Name: 글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 배우세요 PEG 하이드로겔을 이용한 세포 MMP 및 대사 활성 측정 방법을. 형광 센서와 마이크로플레이트 리더를 사용하여 3D 배양 환경에서 세포 기능을 직접 분석할 수 있습니다.

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저자는 오하이오 암 연구 (OCR), 오,이 작품을 자금에 대 한 미국 킹 사우드 대학 (KSU), 리야드, 첫 번째 작가 후원을 위한 KSA 인정 하 고 싶습니다. 매트릭스 지원, 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI) 캠퍼스 화학 악기 센터 질량 분석 및 단백질의 도움으로 질량 분석을 사용 하 여 형광 펩 티 드 센서의 분자량 측정 오하이오 주립 대학에서 시설입니다.

1. 하이드로 겔 구성 요소 준비
<ol><li>음성 합성 설명으로 형광 효소 분해 펩 티 드 다른8, 형광 분자 처럼 fluorescein와 dabcyl는 끄는으로 활용. 10 m m의 농도에 DMSO에 펩 티 드와 반복된 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 작은 (~ 30 µ L) aliquots에서-80 ° C 냉동 고에서 저장소를 분해. 참고: 이러한 펩 티이 드가 상업적으로 구입할 수도 있습니다. 이 프로토콜에는 C 터미널 시스테인을 하이드로 겔 폴리머 네트워크에 공유 결합 수 있도록 펩 티 드 순서에 필요 합니다.</li>
	<li>8 팔 40 kDa 폴 리 (에틸렌 글리콜) 아민 (PEG) 준비-norbornene (NB)로17설명. 보다 큰 1H NMR을 사용 하 여 90%의 끝 그룹 기능화를 확인 합니다. 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 25 %w / v 및-80 ° C 냉장고 (~ 300 µ L) aliquots에 있는 저장소에에서 말뚝-NB를 분해. 참고: 못 공업화와 norbornene을 또한 상업적으로 구입할 수 있습니다.</li>
	<li>18설명 되어 있는 대로 사진 초기자 리튬 페 닐 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (무릎) 음성 합성. 메 마른 물 68 m m의 농도에 무릎을 녹이 고 (~ 300 µ L) aliquots에서-80 ° C 냉동 고에 저장. 참고: 대 안으로 서, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)는 사진-개시자로 사용할 수 있습니다. 무릎 및 Irgacure는 상업적으로 구입할 수 있습니다.</li>
	<li>MMP 분해 펩 티 드 crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK)와 살 균 물 200 m m와 100 m m의 농도에 세포 접착 펩타이드 (CRGDS)를 각각, 해산 하 고 (~ 300 µ L와 ~ 30 µ L)-80 ° C 냉동 고에 저장 aliquots, 각각.</li>
</ol>2. 분석 결과 미디어 준비
<ol><li>열 비활성화 준비, 숯불 박탈 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) MMP 분석 결과 대 한: 참고: FBS 프로 테아 MMP 분석 결과;와 높은 배경 신호를 생성할 수 있습니다. 따라서, 그것은 열 비활성화 하 고 숯을 권장 분석 결과 미디어 FBS 스트립.<ol>
<li>55 ° c.에 30 분 동안가 열 하 여 100 mL FBS의 비활성화 참고: FBS의 100 mL aliquoting 및 나중에 사용-20 ° C에서 저장 여기 이용 되었다. 필요에 따라 작은 볼륨을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>활성 탄 및 0.025 %w / v dextran의 0.25 %w / v FBS (약 5 mL)의 작은 금액을 추가 하 고 슬러리를 형성 될 때까지 저 어. 그런 다음는 FBS의 나머지를 추가 하 고 55 ° c.에 30 분 동안 저 어</li>
		<li>4 ° c.에 20 분 동안 1,962 x g 에서 원심 분리기 그런 다음 다른 용기에는 상쾌한 전송.</li>
		<li>2.1.2 단계를 반복 하지만 2.1.3 단계 뒤 37 ° C에. 0.45 μ m 필터 다음 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 상쾌한 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 결과 미디어 준비 FBS, 2 mM L-글루타민, 10 U/mL 페니실린, 10 µ g/mL 스 박탈 1% 숯으로 보충 하는 미디어를 사용 하 여. 참고: 미디어 페 놀 레드 없이 더 적은 형광 방해가지고 있기 때문에 좋습니다. 다른 추가 인슐린, 성장 인자 등의 분석 결과 미디어 등. 만큼 흡수도 추가 될 수 있습니다 및 형광 스펙트럼 봉우리 센서 (494 nm/521 nm)와 중첩 되지 않습니다.</li>
	<li>희석 세균성 콜라 효소 긍정적인 컨트롤로 10과 1000 µ g/mL 분석 결과 미디어에서에서 나를 입력 합니다.</li>
</ol>3. 하이드로 겔 준비와 세포 캡슐화
<ol><li>하이드로 겔 전조 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>다음 순서로 1.5 mL 튜브, vortexing 각 부품의 추가 후에 시 약을 추가: 20 mM 8 팔 40 kDa 못 NB, 12.75 m m crosslinker MMP 분해 펩 티 드, 17.8 m m NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM 무릎, 및 0.25 m m fluorogenic MMP 분해 펩 티 드. 주: 표 1 보여줍니다 히드로 전조 솔루션 내용, 재고 농도, 작업 농도, 볼륨 계산 수식 및 필요한 볼륨 히드로 전조 솔루션을 실시 하기에 충분 한 120 µ L를 만드는 데 필요한는 10 hydrogels 실험. Pipetting으로 히드로 솔루션의 손실에 대 한 계정, 총 볼륨 20% 증가. 상업적인 펩 티 드 종종; 산 성 염화 수소 솔루션 제공 따라서, NaOH는 7의 최종 pH를 달성 하기 위해 추가 됩니다. 마지막 해결책의 pH는 사용자에 의해 확인 되어야 한다.</li>
		<li>여러 1.5 mL 튜브에 나눌 히드로 전조 솔루션 테스트 조건 당 1 개의 관. 참고: 셀의 추가 없이 hydrogels 준비가 여러 제어 조건 건의 된다. 부정적인 제어를 위한 fluorogenic 센서의 일반적인 저하에 대 한 계정에 한 하이드로 겔 상태 수 알을 품 차량 제어 또는 혼자 실험 미디어 처리 조건이 없는 경우. 긍정적인 통제와 실험 사이 교정 hydrogels fluorogenic 센서를 쪼개 다 알려진 효소와 incubated 수 있습니다. 예를 들어 세균 콜라의 2 농도 여기 사용 되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydrogels 셀을 캡슐화 합니다.<ol>
<li>사용 중인 셀 형식에 대 한 적절 한 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 예를 들어 10 mL의 PBS로 A375 흑색 종 세포의 10 cm 접시 세척. 0.05% 트립 신을 사용 하 여 셀을 trypsinize 하 고 37 ° C, 5% CO2 3 분 수 셀 전체 휴대폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에서 품 어.</li>
		<li>314 x g 3 분에 셀 솔루션 원심, 문화 미디어, 발음 다음 다시 약 3 배 높은 필요한 시드 밀도 실험에 대 한에 PBS에 셀을 일시 중단 합니다. 예를 들어 21 x 106 세포의 밀도와 세포 현 탁 액 여기 7 x 106 셀/mL의 최종 캡슐화 된 밀도 달성 하기 위해 사용 되었다.</li>
		<li>다시는 정확한 셀 농도 되도록 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>필요한 시드 밀도 (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7 x 106 셀/mL이이 예제에서)에 따라 하이드로 겔 전조 솔루션의 각 튜브를 일시 중단 된 세포와 PBS를 추가 합니다. 일시 중단 된 셀 대신 셀 조건에 PBS를 추가 합니다. 참고: 모든 조건을 히드로 구성 요소 사이의 비율을 보장 하기 위해 동일한 최종 히드로 전조 솔루션 볼륨 있고 PBS는 일정. 그들의 세포, 플라스틱 전조 솔루션을 혼합 하기 위하여 거품을 만들지 않고 적극적으로 아래로 소용돌이 관 하지 마십시오.</li>
		<li>팁은 분배 하는 동안 각 잘 가운데 중심으로 보장 아래 96 잘 접시 라운드 무 균 블랙에 히드로 전조 솔루션의 10 µ L을 분배.</li>
		<li>3 분 4 mW/cm2 울트라 바이올렛 (UV) 빛 접시를 노출 하 여 하이드로 겔 전조 솔루션 유해. 참고: UV 램프 (UVL 56 휴대용 UV 램프, UVP, 고지대, 캘리포니아) 긴 UV 파장에서 자외선 빛을 생산 (365 nm),이 세포 생존에 영향을 주지 않습니다.</li>
		<li>캡슐화 된 셀 없이 긍정적인 제어 조건 제외한 모든 우물에 분석 결과 미디어의 150 µ L를 추가 합니다. 긍정적인 컨트롤에 콜라 효소 솔루션의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>인큐베이션 기간 동안 증발을 줄이기 위해 플레이트의 외부 우물에 PBS의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MMP와 대사 활동 측정
<ol><li>형광 측정 기준 형광 측정 설정 히드로 합에 균일 하 바로 후 캡슐화. 형광 microplate를 사용 하 여 접시를 읽고 리더 면적 불투명 96 잘 접시 프로토콜을 활용 하 여 스캔 494 nm/521 nm (여기/방출)에. 이 읽기 0 h를 될 것입니다.</li>
	<li>18 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에 접시를 품 어.</li>
	<li>1:10 (v/v) 각 잘 대사 활동 시 약 (resazurin)를 추가 합니다.</li>
	<li>추가 6 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에 접시를 품 어. 참고:이 보육 시간 셀 유형에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>24 시간 후 캡슐화에 형광을 측정 합니다. 형광 microplate를 사용 하 여 접시를 읽고 면적 불투명 96 잘 접시 프로토콜을 활용 하는 리더 MMP 활동 494 nm/521 nm (여기/방출) 및 560 nm/590 nm (여기/방출) 신진 대사 활동에 대 한 설정을 검색 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

3 차원 생체 외에서 세포 배양이 vivo에서 환경의 많은 중요 한 측면. 그러나, 3D 문화 또한 사정 세포 기능을 만들고 도전 신호, 많은 생물학 분석 실험 필요 셀룰러 검색 및 셀의 큰 숫자. 따라서, 개발 추가 샘플 없이 세포질 기능의 측정을 가능 하 게 간단한 3D 문화 시스템의 처리 크게 증가 시킬 것입니다 3D 문화 시스템의 유틸리티. 여기서 설명 하는 3D 시스템은 다양 한 다른 응용 프로그램에 대 한 적용할 수 있습니다. 다른 프로 테아 제를 감지 하는 fluorogenic 센서의 순서를 변경할 수 있습니다. 예를 들어, fluorogenic 쪼갤 센서 시퀀스 (GPQG↓IWGQK)는 MMP-1 죽 습 수 있습니다-2,-3,-7,-8, 및 9-, 이전 chemotherapeutics22에 대 한 응답 흑색 MMP 활동을 검출 하기 위하여 이용 되었다. PEG 하이드로 겔 시스템의 사용은 또한 기계적 성질, 분해성, 그리고 매트릭스 접착 moieties는 히드로 내를 포함...

3 차원 (3D) 문화 시스템 종종 더 밀접 하 게 전통적인 2 차원 (2D) 문화 시스템 보다 vivo에서 세포 응답을 정리, 여러 우수한 간행물1,2,3 참조 . 그러나, 세포 기능을 측정 하기 위해 3D 문화 시스템을 활용 하 여 셀룰러 검색의 어려움 때문에 도전 되 고 추가 처리. 이 어려움 3 차원 배양 시스템에서 많은 세포 기능 측정을 제한합니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 새로운 기술을 쉽게 측정 3D 환경에서 셀 함수를 사용할 수 있는 필요. 이 필요 해결 하기 위해 한 가지 방법은 세포 기능을 측정 하는 센서 뿐 아니라 3D 세포 배양을 지원 뿐만 아니라 재료의 개발 이다. 예를 들어 여러 하이드로 겔 시스템 fluorogenic 효소 쪼갤 moieties 3D 환경4,5,,67프로 테아 제 활동의 시각화 수 있도록 통합 했습니다. 이러한 시스템은 원래 현미경 이미징에 대 한 활용 하 고, 하는 동안 이러한 시스템도 3D에 셀 함수의 손쉬운 측정을 사용 하면 표준 플레이트 리더를 사용 하 여 글로벌 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 활동 분석에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 환경8.
MMPs, 아연 프로 테아 제, superfamily 정상 조직의 항상성 그리고 많은 질병에 중요 한 역할을 재생합니다. MMPs 저하와 세포 외 기질 (ECM) 개장, 세포 표면 수용 체, cytokines를 쪼개 고 다른 MMPs9,10활성화. MMPs 상처 치유 등 생리 적 과정에 고 등 관절염, 동맥 경화, Alzheimer, 암 ( 9,,1011리뷰 참조) 질병에 중요 한 역할을 재생 합니다. 암, MMP 식 상부는 암 전이 및 빈약한 예 지12와 강하게 상관 된다. 또한, MMPs 암 세포 내 습 및 마이그레이션, 본질적으로 3D 현상13,14는 세포질 과정을 홍보 하 여 종양 진행에 기여 한다. 따라서, 근본적인 생물학 연구 및 약물 분석 검사를 포함 하 여 많은 문맥에서 3 차원 문화에 MMP 활동을 측정 하는 능력에 많은 관심이 있다.
그들의 높은 함량으로 인해 3D 세포 배양, 단백질 흡착, 및 가변 자연 저항을 못 hydrogels 널리 사용 됩니다. 못 hydrogels 있다 되어 기능성 moieties 직접 세포 기능에의 번호와 같이 RGD, 같은 RLD, IKVAV 세포 접착을 촉진 또는 변형 성장 인자-β (TGF-β) 등 성장 요인의 tethering 직접 ECM 모방 펩 티 드와 15,16. 더 최근에, 말뚝 hydrogels 있다 되어 기능성 잘5,8로 세포 기능 측정을 사용할 수 있는 센서 펩 티 드와 함께. 특히, PEG 하이드로 겔 시스템의 사용 fluorogenic 표준 플레이트 리더와 3D 문화에서 셀룰러 MMP 활동의 MMP 분해 펩 티 드 활성화 측정으로 기능성 고 아니 추가 처리 하는 데 필요한. 이러한 시스템은 또한 신진 대사 활동을 포함 하 여 세포질 기능의 다른 측정에 호환 됩니다. 여기, 프로토콜은 3D 못 하이드로 겔 fluorogenic MMP 분해 펩타이드와 기능성된 및이의 사용에 필요한 초기 최적화 실험을 보여주는 제시 결과에서 경작 하는 세포의 MMP 활동의 측정에 대 한 설명 분석 결과입니다. 인간 흑색 종 세포 (A375) 시드 범위 내에 있는 작업 분석 결과의 적절 한 시드 밀도 결정 하는 밀도의 범위 fluorogenic hydrogels에 캡슐화 되었습니다. 캡슐화의 24 h 후 MMP와 대사 활동 측정 했다 표준 microplate 리더를 활용 하 여. 다음, MMP 활동 분석 결과의 선형 범위 내에서 시드 밀도 결정 하는 신진 대사 활동을 정상화 했다. 마지막으로, 내부 플레이트 계수의 편차 백분율 (%CV) 얻은 결과의 재현성을 반영 하기 위해 triplicates 사이 계산 했다. 이 메서드는 간단 하 고 빠른 3D 세포 배양, 그리고 최소한의 샘플 처리와 프로 테아 제 활동의 쉽게 측정을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1X 인산염 완충 식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>활성탄&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3345</td><td></td></tr><tr><td>블랙 라운드 바닥 96웰 플레이트</td><td>Brand-Tech</td><td>89093-600</td><td></td></tr><tr><td>세포 접착 펩타이드(CRGDS)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td></td>맞춤형</tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 I&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당 미디어</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)&nbsp;</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>형광 마이크로플레이트 리더&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Cytation 3</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MMP-분해성 펩타이드 교차결합제(KCGPQG&darr; IWGQCK)</td><td>GenScript USA Inc.</td> (영문)<td>맞춤 제작</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 /스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin (Alamar Blue)</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>UV light&nbsp;</td><td>재질 보기 UVP</td><td>95-0006-02</td><td></td></tr></tbody></table>

글로벌 세포 매트릭스 metalloproteinase 및 3d hydrogels 신진 대사 활동 측정

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

3 차원 (3D) 세포 배양 시스템 종종 더 자세히 정리 vivo에서 세포 반응과 기능 전통적인 2 차원 (2D) 문화 시스템 보다. 그러나, 세포 기능 3D 문화에서의 측정은 종종 더 많은 도전. 많은 생물학 분석 실험 3D 문화에 어려울 수 있는 셀룰러 자료의 검색을 해야 합니다. 이 문제를 해결 하기 위해 한 가지 방법은 셀 함수는 재료 내에서 측정을 가능 하 게 새로운 자료를 개발 하는 것입니다. 여기, 96 잘 형태로 3D hydrogels에서 셀룰러 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 활동의 측정에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 이 시스템에서는, poly(ethylene glycol) (PEG) 하이드로 겔은 기능성 fluorogenic MMP 쪼갤 센서. 세포질 MMP 활동 형광 강도에 비례 하 고 표준 microplate 리더와 측정 될 수 있다. 소형화 96 잘 형식이 분석 결과의 분석 결과의 이전 24 잘 버전에 비해 조건 당 80 %50 %와 시 약 사용에 의해 실험 설정에 필요한 시간을 감소. 이 분석 결과 또한 세포질 기능의 다른 측정에 호환 됩니다. 예를 들어 대사 활동 분석 결과 시연입니다 여기, MMP 활동 측정 같은 히드로 내 동시에 실시 될 수 있습니다. 분석 결과 시드 밀도 분석 결과의 작업 범위에 대 한 적절 한 캡슐화 밀도 결정 하는 셀의 범위에 걸쳐 캡슐화 인간 흑색 종 세포와 함께 설명 했다. 셀 캡슐화의 24 h 후 MMP와 대사 활동 표시기 셀 시드 밀도에 비례 했다. 분석 결과 한 fluorogenic 분해성 기판으로 여기 설명 된다, 하는 동안 분석 결과 및 방법론 수 있습니다 다양 한 하이드로 겔 시스템 및 다른 형광 센서에 대 한 적응. 이러한 분석 결과 다양 한 응용 프로그램에 대 한 실용적인, 효율적이 고 쉽게 접근할 수 있는 3D 자란 플랫폼을 제공.

현재 분석 결과 fluorogenic MMP 쪼갤 센서8공업화 이전 개발 및 특징이 3D 히드로 문화 시스템에서 적응 시켰다. 여기에 사용 되는 fluorogenic MMP 센서 GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C, 펩 티 드 순서의 구성 (↓ 나타냅니다 분열 사이트)는 이전 MMP-14 및 MMP 1119분열에 대 한 최적화 되었습니다. 펩 티 드 (fluorescein) 형광 분자와 분열 사이트 (그림 1)의 양쪽에 끄는 분자 (dabcyl)으로 표시 됩니다. 노출 되 면 fluorogenic 센서의 적절 한 효소에, fluorophore 및 끄는 구분 하 고 형광 증가 한다. 여기, 분석 결과 96 잘 접시 형식으로 캡슐화 프로세스의 여러 단계를 제거 하 고 50% 하 여 실험을 수행 하는 데 필요한 시...

여기, 프로토콜 캡슐화 및 poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fluorogenic 매트릭스 metalloproteinase (MMP)와 기능성된에 세포 배양에 대 한 제시는-분해 펩 티 드. 세포질 MMP와 대사 활동 표준 microplate 리더를 사용 하 여 하이드로 겔 문화에서 직접 측정 됩니다.

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

3D 배양은 표준 생물학적 측정을 사용하여 세포 기능을 측정하는 것을 더 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 형광 센서와 표준 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 추가 샘플 처리 없이 세포 및 체세포 활성을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량 약물 검사를 포함하여 새로운 응용 프로그램의 수를 가능하게합니다.또한 형광 센서는 다른 센서와 교환하여 다른 프로테아제 또는 세포 기능을 측정할 수 있습니다. 실험을 미리 신중하게 계획하고, 하이드로겔 준비를 위한 모든 계산을 완료하고, 모든 장비와 시약을 설치하여 세포가 현탁액에 있는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 시작하려면, 1%의 숯이 제거된 태아 소 세럼, 2m L-글루타민, 페니실린 mL 당 10단위, 연쇄상 구균의 mL 당 10 마이크로그램으로 분석 매체를 준비하십시오.형광 간섭이 더 많은 페놀 레드 미디어를 사용하지 마십시오. 긍정적인 대조군을 만들려면, 세균성 콜라게나아제 효소 타입 1을 분석 매체에 10 및 1000 마이크로그램의 농도로 추가하십시오. 다음으로, 시약을 1.5mL 튜브에 추가하여 하이드로겔 전구체 용액을 준비한다.각 구성 요소를 추가한 후 소용돌이를 피하십시오. 그런 다음 용액을 여러 가지 조건에 대해 여러 1.5 mL 튜브로 나눕니다. 하이드로겔에 세포를 캡슐화하기 위해 먼저 PBS 10mL로 A375 흑색종 세포의 10cm 접시를 세척하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.그런 다음, 접시에 0.05 %의 트립신을 추가하여 세포를 시험합니다. 3분간 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 접시를 배양합니다. 잠복 후 혈종계로 세포를 계산합니다.다음으로, 세포 용액을 3분 동안 314회 G로 원심분리합니다. 배양 배지를 흡인하고, PBS 버퍼에서 세포를 최종 캡슐화된 밀도의 약 3배로 재보선한다. 정확한 세포 농도를 보장하기 위해 세포를 다시 계산합니다.이어서, 필요한 시딩 밀도에 따라 하이드로겔 전구체 용액의 각 튜브에 PBS에 부유 된 세포를 추가하고, 위아래로 파이펫팅하여 혼합한다. 제어된 조건의 경우 PBS와 소용돌이만 추가합니다. 다음으로, 하이드로겔 전구체 용액의 파이펫 10 마이크로리터는 멸균, 블랙, 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰의 중간에 들어갑니다.우물 내의 하이드로겔 배치를 시각적으로 검사합니다. 비중심 하이드로겔은 중합화 전에 파이펫 팁을 사용하여 재배치할 수 있다. 하이드로겔 전구체 용액을 중합하려면 플레이트를 평방 센티미터당 4밀리와트에서 3분 동안 UV 광에 노출시하십시오.다음으로, 캡슐화된 세포를 포함하는 모든 웰에 분석 매체의 150마이크로리터와 콜라게나아제 효소 용액 150마이크로리터를 양성 대조군의 유분에 추가한다. 150 마이크로리터의 PBS 버퍼를 플레이트의 외부 우물에 추가하여 인큐베이션 중 증발을 줄입니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트의 형광 강도를 0시간 에서 측정하고 즉시 캡슐화를 게시합니다.494 나노미터 여기, 521 나노미터 방출 파장을 가진 불투명 96 웰 플레이트 프로토콜을 선택합니다. 다음으로, 18시간 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 모든 조건 및 컨트롤에 대해 잘 당 1- 10 부피 비율로 대사 활성 시약을 추가합니다.플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 6시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 플레이트의 형광 강도를 24시간, 캡슐화 후지에서 측정합니다. MMP 활성을 위해 불투명 96 웰 플레이트 프로토콜을 선택하여 494나노미터 외발, 521나노미터 방출 파장을 선택한다.대사 활성을 측정하려면 560 나노미터 외야 및 590 나노미터 방출 파장을 선택합니다. 이 연구에서는, 적절한 프로테아제에 형광 센서가 노출되면, 담종과 형광이 분리되고 형광이 증가합니다. 세균 콜라게나아제 효소 타입 1을 가진 배양된 하이드로겔의 형광 측정은, 가장 낮은 검출된 신호가 콜라게나아제 없이 음성 대조군에 의해 생성된다는 것을 보여줍니다.가장 높은 검출 된 신호는 콜라게나아제 이상의 mL 당 1000 마이크로 그램에 의해 생성되었지만 신호가 고원되기 시작할 때. 계산된 근로 범위는 콜라게나아제의 mL 당 약 0.16에서 474 마이크로그램이었다. 캡슐화 직후 밀도 범위에서 캡슐화된 A375 흑색종 세포주형에 대한 형광 수치는 종자 밀도에 걸쳐 낮았으며, 예상대로 세포가 없는 젤을 제어하는 것과 유사했다.캡슐화 후 24시간, MMP 활성은 종자 밀도에 직접 비례했으며, mL당 100만 개 이상의 세포에서 파종 밀도는 근로 범위의 한계에 속한다. A375 세포주들의 대사 활성 측정은 세포 파종 밀도에 직접 비례하였다. MMP 활성을 대사 활성으로 정상화시킴으로써, mL당 200만 개 이상의 세포보다 큰 종자 밀도에서 세포당 MMP 활성에 유의한 차이가 없었다.적절한 파이펫팅 기술이 중요합니다. 여기에는 점성 솔루션의 정확한 볼륨을 달성하기 위한 사전 습윤 팁이 포함됩니다. 또한, 하이드로겔 전구체 용액을 웰 내에서 중심으로 플레이트 판독기의 정확한 측정을 달성하는 것이 중요합니다.여기에서 측정된 MMP 활동에 기여하는 특정 MmP를 식별하기 위해 서부 블롯 또는 PCR과 같은 식 소방법을 사용할 수 있습니다. 살아있는 세포의 사용은 적절한 생체 안전 절차, 무균 기술 및 생물학적 안전 캐비닛이 필요합니다. 자외선은 위험하며, 보호막을 사용하여 사용자를 보호하며, 빛을 직접 바라지 않습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

이 비디오는 내피 세포를 통한 세포 외 기질 강성 의존성 리스테리아 모노사이토제네스 전파를 평가하기 위한 정량적 타임 랩스 현미경을 보여줍니다. 더 부드러운 하이드로겔은 더 단단한 하이드로겔에 비해 내피 세포를 통한 더 빠른 박테리아 전파를 촉진하며, 이는 박테리아 전파에 대한 매트릭스 강성의 영향을 강조합니다.

세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

배우세요 PEG 하이드로겔을 이용한 세포 MMP 및 대사 활성 측정 방법을. 형광 센서와 마이크로플레이트 리더를 사용하여 3D 배양 환경에서 세포 기능을 직접 분석할 수 있습니다.

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

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