Name: 절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 배우세요 자기 세포 분리를 이용하여 쥐 비장에서 CD11c 양성 수지상 세포를 분리하고 입양 전송하는 방법을. 고혈압 및 심혈관 질환 연구에 활용할 수 있는 이 기술은 면역 세포 기능 연구에 필수적입니다.

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이 작품에 의해 지원 되었다 미국 심 혼 협회 부여 POST290900 N.R.B., L.X. 및 건강의 국가 학회 17SDG33670829 부여 K01HL130497 ak로

밴 더 빌 트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인 했습니다. 마우스는 보관 및 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박 가이드에 대 한 걱정. 수정된 2010)입니다.
1입니다. 마우스에서 Spleens의 격리
<ol><li>1640 RPMI 준비: 10 %FBS, 0.10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol와 1% 페니실린/스.</li>
	<li>10-12 주를 안락사-오래 된 공동2 흡입에 의해 남성 마우스 C57bl/6. 가슴 및 마우스의 70% 에탄올 스프레이. 왼쪽된 측면에서 조심 스럽게 열고 피부 노출 비장 복 막 구멍.</li>
	<li>신중 하 게 마우스의 왼쪽에 창 고 간 이동 작은 집게를 사용 하 고 부드럽게 잘가 위를 사용 하 여 삭제할 비장. 참고: 이 단계를 수행 해야 합니다 매우 신중 하 게 위장 손상 오염을 일으킬 수 있다.</li>
	<li>장소 각 레이블이 15 mL 원뿔 튜브 포함 된 RPMI 1640 매체의 3 mL에에서 비장 excised.</li>
</ol>2. 세대 Spleens에서 단일 셀 정지의
참고: 비장은 기계적 분리 및 효소 소화를 결합 하 여 단일 세포 현 탁 액에 해리 했다 수 있습니다.
<ol><li>콜라 (1 mg/mL; 0.29 U/mg 동결 건조 된) D를 추가 하 여 비장 소화 솔루션을 준비 하 고 DNase I (0.1 mg/mL)를 준비 RPMI 1640 매체 (단계 1.1 참조)</li>
	<li>집게를 사용 하 여 전송 비장의 소화 솔루션의 3 mL를 포함 하는 C 관 (분리 관)에 비장.</li>
	<li>
제조업체의 지침에 따라 반자동된 균질 화기를 사용 하 여 기계적 분리를 수행 합니다.
	<ol>
<li>C 튜브 회전 팔에 밀접 하 게 배치 되도록 보장 하는 반자동된 균질 화기에 C 튜브를 놓습니다. C 관 배치 되 면 60 비장 04.01 프로토콜 실행 균질 하는 반자동된 화기에 시작 버튼을 누르면 s. 참고: 기계적 분리 50 mL 원뿔 튜브 위에 40 μ m 필터를 배치 하 고 부드럽게 필터를 통해 비장을 연 삭 하 여 수행할 수 있습니다. 비장을 연 삭, 후 통해 RPMI 미디어의 10 mL와 함께 40 µ m 필터를 헹 굴.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기계적 분리 후는 균질 화기에서 튜브를 분리 하 고 효소 소화를 수행 합니다. 연속 회전 (20 rpm)에서 37 ° C에서 15 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>40 µ m 스 트레이너를 통해 필터링 후 50 mL 원뿔 튜브에 pipetting 솔루션을 전송. Dulbecco의 PBS (dPBS) 10 mL와 40 µ m 여과기를 세척. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포를 원심</li>
	<li>원심, 후는 상쾌한을 완전히 발음 하 고 dPBS의 10 ml에서 resuspending 하 여 펠 릿을 세척 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기</li>
</ol>3. 절연 CD11c의+ 비장 단일 세포 현 탁 액에서 Dc
<ol><li>셀 펠 릿 dPBS의 5 ml에서 resuspend과 hemocytometer 고 trypan를 사용 하 여 셀 수를 계산 제외 블루.</li>
	<li>작은 셀 공의 centrifuging 300 x g, 4 ° c.에서 10 분에 의해</li>
	<li>완전히는 상쾌한 발음 하 고 자석으로 활성화 된 세포 분류 (Mac) 버퍼의 400 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>1 x 108 셀 당 CD11c microbeads ( 재료의 표참조)의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>소용돌이 셀 서 스 펜 션 및 4 ° c.에 냉장고에 10 분 동안 품 어</li>
	<li>세포를 씻어 맥 버퍼의 10 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기</li>
	<li>완전히는 상쾌한 발음 하 고 맥 버퍼의 500 µ L에서 resuspend.</li>
</ol>4. 자력 분리 CD11c의+ Dc
참고: 자력 분리를 수동으로 수행 하 여 마그네틱 분리기 LS 열 복 ( 재료의 표참조). 자력 분리 또한 자동 자석 분리기 자동으로 수행할 수 있습니다. ( 재료의 표참조).
<ol><li>맥 구분 하 고 각 열 흐름 통해 수집을 아래 15 mL 원뿔 튜브의 자기장에 LS 열을 배치 합니다.</li>
	<li>LS 열 버퍼의 3 mL을 씻어.</li>
	<li>각 LS 열에 세포 현 탁 액 놓고는 흐름-통해 레이블이 셀을 포함 하는 수집 합니다.</li>
	<li>맥에서 버퍼를 통과 하는 레이블된 셀을 수집의 3 mL와 함께 LS 열 세척. 워시 LS 열 2 번 더.</li>
	<li>자석 분리기에서 LS 열을 제거 합니다. 각 열에 맥 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 즉시 깨끗 한 15 mL 원뿔 튜브로 LS 열을 단단히 폭락 여 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시. 참고: 그것은 순도 세포 현 탁 액을 얻기 위해 CD11c 셀의 이중 절연을 수행 해야 합니다. 따라서, 단계 3.1 4.5 통해 반복 합니다. 고 순도 표준을 위한 그림 4 를 참조. 이 단계는 CD11c의 순도 향상+ 90-95% 세포.</li>
	<li>
CD11c 결정+ DC hemocytometer trypan 블루 제외를 사용 하 여에 번호. 0.4 %trypan 블루 솔루션에서 1:1 희석에 셀 샘플을 희석. 참고: 비 실행 가능한 세포 물 들일 것 이다 파랑, 가능한 셀 흠 없는 유지 됩니다.<ol>
<li>이렇게 하려면 신중 하 게는 hemocytometer 셀 샘플 희석의 10 µ L로를 1 분 동안 품 어.</li>
		<li>셀 가능한 휴대폰 번호를 확인 하려면 로드 된 챔버에 1 x 1 m m2 의 4 제곱을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. CD11c의 체 외가 염 치료에+ Dc
<ol><li>10 %FBS, 0.1 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol 및 1% 페니실린/스 500 mL 1640에 추가 하 여 DC 문화 매체를 준비 RPMI.</li>
	<li>NaCl의 1.17 g으로 무게와 살 균 50 mL 송 골 매 관에 그것을 배치 하 여 10 배 DC 높은 소금 세포 배양 (400mm)를 준비 합니다. 솔루션에는 NaCl은 때까지 50 mL 팔 콘 튜브와 소용돌이를 살 균의 DC 세포 배양 (단계 5.1에서에서 준비) 50 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>바로 셀 문화 후드에서 0.2 μ m 필터를 통해 진공 여과 사용 하 여 높은 소금 DC 문화 미디어 필터링.</li>
	<li>4ºC에서 10 분 동안 300 x g 에서 spleens에서 각 세포 현 탁 액 원심 1 x 106 셀/mL의 농도에서 DC 문화 미디어에서 각 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>900 μ (약 1 x 106 셀) 24-잘 플랫 바닥 팔 콘 접시에에서 DC 서 스 펜 션의 플라스틱 각 잘 190 m m의 최종 나트륨 농도 높은 소금 DC 문화 미디어의 100 µ L를 추가 합니다. 접시를 분류 하 고 37 ° C에서 48 h에 대 한 공동2 인큐베이터 humified.</li>
</ol>6. 입양 전송 높은 소금 처리 CD11c+ Dc
<ol><li>48 h에 대 한 생체 외에서 자극 후 제거 37 ° C에서 접시 humified CO2 배양 기.</li>
	<li>플라스틱 셀 문화 미디어 및 resuspend는 CD11c 아래로+ Dc. 피펫은 모든 CD11c+ DC는 해당 정지 표시 1.6 mL 튜브. 도금도 각각에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>각 CD11c 원심+ DC 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안 정지 상쾌한 발음 살 균 dPBS의 100 µ L로 DC 펠 릿 resuspend</li>
	<li>그리기 DC 1 mL 주사기 27 G ½ 인치 바늘으로 장착으로 현 탁 액.</li>
	<li>순진한 남성 10 주 된 C57bl/6 쥐 2% 아래 배치 isoflurane 안정적인 수술 비행기를 달성 하기 위해. 페달 반사의 부족으로 마 취의 수준을 확인 합니다. 일단 안정적인 수술 비행기를 달성 천천히 그리고 신중 하 게 바늘에 소개 약 30 °의 각도에서 복고풍 궤도 공간. 참고: 27 G 니 들의 경사 눈 손상을 방지 하기 위해 눈에서, 가리키고 해야 합니다.</li>
	<li>천천히 그리고 부드럽게 주사는 CD11c+ DC 서 스 펜 션 (약 1 x 106 셀). 주입이 완료 되 면 조심 스럽게 눈을 손상 하지 의식 하 고 복고 궤도 공간 바늘 제거. 참고: 후 주입, 거기 있어야 거의 없거나 전혀 없는 출혈. CD11c의 입양 전송+ Dc도 수행할 수 주입 (예: 꼬리 정 맥)의 I.V. 메서드를 사용 하 여. 컨트롤 마우스 받을 CD11c+ 일반 소금 미디어에서 경작 했다 Dc.</li>
	<li>코 콘에서 쥐를 제거 하 고 마 취에서 회복 하는 동안 약 30 분 동안 그들을 감시.</li>
</ol>7. 14 일 낮은 복용량 Angiotensin II의 준비 (140 ng/kg/min)
<ol><li>추가 하 여 5 M NaCl의 500 μ 그리고 아세트산의 300 μ angiotensin II 버퍼를 준비 합니다. 양자 Satis (QS) 이온된 H20의 최대 30 mL.</li>
	<li>Angiotensin II 5 mg/mL angiotensin II 버퍼 재고 솔루션을 디졸브. 최종 농도 삼 투 minipump angiotensin II 각 마우스의 몸 무게에 따라 140 ng/kg/min의 속도 제공할 것입니다 달성 하기 위해 추가 버퍼 angiotensin II 재고 솔루션을 희석. 참고: 필수 Angiotensin II (mg) = (마우스 무게 (g) x 0.2 mg/일 x 14 일) / 1000 Angiotensin II (mg) 준비 (필수 angiotensin II x 260 µ L) = / 펌프 속도 (0.25 μ/hr) Angiotensin II 재고 볼륨 (μ) = 준비 angiotensin II 재고 농도 (5 mg/mL) x 1,000 / 볼륨 (μ)를 희석 270-angiotensin II 재고량 =</li>
	<li>Angiotensin II 재고 볼륨은 희석을 추가 (angiotensin II 버퍼) 단계 7.2에서에서 계산 하는 볼륨에 따라.</li>
	<li>살 균 세포 문화 후드 삼투성 minipump을 엽니다.</li>
	<li>희석된 angiotensin II 솔루션을 추가 하 고 주사기와 바늘에서 모든 공기를 추방. 삼 투 minipump에의 하단에 제공 된 바늘을 삽입 하 고 천천히 천천히, 그리고 신중 하 게 방광에서 바늘을 제거 하는 동안 angiotensin II 솔루션을 주입.</li>
	<li>삼 투 minipump 머리에 삽입 삼투성 방광 완벽 하 게, 안 공기를 얻기 위해 어떤 방광에 주목.</li>
</ol>8. 14 일 낮은 복용량 Angiotensin II 삼 투 Minipumps의 주입
<ol><li>CD11c 입양 이전 후 10 일+ Dc, 마 취를 시작 하 고 다음 마우스를 지속적으로 달성 하 고 유지는 적절 한 수술 평면 2 %isoflurane 받을 코 콘 이동 isoflurane 챔버에 장소 마우스.</li>
	<li>수술 사이트를 준비 하는 목의 등 쪽 측에 따라서 모피를 제거 합니다. 수술의 시작 이전에 7.5 %betadine 뒤 70% 에탄올과 면도 영역을 청소.</li>
	<li>피부에 작은 절 개 (약 1.5 c m)를 만듭니다. 삼 투 minipump에의 배치를 위한 피하 주머니 만들려고 절 개에 hemostats를 삽입 합니다.</li>
	<li>피하 포켓에는 minipump를 삽입 합니다. 가까운 피부 2-3 외과 스테이플 상처와 상처에 7.5 %betadine 다른 응용 프로그램을 적용 하 고 감염을 방지 하기 위해 스테이플.</li>
	<li>마 취에서 그들의 감 금 소에 그들을 반환 하기 전에 복구 하는 동안 30-60 분에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 참고: 마우스 필요 삼투성 minipump의 이식 후 3-4 일까지 모니터링.</li>
</ol>9. 절연 Spleens 흐름 Cytometric 분석에 대 한 받는 사람 마우스의의
<ol><li>14 일 낮은 복용량 angiotensin II 주입에의 격리 후 마우스 생체 외에서 높은 소금 수신에서 spleens 입양 송금으로 Dc 취급. (단계 1 및 2) 위에 나열 된 정확한 단계를 따릅니다.</li>
</ol>10. 표면 얼룩
<ol><li>
폴리스 티 렌 FACS 튜브 및 4 ° c.에 8 분 350 x g 에서 원심 분리기로 1 x PBS에서 resuspended는 splenocytes 전송 원심 분리 후 상쾌한 발음. 맥 버퍼와 원심 분리 (350 x g, 8 분, 4 ° C)의 1 mL로 두 번 세척.
	<ol>
<li>원하는 흐름 cytometric 패널의 수에 따라 다른 폴리스 티 렌 FACS 튜브에는 splenocytes를 동등 하 게 나눕니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>라이브/죽은 세포 생존 얼룩을 수행 하려면 1 x PBS와 원심 분리기 (350 x g, 8 분, 4 ° C) 셀 세척. 1 x PBS의 1 mL에 resuspend 및 세포 생존 능력의 1 µ L 추가 얼룩 (자료 표 참조). 4 ° C에서 15 분 동안 품 어 (냉장고 또는 얼음에) 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일에 커버.</li>
	<li>세포 생존 능력 얼룩의 부 화, 중 맥 버퍼의 적절 한 볼륨에 얼룩이 지는 세포 표면에 대 한 항 체의 칵테일을 준비 합니다.</li>
	<li>맥에서 버퍼, (350 x g, 8 분, 4 ° C), 원심 분리기의 1 mL로 세포 세척 하 고 항 체 칵테일의 100 µ L 각 셀 펠 릿 resuspend. 4 ° c.에 30 분 동안 빛에서 보호 품 어 참고: 각 흐름 cytometry 항 체는 독특한, 그리고 그것은 매우 유용 하 고 권장 복용량 적정 곡선 각 특정 항 체에 대 한 수행 하 여 필요한 항 체의 최적 크기를 결정.</li>
	<li>맥에서 버퍼의 1 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 맥 버퍼의 적절 한 금액에는 splenocytes를 resuspend.</li>
</ol>

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</ol>

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현재 프로토콜에서 우리 CD11c 분리 하는 절차를 최적화+ Dc spleens 마우스 및 adoptively에서 순진한 동물 소금 유발 고혈압에 Dc의 역할을 연구 하기에 그들을 전송. 이 프로토콜은 격리 하 고 adoptively 대 식 세포, T와 B 림프 톨을 포함 하 여 적응 면역 세포, monocytes, 등 다른 면역 세포 하위 집합을 전송 적용할 수 있습니다. 우리는 적절 한 세포 생존 및 DC 표면 식 마커의 안정성 비장 소화 프로세스를 최적화 했습니다. 또한, 우리는 최적의 DC 생존에 대 한 높은 나트륨 murine Dc의 생체 외에서 자극에 대 한 프로토콜을 최적화 했습니다.
이 프로토콜에서 중요 한 단계는 자기 세포 분류. 자기 세포 분류 질병에 면역 세포의 기능을 공부에 대 한 특정 murine 종류를 분리 하는 강력 하 고 편리한 도구입니다. 그러나, 그것 기반으로 기본 셀 표면 식 마커 CD11c를 포함 하 여 하나 이상의 면역 세...

식이 과잉 소금은 고혈압에 대 한 주요 위험 요소. 1 , 그러나 2 미국 심장 협회 권장 최대 2300 밀리 그램 (mg)의 하루 나트륨 (Na+) 섭취; 미국 인구의 10% 미만 관찰이 추천. 3 , 4 나+ 입구에 있는 겸손 한 감소 혈압을 낮출 하 고 20%로 관상 동맥 심장 질환과 뇌졸중은 미국에서의 매년 새로운 사례를 감소. 5 과잉 소금 소비와 주요 문제는 고혈압 인구의 50% 소금 감도, 전시 나+ 로드 또는 혈압에 비슷한 드롭 없음후 다음 혈압에서 10 mmHg 증가 정의 + 제한 및 diuresis. 6 소금 감도 또한 normotensive 개인의 25%에서 발생 하 고 심장 혈관 사건 및 죽음의 독립적인 예측 이다. 7 , 8 소금 감지 메커니즘 신장과 관련 된 고혈압에 잘 공부 되었다; 그러나, 최근 연구는 면역 세포 나+을 느낄 수 있다 건의 한다. 9 , 10
최근의 증거는 여분 신장 Na+ 에 변경 처리는 interstitium에 나+ 의 축적을 일으킬 수 있으며 염증 촉진 제안 합니다. 11 , 12 우리의 실험실과 다른 사람으로 나타났습니다 모두 타고 난 및 적응형 면역 체계의 세포 고혈압의 악화에 기여. 9 , 13 , 14 , 15 다양 한 성 자극, angiotensin II, 노르, 그리고 소금 원인 세포, monocytes 그리고 신장, 맥 관 구조에 침투 나+ 보존, vasoconstriction, 혈압을 추진 하 고 T 림프 톨을 포함 하 여 고도 고 끝-장기 손상입니다. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 이전 연구에서 우리는 발견 Dc isolevuglandin (IsoLG) 축적-단백질 adducts angiotensin II 및 DOCA 소금 고혈압을 포함 한 다양 한 성 자극에 대 한 응답에서. 14 IsoLGs lysines 단백질에 게 신속 하 고 covalently adduct 지질 과산화의 반응성이 매우 높은 제품 이며 그들의 축적은 DC 활성화와 관련. 우리는 최근 높은 Na+ IsoLG 단백질에 대 한 강력한 자극은 설립 14 adduct에 Dc에 Dc.9 나+ 항목은 amiloride 민감한 전송기를 통해 중재 murine 형성. 나+ Na+/Ca2 + 교환기를 통해 칼슘 (캘리포니아2 +)에 대 한 다음 교환 됩니다. 캘리포니아2 + 활성화 단백질 키 니 아 제 C (PKC) 증가 초과 (2O·-)로 이어지는 NADPH 산화 효소를 활성화 하 고 IsoLG 단백질 adduct 형성. 9 응답 angiotensin II의 하위 pressor 복용량으로 Dc 소수 고혈압 소금 노출의 입양 양도. 9
CD11c의+ Dc 조직에서 이전 immunohistochemistry RT-PCR, 제한 되었으며 Dc의 절연 cytometry 정렬 셀으로 제한 되었습니다. 교류 cytometry 셀 정렬 면역 세포의 고립에 대 한 강력한 방법 이지만, 값이 비싼, 시간이 걸리는, 이며 실행 가능한 세포의 낮은 수익률을 리드. 따라서, 우리 조직 소화, 생체 외에서 자극 및 CD11c의 입양 전송 단계 프로토콜 최적화+ 고혈압 연구 Dc.

<table><tbody><tr><td>APC/Cy7 안티-마우스 CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 러닝 버퍼&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>CD11c MicroBeads 초순수&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-108-338</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 칼슘과 마그네슘 없음</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp; 130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103108</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS 해리기 장치</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>사용 프로토콜 : Spleen 04.01</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable 바이올렛 사각 세포 염색 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACs 분리기&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 중간&nbsp;</td><td>깁코</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

초과 규정식 소금 입구 염증에 기여 하 고 고혈압의 개발에 중요 한 역할을 한다. 우리는 이전 수지상 세포 항 원 선물 (DCs) 높은 extracellular 나트륨 NADPH 산화 효소의 활성화 및 isolevuglandin (IsoLG)의 형성을 느낄 수 있다 발견-단백질 adducts. 이러한 IsoLG 단백질 adducts 자기 단백질 반응 고 상태 처럼 자가 면역 질환 및 고혈압. 우리가 개발 하 고 고혈압에 DC 기능 연구-의 상태--예술 방법 최적화. 여기, 상세한 프로토콜을 제공 격리에서 높은 나트륨와 murine 비장 CD11c 입양 이전 체 외 치료 고혈압에 그들의 역할을 공부 하는 받는 사람 쥐로+ 세포.

그림 1 설명 단계 위의 회로도를 나타냅니다. 절연된 murine spleens CD11c 정렬 됩니다+ 마그네틱 셀 정렬 및 48 h. CD11c 일반 소금 미디어 (NS; 150 mmol NaCl) 또는 높은 소금 미디어 (HS; 190 mmol NaCl) 도금에 의해 Dc+ Dc 복고풍 궤도 adoptively 전송한 다음 순진한 받는 사람 쥐 하는 주입 10 일 후, 마우스는 14 일에 대 한 낮은 복용량 angiotensin II (140 ng/kg/min) 주입을 위한 삼 투 minipumps로 이식. Angiotensin II의 14 일간 주입, 동안 혈압 라디오 원격 또는 꼬리 팔목 plethysmography 기록 됩니다.
일반적인 혈압 분석 표시 됩니다 ...

여기, 선물이 자기 세포 분류와 순진한 쥐로 후속 입양 전송 murine spleens에서 수지상 세포를 분리 하는 프로토콜. 높은 소금 활성화 수지상 세포의 모델 입양 전송 및 cytometry의 단계별 절차를 설명 하기 위해 선택 되었다.

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

이 방법은 CD11c 양성 수지상 세포의 연구 결과 및 고혈압 상해의 역할을 어떻게 강화하는지를 포함하여 고혈압 및 심혈관 질환 분야의 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고체 기관에서 CD11c 양성 수지상 세포의 격리와 다양한 질병 상태에서의 생리적 역할의 연구입니다. 따라서 이 과정은 B 림프구, T 림프구, 단세포 및 대식세포를 포함한 다중 면역 세포 유형에 적용 될 수 있습니다.이 기술의 시각화는 수지상 세포 격리, 특히 수용자 마우스로의 입양 전달 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 시작하려면 안락사 마우스의 가슴과 측면을 70 %에탄올로 스프레이하십시오. 왼쪽에, 조심스럽게 비장을 노출피부와 복막 구멍을 엽니 다.작은 집게를 사용하여 창자와 간을 마우스의 왼쪽으로 조심스럽게 이동합니다. 그런 다음 작은 가위를 사용하여 비장을 부드럽게 절제합니다. 각 소비제 비장을 RPMI 1640 배지 3밀리리터가 들어 있는 라벨이 부착된 C 튜브에 넣습니다.먼저 콜라게나아제 D와 DNase를 추가하여 RPMI 1640 배지를 준비하여 비장 소화 용액을 준비합니다. C 튜브를 반자동 균질화기에 놓고 튜브가 회전 암에 단단히 배치되도록 합니다. 균질화의 시작 버튼을 눌러 비장 04.01 프로토콜을 60초 동안 실행합니다.그 후 균질화에서 튜브를 분리하고 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 20rpm에서 연속하여 배양합니다. 다음으로 파이펫을 사용하여 40 마이크로미터 여과기를 통해 용액을 50 밀리리터 원유형 튜브로 전송합니다. dPBS의 10 밀리리터로 여과기를 씻으세요.세포를 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 슈퍼 나탄을 완전히 흡인하고 dPBS의 10 밀리리터에서 다시 중단하여 펠릿을 씻으십시오. 원심 분리는 300 배 g와 섭씨 4도에서 10 분 동안 서스펜션을 분리합니다.dPBS의 5밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 혈전계와 Trypan 파란색 제외를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 다음 원심분리기는 300배, 섭씨 4도에서 10분간 세포를 펠릿합니다.슈퍼네티를 완전히 흡인시키고 자기 활성화 된 세포 선별 버퍼의 400 밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 1억 개의 세포당 CD11c 마이크로비드 100밀리리터를 추가합니다. 셀 서스펜션을 소용돌이시키고 섭씨 4도의 냉장고에서 10분 동안 배양합니다.그 후, 10 밀리리터의 MACs 버퍼를 추가하여 세포와 원심분리기를 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 세척합니다. 슈퍼나탈자를 완전히 흡인시키고 500밀리리터의 MACs 버퍼에서 세포를 다시 일시 중단합니다. LS 컬럼클을 매그 분리기의 자기장에 놓고 각 컬럼 아래에 15밀리리터 원원형 튜브를 배치하여 흐름을 수집합니다.다음으로, 버퍼의 세 밀리리터와 열을 헹지. 셀 현탁액을 각 컬럼에 놓고 레이블이 없는 셀이 포함된 흐름을 수집합니다. 3밀리리터의 MACs 버퍼로 컬럼을 세척하고 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다.세척당 3밀리리터의 MACs 버퍼를 사용하여 LS 컬럼을 2회 추가로 세척합니다. 이 후 자기 분리기에서 LS 열을 제거합니다. 각 컬럼에 5밀리리터의 MACs 버퍼를 추가하고 각 컬럼을 투명한 15 밀리리터 원판 튜브로 즉시 급락하여 자기 라벨이 부착된 세포를 플러시합니다.혈변계 및 Trypan 파란색 제외를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 CD11c 양수 DC 번호를 결정합니다. 그런 다음 0.4%의 Trypan blue 용액에서 1 대 1 희석으로 셀 샘플을 희석시 희석합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DC 배양 매체에서 셀 펠릿을 준비합니다.24웰 플랫 하단 팔콘 플레이트에 DC 서스펜션의 파이펫 900 마이크로 리터. 190 밀리머의 최종 나트륨 농도에 대한 각 우물에 높은 소금 DC 배양 매체의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 접시에 라벨을 부착하고 48시간 동안 섭씨 37도의 가습된 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다.48 시간 후에 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 셀 배양 배지를 단일 웰위아래로 통해 CD11c 양성 DC를 다시 중단합니다.도금된 각 개인에 대해 이 것을 반복합니다. 모든 튜브는 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 모든 튜브를 원심분리합니다. 100 마이크로리터의 멸균 dPBS로 수퍼를 흡인하고 DC 펠릿을 다시 중단합니다.다음으로, 27 게이지 반인치 바늘이 장착된 튜브 중 하나에서 DC 용액을 1밀리리터 주사기로 그립니다. 순진한 남성 10 주 오래 된 C57-블랙-6 마우스 아래 2%이소플루란 을 배치 하 고 안정적인 수술 평면을 달성 하. 페달 반사의 부족으로 마취의 수준을 확인합니다.안정적인 수술 평면이 달성되면, 천천히 조심스럽게 약 30도의 각도로 복고풍 궤도 공간에 바늘을 소개합니다. CD11c 포지티브 DC 서스펜션을 천천히 원활하게 주입합니다. 주사가 완료되면, 조심스럽게 눈을 손상시키지 않도록, 복고풍 궤도 공간에 대한 바늘을 제거합니다.그런 다음 코 콘에서 마우스를 제거하고 마취에서 회복하는 동안 약 30 분 동안 모니터링하십시오. 대표적인 혈압 분석은 낮은 용량의 안지오텐신 II 주입을 위해 이식된 DC 및 삼투성 미니 펌프의 양상 전달 에 따라 여기에 나타난다. 안지오텐신 II의 이 낮은 복용량은 정상 마우스에 있는 혈압을 증가시키지 않는 억제제 복용량이다는 것을 주의해야 합니다.정상적인 염분 처리 CD11c 양성 DC를 받는 마우스는 주입 중에 정상적인 혈압을 유지하며, 고염 처리 CD11c 양성 DC를 받는 마우스는 수축기 혈압의 증가를 나타낸다. 유동 세포측정 분석은 상기 분리된 CD11c 양성 세포의 순도를 결정하기 위해 여기에 도시된 게이팅 전략을 활용하여 수행된다. CD11c 양성 세포의 농축이 증가하면 총 비장세포에 비해 볼 수 있습니다.다른 CD11c 마이크로비드 농도는 제조업체의 프로토콜을 해결하는 데 활용됩니다. 마이크로비드 100 마이크로리터를 사용한 비장 세포의 자석 분리는 CD11c 양수 세포의 약 65%를 산출하며, 200마이크로리터를 사용하면 55%를 산출하고 300마이크로리터를 사용하면 50%의 FcR 차단제가 Microbeads 100 마이크로리터와 함께 포함되어 있습니다. 자기 분리 후, FcR의 봉쇄는 약 65%의 CD11c 양성 세포를 산출한다.몇몇 비장 구체는 그 때 마이크로비드의 100 마이크로리터로 배양되고 LS 컬럼을 통해 자기로 분리됩니다. 분리된 세포는 CD11c의 추가 100 마이크로리터로 배양되고 LS 컬럼을 통해 다시 분리된다. 이 이중 격리 과정은 92%CD11c 양성 세포를 산출했습니다.이 절차를 시도할 때, 혈류 세포측정에 의해 격리된 세포의 순도를 확인하는 것이 중요하다. 수지상 세포의 자기 격리에 따라 그들은 프로테오믹스 및 단세포 염열을 포함한 분자 기술에 의해 활성화 상태를 결정하기 위해 배양될 수 있다. 그것의 발달 부터, 그것은 지금 고혈압에 있는 수지상 세포의 기능 그리고 특정 역할을 공부하는 것이 가능합니다.연구원은 지금 고혈압에 있는 특정 항원탐구하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

유도 및 항원에 특정한 T 세포의 확장을위한 새로운 DC 독립적인 방법을 설명합니다. HLA A2 - IG 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)을 효율적으로 다양한 항원 특이성의 CTL 확장 HLA - A2 제한 펩티드와 함께로드됩니다. 이 기술은 CTL 기반 입양 immunotherapy에 대한 잠재력을 보유하고 있습니다.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

이 동영상은 면역조절 약리제를 사용하여 수지상 세포(DC)를 허용 DC(TolDC)로 변환하는 방법을 보여줍니다. 이 변환은 CD4+ T 세포에 대한 면역억제 효과를 통해 TolDC 기능을 평가하여 확인됩니다.

수지상 세포와 CD4+ T 세포 사이의 상호 작용에 대한 면역조절 약리학적 제제의 효과

이 비디오는 고염 처리된 항원 제시 수지상 세포(DC)를 마우스로 입양하는 절차를 보여줍니다. 쥐 CD11c+ 수지상 세포(DC)는 다량의 나트륨을 함유한 배지에 노출되어 세포에서 이소레부글란딘(IsoLG)-단백질 부가물을 형성합니다. 이러한 부가물은 신생항원 역할을 하며 DC 표면에 표시됩니다. 고염 처리된 세포는 입양 세포 전달을 통해 마우스에 주입됩니다.

수지상 세포의 고염 처리 및 마우스로의 채택 전달 방법

종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

여기에서 우리는 창자 호밍 조절 T 세포 유도의 생체 내 확대를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 수지상 세포는 활성 비타민 D (1,25-디하이드록시 비타민 D 또는 1,25 [OH]2D) 및 활성 비타민 A (레티노산 또는 RA) 드 노보의 고농도를 국부적으로 생산하도록 설계되었습니다.

내장 호밍 규제 T 세포 유도의 생체 내 확대

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

배우세요 자기 세포 분리를 이용하여 쥐 비장에서 CD11c 양성 수지상 세포를 분리하고 입양 전송하는 방법을. 고혈압 및 심혈관 질환 연구에 활용할 수 있는 이 기술은 면역 세포 기능 연구에 필수적입니다.

절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

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