포의 ATAC seq를 수행 하기 위한 단계별 지침을 제공 합니다.
1. 전체 혈액에서 CD4 + T 세포의 고립
참고: 이 프로토콜에 대 한 시작 물자는 선정 될 시작 물자의 소스 연구 요구 사항에 따라 수 있도록 표준 절차를 사용 하 여 수집 하는 신선한 전 혈의 15 mL 이다. 필요에 따라 프로토콜을 확장 합니다. 미리 따뜻한 인산 염 (PBS) + 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 실내 온도 (RT)를 버퍼링 하 고 CD4 + T 세포 농축 절차를 시작 하기 전에 rt 원심 분리기를 조정 합니다.
<ol><li>15 ml 50 mL 원뿔 튜브에 전체 혈액의 인간의 CD4 + T 세포 농축 칵테일의 750 µ L을 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합. 20 분에 대 한 RT에서 품 어. 부 화 완료 되 면 튜브에 15 mL PBS + 2 %FCS 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합.</li>
	<li>15 mL 밀도 매체의 신선한 50 mL 원뿔 튜브를 준비 합니다. 조심 스럽게 희석된 혈액 샘플 밀도 매체/혈액 인터페이스를 형성을 방해 하지 않도록 되 고 밀도 매체의 상단에 레이어. 1과에서 내림차순 브레이크 설정 가속 g 와 RT x 1200에서 20 분 동안 원심 분리기. 참고: 그것은 1과 밀도 매체에 셀 계층의 혼란을 피하기 위해 원심 분리기에 떨어져 브레이크 하강 가속도 설정 하는 중요 한.</li>
	<li>좁은 줄기 전송 피 펫을 사용 하 여 밀도 매체/플라즈마 인터페이스에서 농축된 CD4 + T 세포를 수집 합니다. 신선한 50 mL 원뿔 튜브에 수집 된 세포를 전송. X g 와 실시간 423에서 8 분에 대 한 수집 된 CD4 + T 세포를 원심 참고: 1.3 단계와 다음 단계를 모두를 ON 9 및 내림차순 브레이크에 원심 가속도 반환 해야 합니다.</li>
	<li>상쾌한 고 PBS + 2 %FCS 50 mL로 두 번 셀 펠 릿을 세척, 423 x g 및 실시간 삭제에서 8 분에 대 한 최종 상쾌한 centrifuging 세척 하 고 씻어 셀 펠 릿 2 ml PBS + 2 %FCS 일시 중단.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. ATAC seq를 계속 하려면 2.3 단계로 진행 합니다. 나중에 처리에 대 한 셀을 고정 하려면 1.6 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>1 백만 세포 당 신선한 냉동 매체 (FCS 90% + 10% 디 메 틸 sulfoxide)의 1 mL를 추가 합니다. 극저온 안전 튜브에 중간에 셀의 aliquot 1 mL. -80 ° c 하룻밤 느린 냉동 컨테이너에서에서 튜브를 배치 합니다. 다음 날, 장기 저장을 위한 액체 질소에 튜브를 전송 합니다. 참고: 1 백만 CD4 + T 세포는 전체 혈액의 원래 볼륨의 2 mL 당 격리 될 것입니다. 냉동 매체의 1 mL aliquots에 500000 셀을 고정 합니다. 모든 사용에 신선한 냉동 매체를 확인 합니다.</li>
</ol>2. 활성화 하 고 CD4 + T 세포를 정화
참고: 이 급속 한 프로토콜을 활성화 하 고 CD4 + T 세포만을 정화에 대 한 48 h와 95% 가능한 결과 CD4 + T 세포를 활성화 해야 합니다. 4 ° c 원심 분리기에서 프로토콜을 시작 하기 전에 냉각 하십시오.
<ol><li>얼음이 그냥 녹아 때까지 1 유리병 (500000) 37 ° C 물 목욕에 있는 CD4 + T 세포의 해 동. 부드럽게 미리 따뜻하게 로스웰 파크 기념 연구소-1640 (RPMI-1640) 미디어 라 함 완전 RPMI 10 %fcs 보충의 9 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 합니다. 참고: 셀 DMSO에 노출을 피하기 위해 완전히 해빙 못하게 합니다.</li>
	<li>G 와 4 ° C x 1500 6 분 원심 분리기 삭제는 상쾌한 고 부드럽게 완전 한 RPMI의 2 mL에 펠 릿을 일시 중단. 아래로 스핀을 반복 하 고 상쾌한, 삭제 부드럽게 완전 한 RPMI의 0.5 mL에 셀을 일시 중단.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 완전 한 RPMI 50000 셀 96 잘 라운드 바닥판의 당 200 µ L에 접시를 가진 세포 현 탁 액의 밀도 조정 합니다. 참고: 하나에서 500 K CD4 + T 세포, 잘 당 200 µ L에서 50000 CD4 + T 세포의 접시 10 우물의 튜브를 고정.</li>
	<li>
마그네틱 구슬 인간 T-활성 제 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체와 활용 준비.
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 ATAC seq 샘플 당 인간 T-활성 제 CD3/CD28 구슬의 aliquot 12.5 µ L. 1 x PBS의 1 mL와 구슬 세척 하 고 1 분에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>조심 스럽게 제거 맑은 상쾌한 삭제, 자석에서 튜브를 제거 고 13에서 구슬 중단 µ L ATAC seq 샘플 당 RPMI 완료. 참고: ATAC seq 샘플 처리의 수에 따라 필요한 구슬의 양을 계산 합니다. 이 프로토콜 당 500000 셀, CD3/CD28 구슬의 한 ATAC seq 샘플 구성 12.5 µ L를 요구 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CD4 + T 세포를 활성화 합니다. 2.1 ml 15 mL 원뿔 튜브에 완전 한 RPMI 매체의 500000 세포를 수집 하 고 미리 씻어 인간 T-활성 제 구슬의 12.5 µ L을 추가. 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 혼합.</li>
	<li>부드럽게는 메 마른 저수지와 접시 200 µ L 셀 당 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 둥근 바닥 96 잘 접시의 구슬의 구슬 가진 셀 전송. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 48 h에 품 어.</li>
	<li>인큐베이션 게시물, 원심 x g 와 실시간 제거 100 µ L 당 96 잘 접시, 구슬 손실 보장을 취소 하기 전에 원뿔 튜브에 수집에서 잘 매체의 423에서 8 분 96 잘 접시. 나머지 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 모두 1.5 mL 튜브에에서 수집 합니다. 참고: 활성화 된 T 세포의 10 우물 1 mL 볼륨에 수집 됩니다.</li>
	<li>CD4 + 격리를 수행 합니다. 500000 셀 완전 RPMI의 1 mL에 미리 씻어 CD4 활용 된 구슬의 50 µ L를 추가 합니다. 피 펫, 구슬 및 셀을 결합 한다. 냉장고에서 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 구슬 및 셀 혼합 매 6 분 교 반 하십시오. 참고: 이 프로토콜은 500000 셀의 한 샘플에 대 한 사용 될. 두 개 이상의 500000의 샘플에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.</li>
	<li>부 화 완료 되 면 2 분을 제거 하 고 상쾌한 때 분명 삭제에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다. 자석에서 튜브를 제거, 1 mL의 PBS + 2 %FCS 구슬 바인딩된 셀을 중단, 1 분에 대 한 자석에 튜브를 교체 및 명확한 상쾌한 삭제 구슬 바인딩된 셀을 씻어. 3 세척의 총에 대 한이 프로세스를 반복 합니다. 참고: 수 세척 하는 동안 어떤 구슬을 무시 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>최종 세척 후 1 분 제거에 대 한 자석에 튜브를 배치 하 고 삭제는 상쾌한 얼음에 펠 릿을 놓습니다. 섹션 3 (ATAC-seq)를 진행 합니다.</li>
</ol>3입니다. ATAC seq
참고: 이 단계에서 핵 ATAC-이 대 한 활성화 된 CD4 + T 세포에서 격리 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 세포의 용 해 버퍼 보다 효율적인 소화와 높은 품질의 결과 결과로 핵에 gentler 되도록 향상 되었습니다. 모든 원심 분리 단계 섹션 3에서에서 4 ° c.에 유지 고정 각도 원심 분리기와 수행 프로토콜을 시작 하기 전에 원심 분리기를 냉각 하십시오.
<ol><li>핵 격리를 수행 합니다. Resuspend 구슬 및 찬 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.4, 10 m m NaCl, 3 m MgCl2, 0.03% 폴 20 m)와 셀. 4 ° c.에서 10 분 동안 500 x g 에서 즉시 원심 제거 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Transposase 반응을 수행 합니다. 50 µ L Tn5 transposase 혼합 (표 1)의 고립 된 핵 펠 릿을 일시 중단 합니다. 들고 끝나면 4 ° C에서 40 ° C 뚜껑, 37 ° C에서 30 분 동안 thermocycler에서 품 어.</li>
	<li>Thermocycling, 후 즉시 다운 빠른 벤치탑 원심 분리기 회전을 수행 하 고 구슬 제품에서 제거 하려면 1 분에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>DNA 정화 열 튜브 자석에 분명 상쾌한 전송. 열 번 버퍼 PB의 250 µ L 고 버퍼 PE의 750 µ L로 두 번 씻는 다. 차입 버퍼의 10 µ L에서 샘플 elute 3.5 단계 직접 진행. 참고: 이 단계는 여기 ATAC seq 라이브러리 라고 합자 어댑터와 DNA 파편을 증폭 한다. NGS 차선에서 실행 되도록 여러 ATAC seq 라이브러리 다중화 하기 위해서는 모든 예제 및 개별 샘플 (표 2)에 대 한 다른 인덱싱된 뇌관 2 인덱싱되지 않은 뇌관 1을 사용 합니다. 프라이 머는 1.25 µ M의 농도 작업에 사용 됩니다.</li>
	<li>Nuclease 무료 PCR 튜브, 순서와 볼륨에 지정 된 구성 요소를 결합 하 여 초기 PCR 증폭 반응 설정 표 3. thermocycler에 PCR 튜브를 놓고 표 4에 지정 된 대로 순환 조건 PCR 증폭 프로그램을 실행 합니다.</li>
	<li>
정량에 의해 반응을 모니터링 합니다. 정량 Pcr 반응 nuclease 무료 PCR 튜브, 순서 및 금액 표 5에 지정 된 구성 요소를 결합 하 여 설정 합니다. 정량 Pcr 기계과 지정 된 테이블 6으로 주기.
	<ol>
<li>나머지 45 µ L 반응에 주기 추가 확대의 최적 수를 확인 하려면 x 축 및 y 축에 상대 형광 (RFU)에 주기 수와 음모를 만듭니다. 최적의 횟수 추가 확대의 3 분의 1 사이클 정량 반응 고원에 도달에 대 한 걸리는 수가입니다. 참고: 정량 Pcr 반응 모니터링 PCR 주기 GC 콘텐츠 및 크기 편견을 최소화 하면서 최적의 라이브러리 조각 확대를 원하는 최적의 수의 결정에 대 한 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 반응의 나머지 45 µ L의 최종 PCR 증폭을 완료 합니다. 다시는 thermocycler에에서 단계 3.5에서에서 증폭 반응 PCR 튜브를 놓고 표 7에 설명 된 대로 프로그램을 실행 합니다. 참고: 이 프로토콜에서 설명 된 대로 처리 하는 샘플에 대 한 PCR 확대 주기의 최적의 총 수는 12 되도록 결정 되었다.</li>
	<li>증폭 완료 되 면 라이브러리 제조업체의 프로토콜, 차입 버퍼의 25 µ L에서 방출 다음 PCR 정리 키트를 사용 하 여 정화. 참고: 증폭된 라이브러리는 최대 48 h 4 ° C에서 저장 하거나 장기 저장을 위한-20 ° C에서 냉동 수 있습니다.</li>
</ol>4. ATAC seq 도서관 품질 분석
참고: 그것은 품질과 수량 다음-세대 시퀀싱 하기 전에 시퀀스 (seq) ATAC 라이브러리의 유효성을 검사 하는 것이 중요입니다. 품질 및 수량 라이브러리의 상용 키트 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 평가 되어야 한다.
<ol><li>크기 조정, 정량화 및 DNA의 품질 관리에 대 한 마이크로-기반 플랫폼을 사용 하 여 ATAC seq 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다. 대표적인 품질 평가 결과 그림 2 를 참조 하십시오. 참고: ATAC seq 라이브러리의 농도 여야 > 품질 시퀀싱 결과 얻기 위해 µ 1 ng/L. 평균, 30 nM 25 µ L에 취득 했다.</li>
</ol>5. 시퀀싱 및 데이터 분석
참고: 이 분석 파이프라인 읽기 매핑 절차의 품질을 제어 하 고 실험 설계에 대 한 좌표를 조정 하 고, 다운스트림 분석에 대 한 봉우리를 호출 수 있습니다. 다음은 명령 선 및 실행의 설명입니다. 데이터 분석 패키지 (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq)에서 이용하실 수 있습니다.
<ol><li>샘플 당 42 백만 읽기의 평균 읽기 깊이를 다음 세대 시퀀서에 준비 된 라이브러리 순서.</li>
	<li>FastQC12 소프트웨어 패키지 명령을 사용 하 여 생성 된 파일을 선택 하 여 연속 읽기의 품질을 예상: fastqc-o < output_directory >< fastq_file ></li>
	<li>트림 읽기의 기초 Trimmomatic13 소프트웨어에 의해 필요한 경우, 명령을 사용 하 여 FastQC 품질 검사에 의해 결정으로 (대 한 쌍-엔드): 자바-병 < trimmomatic jar 파일 경로 > PE < input1 >< input2 >< 쌍된 output1 >< 홀된 output1 >< 쌍된 output2 >< 홀된 output2 > HEADCROP: < 자르기 기지 ></li>
	<li>Bowtie214 소프트웨어에 의해 인간의 참조 게놈 (hg38)에 정렬: bowtie2-x < 참조 게놈 >-< 입력된 쌍 1 >< 1 입력된 쌍 2 > < 출력 SAM 파일 > S 참고: 인수-x 참조 게놈에 대 한 인덱스의 basename 이며 샘 형식 출력-S입니다.</li>
	<li>Samtools15 flagstat 패키지를 사용 하 여 매핑된 읽기의 품질 확인: samtools flagstat < BAM 파일 ></li>
	<li>매핑된 읽기 파일을 정렬 하 고 중복 피16 도구를 사용 하 여 제거: 자바-picard.jar SortSam 입력 항아리 < 입력된 SAM 파일 이름 > = 출력 = < 출력 정렬 BAM 파일 이름 > SORT_ORDER 좌표 = "및" java-picard.jar MarkDuplicates 입력 항아리 < 정렬 된 BAM 파일 > = 출력 < 중복 없이 출력 BAM 파일 > = REMOVE_DUPLICATES = TRUE</li>
	<li>인덱스 BAM 파일을 사용 하지 않는 염색체 읽기 손질과 ATAC seq17의 실험적인 이유에 대 한 좌표를 이동: 자바-picard.jar BuildBamIndex 입력 자 = < BAM 파일 > samtools idxstats < 입력 BAM 파일 > | -f 1을 잘라 | grep-v chrY | grep-v chrM | grep-v chrUn | xargs samtools 볼-b < 입력 BAM 파일 >>< 출력 트림 BAM 파일 > bedtools bamtobed-i < 입력 손질 BAM 파일 >>< 출력 트림 침대 파일 > awk ' 시작 {OFS = "\t"}; {만약 ($6 = = "+") 인쇄 $1, $2 + 4, 3 + 4 달러, $4, $5, $6, $1, $2-5, 3-5 달러, $4, $5, $6 다른 인쇄}' < 입력 손질 침대 파일 >< 트림 된 침대 파일 이동 ></li>
	<li>삭제 부정적인 조정으로 이동 하는 읽기: awk '{if ($2 > 0) 인쇄 $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" 6 달러}' < 입력 침대 파일 >< 출력 음수가 아닌 조정 침대 파일 >.</li>
	<li>다음 DiffBind18 분석용 BAM 파일 침대 파일 변환: bedtools bedtobam-< 입력 침대 파일 > i-g < 참조 게놈 >< 출력 BAM 파일 ></li>
	<li>최대 호출 수행 DiffBind18 소프트웨어 패키지에 의해: macs2 callpeak-t < 입력 BAM 파일 >-f BAM-g hs-nomodel-nolambda-유지-dup 모든-전화-정상-outdir < 출력 디렉터리 경로 >-n < 출력 이름 >-B-q 0.01-bdg-shift-100-extsize 200 참고: 필터링 후 샘플 당 37 백만 읽기의 중간값을 기대 합니다. 미토 콘 드리 아 DNA 오염에서 0.30%-5.39% (평균 1.96%) 범위 것입니다. 곱하기 매핑된 읽기 (평균 6.7%-56%, 19%)의 낮은 속도 그리고 핵 사용의 상대적으로 높은 비율 (60%-92%, 평균 79%)를 읽습니다.</li>
</ol>

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</ol>

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이 문서에 제공 된 수정된 ATAC seq 프로토콜 최소한의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 재현 가능한 결과를 제공 합니다. 프로토콜이 되었습니다 사용 성공적으로 인간의 기본 PBMCs10, 인간 monocytes, (미 출판), 마우스 수지상 세포의 염색 질 건축 특징 및 교양된 흑색 종 세포 라인11. 우리는이 향상 된 세포 예상 상태 뿐만 아니라 다른 세포 유형 대 일 가능성이 있다. 그것 또한이 핵 격리 프로토콜 단일 핵 ATAC seq 프로토콜, 시퀀싱 결과 개선 하는 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화와 호환 된다는 것을 예상 된다.
이 수정된 프로토콜의 추가 혜택을 환자 샘플의 여부에 따라 서로 다른 시간에 PBMCs에서 고립 된 CD4 + T 세포의 배치를 동결 능력입니다. ATAC seq 다음 모든 샘플에서 동시에 수행할 수 있습니다, transposase 반응 및 시퀀싱에 잠...

Transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq)을 시퀀싱에 대 한 분석 결과 빠르게 chromatin 구조 질의 대 한 주요 방법 되고있다. ATAC seq tagmentation, 분할 및 라이브러리는 시퀀싱 전체 게놈에서 chromatin 내게 필요한 옵션 확인 수를 생산 하는 동일한 효소에 의해 DNA의 태그의 과정을 통해 액세스할 수 있는 chromatin의 영역을 식별할 수 있습니다. 이 tagmentation 과정만 인하 nucleosomic 입체 지 장 때문 chromatin의 오픈 지역 활동적인 Tn5 transposase에 의해 중재 됩니다. 그것은 삭감으로 Tn5 transposase를 PCR에 의해 빠른 라이브러리 건설과 게놈 넓은 접근 chromatin1,2의 다음-세대 시퀀싱 시퀀싱 어댑터를 삽입 합니다.
ATAC seq 비교적 간단 하 고 빠른 프로토콜, 품질 및 그 결과, 그리고 시작 물자 필요의 작은 금액에서 결정 될 수 있는 정보의 범위 chromatin 접근성의 영역을 결정 하기 위해 선호 되는 방법 되고있다. 비해 DNase seq3 (는 또한 게놈 넓은 chromatin 접근성), MNase-seq4 (오픈 게놈 지역에 nucleosome 위치 결정), 그리고 포름알데히드 중재 시 키-seq5, ATAC seq 빠릅니다, 저렴 하 고 쉽게 재현 가능한1. 그것은 또한 더 중요 한 시작 물자의 500 핵, DNase seq3에 필요한 50 백만 핵에 비해 몇 가지 작업. ATAC seq는 또한 전사 인자 바인딩, nucleosome 위치, 및 오픈 chromatin 지역1의 영역을 포함 하 여 다른 방법 보다 chromatin 아키텍처에 대 한 자세한 정보를 얻을 수가 있다. 효과적인, 단일 셀 ATAC seq 프로토콜은 유효성이 검증, 단일 셀 레벨6,7chromatin 구조에 정보를 제공.
ATAC seq 식물8, 인간9, 그리고 다른 많은 유기 체를 포함 한 연구와 세포 종류의 넓은 스펙트럼에 걸쳐 chromatin 아키텍처의 특성에 사용 되었습니다. 그것은 또한 질병 상태7의 후 성적인 규칙 식별에 중요 한 되었습니다. 그러나, 가장 널리 사용 되는 ATAC seq 프로토콜 오염 시퀀싱 읽기 미토 콘 드리 아 DNA의 주요 단점은 포함합니다. 일부 데이터 집합에서이 오염 수준 시퀀싱 결과1의 60% 만큼 높을 수 있다. ATAC seq7,,1011의 더 효율적인 응용 프로그램을 허용 하려면 이러한 오염 미토 콘 드 리아 읽기를 줄이기 위해 필드에 공동된 노력이입니다. 여기 우리 현재 3%, 미토 콘 드리 아 DNA 오염 속도 감소 시키는 작업을 처리 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용10에서 약 50%의 감소를 허용 합니다. 이것은 CD4 + 림프 구 분리 및 활성화 및 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화에 중요 한 향상 된 세포의 용 해 버퍼의 유선형된 과정에 의해 이루어집니다.
이 modifiedATAC-seq 프로토콜은 다양 한 인간의 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)10, 인간의 기본 monocytes 그리고 마우스 수지상 세포 (미 발표)을 포함 하 여 기본 셀 유효성이 검증 되었습니다. 그것은 또한 사용 되었습니다 성공적으로 비 코딩 요소11의 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 화면에서 흑색 종 세포 라인이. 또한,이 프로토콜에서 설명 하 고 GitHub에 제공 된 데이터 분석 패키지 제공 새로운 경험과 연구를 도구 ATAC seq 데이터를 분석 합니다. ATAC seq 전체 게놈에서 chromatin 접근성을 매핑하는 데 가장 효과적인 분석 결과 이며 여기에 도입 된 기존 프로토콜에 대 한 수정 연구원 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염, 높은-품질 데이터를 생성 하면 시퀀싱 비용을 절감 하 고 ATAC seq 처리량을 개선.

<table><tbody><tr><td>PBS 1개, 멸균</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>5810/5810&nbsp; R Swing Bucket 50 mL, 15 mL 및 1.5 mL 튜브 버킷이 포함된 냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>96웰 라운드 바닥판</td><td>Thermo Scientific</td><td>163320</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Agilent 4200 테이프 스테이션 시스템</td><td>품질 평가를 위해</td> <td>Agilent</td><td>G2991AA</td> 제안되었습니다.</tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>374081</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D8418</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11131D</td><td>중요 구성 요소</td></tr><tr><td>Dynabeads 손대지 않은 Human CD4 T 세포 키트</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11346D</td><td>중요 구성 요소</td></tr><tr><td>Dynamagnet</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>12321D</td><td>중요 구성 요소</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>다른 유사한 것을 사용할 수 있습니다. 제품.</td></tr><tr><td>고감도 DNA 키트</td><td>애질런트</td><td>50674626</td><td>품질 평가를 위해 제안됩니다.</td></tr><tr><td>염화마그네슘, 육수화물, 분자 생물학 등급</td><td>시그마</td><td>M2393</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트(버퍼 PB, 버퍼 PE, 용리 버퍼)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>중요 구성 요소</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NaCl, 분자 생물학 학년</td><td>시그마</td><td>S3014</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td><td>Illumina</td><td>FC1211030</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Nuclease Free Sterile dH20</td><td>Gibco</td><td>10977015</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>폴리 소르 베이트 20 (Tween20)</td> <td>시그마</td><td>P9416</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR 그린 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>중요 성분</td></tr><tr><td>정밀 수조</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트: Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td>중요 구성 요소</td></tr><tr><td>, Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>, Invitrogen Life Technologies</td><td>Q32851</td>: <td>품질 평가용으로 제안됨.</td></tr><tr><td>Qubit FlouroMeter</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q33226</td><td>품질 평가에 제안됨.</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>15022</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>멸균 Resevoir</td><td>Thermo Scientific</td><td>8096-11</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

atac seq 분석 결과 주 인간의 cd4 + t 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 dna 오염

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC seq 신속 하 고 간단한 접근 방식 게놈 넓은 접근 chromatin 매핑 때문에 epigenetics의 연구에 널리 사용 되는 방법론 되고있다. 이 문서에서 우리는 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 감소 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 제시. 이 프로토콜에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 감소 3%의 평균에 미토 콘 드리 아 DNA 오염 이전 ATAC seq 프로토콜 분투 하는 동안 50% 오염 미토 콘 드리 아 DNA의 평균이 읽습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용에 가까운 50% 감소를 허용 한다. 시연 어떻게이 높은-품질 ATAC seq 라이브러리 활성화 된 CD4 + 세포에서 준비 될 수 있다 데이터 분석을 통해 전체 혈액에서 CD4 + 림프 구 분리에서 단계별 지침을 제공 합니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 다양 한 셀 형식에에서 검증은 고 chromatin 접근성을 공부 하는 연구원에 즉시 사용 될 것입니다.

신선한 전 혈의 15 mL에서이 프로토콜 1 백만 CD4 + T 세포의 평균을 생성합니다. 이들은 나중에 처리에 대 한 동결 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다. 신선한 또는 해 동, CD4 + T 세포의 생존 능력은 일관 되 게 &gt; 95%. CD4 + T 세포 고립의이 메서드는 소스 재료와 컬렉션 시간에 유연성에 대 한 수 있습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 µ 1 ng/L 보다 큰 마지막 라이브러리를 생성합니다. 상업적으로 사용할 수 있는 시스템을 사용 하 여 수행 하는 품질 관리 200 및 1000 bp (그림 2) 사이의 DNA 파편을 입증 해야 합니다. 시퀀싱은 고품질 라이브러리만 수행 되어야 한다.
모든 라이브러리 샘플 당 읽기 40 백만 이상의 평균 깊이에 시퀀싱 했다. AT...

여기, 우리는 transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq) 활성화 된 CD4 + 인간 림프 톨에 시퀀싱에 대 한 분석 결과 수행 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 새로운 세포의 용 해 버퍼의 도입을 통해 3%로 50%에서 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 최소화 하기 위해 수정 되었습니다.

ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

이 수정된 ATAC-seq 프로토콜은 미토콘드리아 판독을 50%에서 3% 미만으로 감소시키는 새로운 용해 완충제에 도입되어 미토콘드리아 오염이 감소하여 연구원이 시퀀싱 비용의 50% 감소로 보다 효율적인 ATAC-seq를 수행할 수 있게 합니다. 우리는 인간 1 차적인 PBMC, 인간 1 차적인 단핵구, 마우스 수지상 세포 및 흑색종 세포 주에 있는 이 새로운 ATAC-seq 프로토콜을 검증했습니다. 우리는 그것이 세포 모형의 넓은 범위에서 효과적일 것이라고 믿습니다.세포 활성화 및 선택 프로세스 중 샘플 손실을 최소화하는 것은 ATAC-seq로 고품질 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 우리는 기본 실험실 장비를 사용하여 귀중한 견본에서 세포의 작은 수를 취급하는 방법을 보여줄 것입니다. 먼저 이전에 격리된 CD4+T 셀의 유리병을 37도 의 수조에서 해동하여 얼음이 녹을 때까지 해동하십시오.그런 다음 세포를 15밀리리터 원내 튜브로 부드럽게 이송하여 9밀리리터의 완전 RPMI를 함유하고 있습니다. 세포를 1, 500배, 섭씨 4도에서 6분간 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 버리고 완전한 RPMI의 2 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.원심분리를 반복한 후, 상체를 버리고, 완전한 RPMI의 0.5 밀리리터에서 세포를 부드럽게 재보페한다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 완전한 RPMI를 사용하여, 96웰 의 둥근 바닥 플레이트의 웰 당 200 마이크로 리터에 플레이트 50, 000 CD4 +셀에 셀 서스펜션 밀도를 조정합니다.그런 다음, 자기 구슬을 준비하기 위해, 1.5 밀리리터 튜브에 ATAC-seq 샘플 당 인간 T-액티베이터 CD3/CD28 구슬의 알리쿼트 12.5 마이크로리터. 튜브에 1x PBS1 밀리리터를 넣고 자석에 1분간 놓아 구슬을 씻습니다. 클리어 상체를 조심스럽게 제거하고 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다.ATAC-seq 샘플당 완전한 RPMI의 13 마이크로리터에서 구슬을 재보선합니다. 조정된 농도로 CD4+T 세포를 활성화하려면 15밀리리터 원컬 튜브에서 완전한 RPMI 배지의 2.1 밀리리터에서 500, 000 세포를 수집합니다. 인간 T-액티베이터 구슬 12.5 마이크로리터를 넣고, 이전 단계에서 준비하고 세척한 후 튜브를 반전시켜 부드럽게 섞습니다.그런 다음 구슬로 세포를 멸균 저수지로 부드럽게 옮기십시오. 다중 채널 파이펫을 사용하여, 라운드 하단 96 웰 플레이트의 웰 당 구슬이있는 세포의 200 마이크로 리터를 플레이트, 37도 섭씨, 48 시간 동안 5 %CO2 인큐베이터에서 배양. 완전한 인큐베이션 후, 접시를 423배 G, 실온으로 8분간 원심분리합니다.비드 손실을 확인하기 위해 각 우물에서 100 마이크로 리터의 매체를 제거하고 폐기하기 전에 원문 튜브에서 수집합니다. 그런 다음 나머지 100 마이크로 리터의 세포 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 튜브에서 모든 것을 수집합니다. CD4+세포를 격리하려면 미리 세척된 CD4 컨쥬게이드 구슬 50마이크로리터를 500개, 000셀을 완전한 RPMI의 1밀리리터에 넣고 혼합을 반전시다.섭씨 4도에서 20분 간 배양하고, 6분마다 손으로 쓸어넘기면 섞어보겠습니다. 상류체가 명확해질 때까지 2분간 자석에 튜브를 놓고 제거하고 버립니다. 자석에서 튜브를 제거합니다.PBS의 1밀리리터와 2%FCS로 비드 바운드 셀을 세척하고 튜브를 1분 동안 자석에 다시 놓습니다. 명확한 상체를 버리고 총 세 번의 세 가지 세정을 위해이 과정을 반복합니다. 마지막 세척 후, 1 분 동안 자석에 튜브를 배치합니다.그것을 제거하고 상체를 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 핵 절연을 수행하기 위해, 차가운 용해 완충제의 50 마이크로 리터에서 구슬과 세포를 재연하고, 원심분리기는 섭씨 4도인 500G에서 즉시 10분 동안 재연한다. 상체를 제거하고 폐기합니다.트랜스포지아제 반응을 수행하기 위해, Tn5 트랜스포지아제 믹스의 50 마이크로리터로 격리된 핵 펠릿을 재보종한다. 온도 37도에서 30분 동안 열순환기를 배양하고 뚜껑은 섭씨 40도로 설정된 다음 완료되면 섭씨 4도에서 유지하십시오. 열사이클링 직후 빠른 벤치 탑 원심분리기 스핀다운을 수행합니다.제품에서 구슬을 제거하기 위해 자석에 튜브를 1 분 동안 놓습니다. 자석에서 튜브를 제거하지 않고 명확한 상체를 DNA 정화 컬럼으로 옮기십시오. PB 버퍼 250 마이크로리터로 한 번, PE 버퍼 750 마이크로리터로 두 번 컬럼을 세척합니다.그런 다음 용출 버퍼 10 마이크로리터를 추가하여 샘플을 엘로우트합니다. 뉴클레아제없는 PCR 튜브에 초기 PCR 증폭 반응을 설정합니다. PCR 튜브를 열순환기에 넣고 PCR 증폭 프로그램을 실행합니다.그런 다음 원고에 설명된 대로 PCR 반응의 나머지 45 마이크로리터의 최종 PCR 증폭을 완료합니다. PCR 튜브를 열순환기에 배치하고 프로그램을 실행합니다. 완전한 증폭 후 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정리 키트를 사용하여 라이브러리를 정수하여 용출 버퍼의 25 마이크로리터를 용출합니다.준비된 라이브러리를 차세대 시퀀서에 시퀀서에 시퀀서당 평균 읽기 깊이 4,200만 개에 시퀀스합니다. 이 향상된 ATAC-seq 프로토콜은 시퀀싱을 위해 마이크로리터 당 1나노그램 이상의 최종 라이브러리를 생성했습니다. 품질 관리는 200과 1 사이의 DNA 단편을 보여주었으며, 000 개의 기본 쌍, 그리고 이러한 고품질 라이브러리와 함께 추가 시퀀싱이 수행되었다.이 프로토콜에 따라 준비된 라이브러리는 3%의 미토콘드리아 오염만 을 보였다. 사용 가능한 읽기의 높은 비율은 생물학적 복제에 걸쳐 충분히 일정합니다. 이 프로토콜은 생물학적 복제뿐만 아니라 기술적 복제에 걸쳐 매우 재현 가능한 결과를 제공했습니다.또한 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 1주일 이상이 아닌 48시간이 걸렸으며, 그 결과 재현 가능한 시퀀싱 결과에 의해 입증된 일관되고 효율적인 활성화가 이루어졌습니다. 또한 분석 파이프라인에서 예측된 ATAC-seq 피크를 정확하게 호출했습니다. 시퀀싱 결과 분석은 인간 T 세포 활성화 도중 크로마틴 상태에 있는 명확한 변경을 밝혔습니다.개방 된 크로마틴의 차별화 접근 영역은 활성화 후 6 개의 샘플과 48 시간 사이에 확인되었습니다. 핵 리시스 반응이 냉기 시약 및 재료로 수행되어 그대로 핵의 회복을 극대화하도록 하십시오. 우리의 변형 된 핵 리시스 버퍼는 세포에 온화하고, 미토콘드리아 DNA를 오염 최소화.우리는 또한 단 하나 핵 ATAC-seq에 적용되는 이 수정한 용해 완충을 기대합니다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 감소된 비용으로 더 높은 품질의 ATAC-seq 데이터를 생성할 수 있다는 것을 알고 있으며, 후성 유전학 분야를 전달하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 빠르며 위험한 시약이나 계측기를 필요로 하지 않으므로 ATAC-seq에 새로 액세스할 수 있습니다.

atac-seq-assay-with-low-mitochondrial-dna-contamination-from-primary

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq)와 결합 하 여 염색 하는 Transposase 액세스할 수 질에 대 한 분석 결과 액세스할 수 chromatin를 폭로 하는 게놈 넓은 방법입니다. 이 인간의 세포 (Th1/Th2)에 최적화 된 최종 계산 분석, 분자에서 단계별 ATAC seq 프로토콜입니다. 이 프로토콜 차세대 시퀀싱 방법 사전 경험 없이 연구자에 의해 채택 될 수 있다.

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

여기 우리는 동시에 quantitate 의무가 메서드와 알칼리 가수분해와 후속 5´-엔드 genomic DNA의 효소 분열을 결합 하 여 단일 뉴클레오티드 해상도 높은 그대로 DNA에 게놈 넓은 지도 ribonucleotides 설명 시퀀싱.

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

대사 적응은 분화, 지속성 및 세포 독성을 지시하기 때문에 T 세포의 기본입니다. 여기서, 생체외 사이토카인-분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡을 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜이 제시된다.

사이토카인 분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡의 실시간 모니터링

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.

암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화

파이로시퀀싱 분석은 이형질 세포 또는 조직에서 미토콘드리아 DNA 단일 뉴클레오티드 다형성의 강력하고 신속한 유전형 분석을 가능하게 합니다.

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

이 프로토콜은 종양 형성 과정에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위한 도구로서 현탁액 성장 암세포에서 사이브리드를 생성하는 기술을 설명합니다.

암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

mtDNA 합성 및 분포를 검출하고 정량화하기 위해 다중 웰 플레이트 형식 및 자동화된 면역형광 이미징을 사용하여 세포에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 대사의 역학을 연구하는 절차가 설명되어 있습니다. 이것은 mtDNA 대사에 대한 다양한 억제제, 세포 스트레스 및 유전자 침묵의 효과를 조사하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

CD8 T 세포 생체 에너지학은 Mito Stress Test를 사용하여 조사할 수 있습니다. 이 방법론은 급성 및 만성 대사 프로그래밍을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 T 세포 수용체 생물학과 생체 에너지 분석 간의 관계를 조사하는 접근 방식을 설명합니다.

Naive 및 Effector CD8 T 세포의 미토콘드리아 기능 측정

면역 세포에서 생리학적으로 관련된 기질 농도 하에서 미토콘드리아 생체 에너지학을 연구하는 방법은 제한적입니다. 당사는 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 인간 T 세포, 단핵구 및 말초 단핵 세포의 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 막 전위의 반응 변화를 평가하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 면역 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 동적 변화를 평가하기 위한 고분해능 폐활량 측정법

이 원고는 최적의 호중구 생존력과 높은 라이브러리 품질을 보장하는 것을 목표로 쥐 골수에서 호중구의 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. BMC 준비, 면역자기 분류 및 라이브러리 구축에 대한 단계별 지침을 제공하여 특히 호중구 연구를 처음 접하는 사람들에게 유용한 가이드 역할을 합니다.

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils(쥐 골수 유래 호중구의 ATAC-Seq 라이브러리 준비)

학습하세요 인간 CD4+ T 세포에서 미토콘드리아 DNA 오염을 50%에서 3% 미만으로 감소시키는 개선된 ATAC-seq 프로토콜을. 이 방법은 염색질 가용성 연구의 데이터 품질과 비용 효율성을 높입니다.

ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염

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