Name: 건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/Stromal 세포 Osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 중간엽 줄기세포의 골형성 분화를 강화하는 전기자극 챔버 구축 방법을. 6공 배양 플레이트와 백금 전극을 활용한 이 프로토콜은 저렴하고 재사용 가능하며 뼈 조직 공학 연구에 효과적입니다.

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이 작품은 AO 기초 시작 그랜트 (S-14-03 H) 및 프랑크푸르트, 독일에에서 본사를 둔 Friedrichsheim 재단 (재단 Friedrichsheim) 부분에서 지원 되었다.

1. 전기 자극 세포 문화 챔버의 건설
<ol><li>표준 6-잘 세포 배양 배지;의 두 뚜껑 수집 EStim 챔버를 빌드하려면 99.99% 백 금 철사, 직경 0.5-1의 길이 60 cm m m; 코팅 구리 와이어, 0.6 m m;의 직경을 가진 길이에서 70 cm 건설 클램프; 납땜 장비; 초전도 접착제;의 한 관 1 와이어 터미널 블록 커넥터, 6 개의 작은 2.2 V Led (옵션); 스테인레스 실리콘 접착제 (선택 사항); 코팅의 1 개의 관 검은 절연 테이프;의 한 롤 표준, 유연한, 절연 구리 전선 (0.14 m m2), 2 m 길이 (자료의 테이블).</li>
	<li>6 잘 플레이트 뚜껑, 마크와 다음 드릴 두 구멍 (~ 1 m m의 직경), 25 m m 6의 각각의 외부 가장자리 근처에 떨어져 우물 (총에서 12 구멍), 1A, B 그림에서 같이.</li>
	<li>클램프와 백 금 철사의 12 5 cm 길이 잘라. L-모양, 한쪽 길이 3 m를 떠나으로 수동으로 전선의 각 구 부하 고는 다른 2 cm. 두 35 cm 길이에 실버 코팅 와이어를 잘라.</li>
	<li>1 개의 백 금 철사의 더 긴 (3 cm) 구부러진 끝 (에서 밖으로 내부) 각 드릴된 구멍에 1-2 m m, 뚜껑의 외부에서 튀어나와 떠나 구 부 집게를 사용 하 여. 초전도 접착제 뚜껑 구멍에 백 금 철사를 장악 하 고 약 6 h 동안 건조를 두고.</li>
	<li>(그는 나중에 음극 역할 참조 하십시오 그림 1A) 모든 6 개의 백 금 철사의 팁 솔더 실버 코팅 와이어 중 뚜껑에서 튀어나와. 다른 실버 코팅 와이어를 (그는 나중에 역할을 양극) 나머지 6 개의 백 금 철사를 납땜 하는 동일한 절차를 반복 합니다.<ol>
<li>(선택 사항) 실험 동안 기능을 확인 하려면 6 양극-음극 백 금 전극 쌍 사이 회로에 Led를 추가 합니다. 각 LED 빛 (그림 1C) 문화 접시에 있는 세포를 노출 방지 하기 위해 주도 아래 검은 절연 테이프의 조각을 넣으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>와이어 터미널 블록 커넥터 6 잘 플레이트 뚜껑의 왼쪽된 위 모퉁이를 접착제와 두 실버 코팅 와이어 그림 1C에서 같이 입력된 단자에 연결 하십시오.</li>
	<li>(그림 1B, 뚜껑 Nr. 2) 첫 번째 뚜껑에 터미널 블록 커넥터에 맞게 두 번째 6 잘 플레이트 뚜껑의 왼쪽된 위 모퉁이에서 20 m m x 20 m m 섹션을 잘라. 전극, 두 번째 뚜껑을 갖춘 첫 번째 뚜껑을 커버 하 고 접착 테이프와 함께 테이프.<ol>
<li>를 개선 하기 위해 두 개의 뚜껑의 접합 실리콘 접착제 코팅 (선택 사항)을 사용 합니다. 이렇게 하려면 실리콘 접착제의 3-5 m m 층은 전극으로 뚜껑을 커버 하 고 다른 뚜껑, 12 h 건조 접착제에 대 한 수 있도록 그것을 커버.</li>
	</ol>
</li>
	<li>와이어 커넥터와 바나나 남성 커넥터 (4 mm)을 다른 끝의 출력 단자를 2 개의 표준 절연된 구리 철사의 한쪽 끝을 연결 합니다. 참고:이 전선의 길이 어디 셀 지켜질 것 이다, 인큐베이터 (그림 1D) 외부 전원 공급 장치에는 인큐베이터에 선반에서 거리에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>(전압) 복용량을 조정 하 고 처방 EStim의 DC 전원 공급 장치를 조절 하 여 세포에 전달.<ol>
<li>전면 패널에 ON/OFF 버튼을 눌러 전원 공급 장치를 켭니다. 버튼 1을 누르면 채널 1을 활성화 합니다.</li>
		<li>버튼 Nr. 4 (V-집합) 전압 설정을 누릅니다. 프레스 버튼 2, . 2.5 V. 프레스 Enter에 부하 출력 설정 5 .</li>
		<li>2.5 V의 출력 로드 되도록 (2500 mV) 다음, 단순화 된 방정식에 따라 100 mV/mm의 EStim에 해당. V EStim = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg"> ; 또는 V = VEStim × d 여기, V = 밀리; 출력 전원 공급 전압 d = 밀리미터; 전극 사이의 거리 V EStim 밀리미터 당 밀리에 자극 전압 =. 참고:이 단순화 일정 DC 전압의 경우에 적용 됩니다. 매체와 세포 사이의 저항 전극 셀;와 직접 접촉에서 하지 않습니다 무시할 수는 대신, EStim 매체를 통해 세포에 전달 된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 중간 엽 줄기 세포 문화 osteogenic 매체에
<ol><li>구입 하 고 실험의 날까지 액체 질소에 상용 쥐 MSCs ( 재료의 표참조)를 저장 합니다. 또는 프로토콜에 따라 다른 동물에서 MSCs 분리 실험 동물의 사용에 대 한 지역 기관 규정7,8 다른 곳에서 출판.</li>
	<li>실험 당일, 액체 질소 저장에서 MSCs의 한 유리병 (1 x 106 세포)를 제거 하 고 신속 하 게 (1 분) 이내 37 ° c.에 preheated 물 욕조에 세포를 해 동<ol>
<li>층 류 흐름 후드에서 무 균 조건 하에서 50 mL 팔 콘 튜브로 유리병 콘텐츠를 플라스틱 고 정상 매체 (NM) 37 ° c, Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM; 1 x)으로 구성 된 prewarmed의 9 mL 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 추가 페니실린/스 솔루션입니다. 300 x g에서 원심 분리 하 여 5 분에 대 한 셀을 펠 렛.</li>
		<li>층 류 두건에는 상쾌한을 제거 하 고 신중 하 게 37 ° c.에 prewarmed NM의 12 mL에서 셀 펠 릿 resuspend Resuspended 셀 T-75 세포 배양 플라스 크를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(약 3-5 일 후)는 80%-90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 에 셀 문화.</li>
	<li>셀 통로 참고: 층 류 두건에 원심 분리 및 무 균 조건 하에서 부 화를 제외 하 고 모든 작업을 수행 합니다.<ol>
<li>도달 후 80%-90% 합류, 세포 분리 솔루션으로 셀을 검색 합니다. 세포 배양 매체 발음, 세척 2 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 세포 분리 솔루션, x 1의 5 mL을 추가 하 고 5 분 동안 인큐베이터에 셀을 반환.</li>
		<li>일단 셀 분리는 분리 솔루션 비활성화 문화 매체의 동일한 금액을 추가 합니다. 50 mL 팔 콘 튜브에 세포를 수집 하 고 5 분 동안 300 x g 에서 그들을 회전.</li>
		<li>매체를 삭제 하 고 셀 신선한 일반 매체의 1 mL에 resuspend. Trypan 푸른 얼룩 가능한 셀의 개수를 평가 합니다.</li>
		<li>씨앗 1 x 106 셀 prewarmed NM의 12 mL와 함께 새로운 T-75 플라스 크에. 80%-90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 에 셀 문화. 참고: 셀 뿌리고 (단계 2.4.1–2.4.4) 반복할 수 있습니다 몇 번 셀의 필요한 수를 얻을 때까지. 통로 8 보다 오래 된 세포를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>씨앗 9 x 10 NM (10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스, DMEM) 문화 6 잘 플레이트의 각 잘에서 3 mL에4 셀. 37 ° C, 5% CO2, 5% O2에 1 일에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>다음 날, 문화 매체를 발음 하 고 osteogenic 차별화 매체 (OM, 일반 매체와 10-7 M dexamethasone, 10 m m β-glycerophosphate, 0.05 m m ascorbic 산-2-인산 보충)의 3 mL을 적용 합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트 세포와 인큐베이터에 배치 하 고 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 에서 밤새 품 어.</li>
</ol>3. 치료 EStim와 MSCs
<ol><li>셀 EStim 처리 됩니다 하루에 30 분;에 대 한 70% 에탄올 용액에서 전극 소독 그런 다음, 추가 30 분에 대 한 캐비닛 안전에 자외선에서 그들을 건조.</li>
	<li>층 류 흐름 후드에서 커버 뚜껑 장착 전극, 전극 완전히 중간에 빠져들 다는 것을 확인 된 교양된 MSCs를 포함 6 잘 플레이트 (필요한 경우, 추가 매체). 인큐베이터에 셀으로 덮여 6 잘 플레이트 (EStim 챔버)를 전송 및 전원 공급 장치에는 와이어를 연결.</li>
	<li>2.5 V 부하 출력 전원 공급 장치를 설정 하 고 1 h3,9EStim 셀 치료.</li>
	<li>자극, 후 전원 공급 장치를 분리 하 고 인큐베이터에서 EStim 챔버를 제거 합니다. 무 균 조건 하에서 표준 6-잘 접시 뚜껑 전극 장착 뚜껑을 교환 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에 있는 셀을 반환 하 고 그들을 떠나 하룻밤. 전극, 먼저 PBS 그리고 70% 에탄올 솔루션을 청소. 정밀한 사 포로 전극 표면에서 축적 된 부식 제품을 청소.</li>
	<li>6 일 연속 3.1-3.5 단계를 반복 합니다. 하루에 4, EStim를 적용 하기 전에 조건 하에서 무 균, 매체의 1.5 mL를 발음 하 고 prewarmed 신선한 OM.의 1.5 mL와 함께 그것을 대체 하 여 문화 매체 변경</li>
	<li>7 일 연속 EStim를 적용 한 후 유지 문화에 셀 추가 7 일 교환 매체 매 3-4 일.</li>
</ol>4. osteogenic 차별화 측정
<ol><li>현미경으로 세포 형태학 변화 분석.</li>
	<li>으로 MSC osteogenic 차별화, 측정 칼슘 증 착, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동, 및 osteogenic 마커 유전자 발현, EStim의 효과 평가 하기 위해3,9다른 곳에서 설명 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 챔버와 향상 된 osteogenic 차별화 결과 EStim와 중간 엽 줄기 세포를 치료 하는 방법의 건설을 설명 합니다.
제시 EStim 설치 특수 장비/지식이 필요로 하지 않습니다 하 고 주니어 연구자에 의해 표준 줄기 세포 생물학/생화학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 건물 EStim 챔버를 사용 하는 경우에, 몇 가지 중요 한 단계에서 특별 한 배려를가지고 한다. 백 금 전극 처리,이 금속은 매우 유 순 하 고 섬세 한 여분 배려를가지고 한다. 다른 금속, 강철 또는 텅스텐, 사용할 수 있지만 이러한 세포 독성13수 있는 부식에 수 그리 다는 권장 하지 않습니다. 또한, 전극과 뚜껑 청소/살 균으로 때문에이 메서드를 반복적으로 테스트 하 고 문제 오염 제거에 효과가 있어야 발견 프로토콜에 설명 된 대로 정확 하 게 수행 되어야 합니다. 마지막으로,이 챔버 다른 공부 하는 데 사용 될 수 EStim 민감한 세포 ...

외상 또는 질병 유발 뼈 결함 증가 세포 치료 및 재생 의학 기술의 다양 한 조합을 사용 하 여 치료를 받고 있다. MSCs 이러한 치료 그들의 상대적으로 높은 osteogenic 활동, 격리 및 확장, 효율과 안전1때문에 선택의 셀입니다. Osteogenic 그들의 활동을 극대화 하 고, 따라서 그들의 치료 효과 최적화, 여러 가지 방법은 조작 하 MSCs 이러한 치료에 그들의 사용에 앞서 (Mauney 외.2검토) 도입 되었습니다. 하나 이러한 방법은 EStim 시험관3 MSC osteogenic 차별화를 강화 하 고 뼈 vivo에서4치유 촉진을 보여줘 왔다. MSCs EStim와 치료에 집중 하는 연구의 증가도 불구 하 고 EStim의 프로 osteogenic 효과 극대화 하기 위한 최적의 처방 아직 정의할 수 있다.
EStim를 사용 하 여 다른 생체 외 방법 금속 전극5에서 세포를 분리 배양에 빠져들 소금 다리를 이용 한다. 이것의 장점은 EStim 소금 다리를 통해 제공 세포 독성 수 있습니다 화학 부산물 (예를 들면, 금속 전극의 부식)의 도입을 없앤다. 이 장점에도 불구 하 고 소금 교량 작업할 복잡 고 제공 EStim 어려운 두 시스템을 사용할 때 얻은 결과 연결 하 고 그 전달된에 vivo에서 모델에서 다릅니다. 셀 문화 우물 안에 고정 하는 금속 또는 탄소 전극을 통해 EStim 제공 하는 설정 (Hronik-Tupaj와 카 플 란6검토)으로 더 나은 시뮬레이션 한다 vivo;에 사용 되는 장치 그러나,이 소자 들은 어려운 사용 하는 사이 청소/소독 하 고 실험 당 공부 될 수 있다 셀 수는 제한 됩니다. 우리는 여기에 이러한 다른 설정의 한계를 해결 하기 위해 구체적으로 제시 EStim 챔버 설계. 반면이 EStim 챔버를 사용 하 여 우리의 경험의 대부분은 2d 되었습니다 이며 골 수 및 지방-조직-파생 MSCs3,4포함 된 3D 문화,이 챔버의 주요 장점은 그것 다목적 이며, 상대적으로 사소한 변경, 다양 한 다른 조건에서 다른 세포 유형 공부를 적용할 수 있습니다.
여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버;의 건설을 설명 다음, 우리 EStim osteogenic 차별화에 효과 측정의 다른 식이요법으로 치료 MSCs에서 그것의 사용을 보여 줍니다. MSC osteogenic 차별화 칼슘 증 착, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동, 및 osteogenic 마커 유전자 발현을 통해 평가 됩니다. 중요 한 것은,에이 설치를 사용 하는 실험 과거 관찰 이러한 프로 osteogenic 효과 EStim 치료 중단 후에 오랫동안 지속 합니다.

<table><tbody><tr><td>Estim fabrication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana connector/Jack adaptor</td><td>Poppstars</td><td>1008554</td><td>2개</td></tr><tr><td>절단 펜치</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치(0-30V/0-3A)</td><td>B& K Precision</td><td>모델 9130B</td><td>모든 유사 모델을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 절연 유연한 전선 (0.14 mm2)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2개</td></tr><tr><td>비부식성 실리콘 고무</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>*많은 상점에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>플래티넘 와이어 (999,5/1000; 1mm &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0.6 m 1 Estim 챔버</td></tr><tr><td>70 % 에탄올 용액</td>에 필요한 <td>모든</td><td></td><td>Estim 챔버</td></tr><tr><td>은도금 구리선 (0.6 mm &lslash;)</td><td>콘래드 일렉트로닉 인터내셔널</td><td>409334 - 62</td><td>&asymp; 1 Estim 장치에 70cm 필요</td></tr><tr><td>납땜 인두 세트</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>모든 simular 모델을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>TPP 6웰 플레이트 뚜껑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>Estim 챔버용 뚜껑</td></tr><tr><td>2.2V 유선 원형 LED</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6개</td></tr><tr><td>UHU Super glue</td><td>UHU GmbH & Co. KG</td><td>해당 없음</td><td>*많은 상점에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>MSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>골생성 세포 배양</td></tr><tr><td>DMEM, 저포도당, GlutaMAX 보충제, pyruvate</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>21885025</td>세포 <td>배양</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Thermo-Fischer 과학적</td><td>14190144</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>골형성 세포 배양</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo-Fischer 과학적</td><td>10500064</td>세포 <td>배양</td></tr><tr><td>50ml Falcon tube</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>골형성 세포 배양</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>15140122</td>세포 <td>배양</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley(SD) 쥐 중간엽 줄기세포, 골수 유래</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td><td></td></tr><tr><td>세포 박리 용액</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>A1110501</td>세포 <td>배양, 세포 박리</td></tr><tr><td>TC 플라스크, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>TPP 6웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye, 0.4% 용액</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>세포 수</td></tr></tbody></table>

건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/stromal 세포 osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

중간 엽 줄기/stromal 세포 (MSCs) 뼈 조직 공학 접근에에서 치유를 촉진 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 전기 자극 (EStim) MSC osteogenic 차별화 생체 외에서 증가 하 여 뼈 임상 설정에서 치유를 촉진 입증 되었습니다. 여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버의 건설을 설명 하 고 치료에 사용 쥐 뼈 골 수 유래 MSC osteogenic 차별화를 강화 하. 우리는 osteogenic 분화에 상당한 증가 결과 MSCs EStim와 7 일 동안 치료 하 고이 프로 osteogenic 효과 (7 일) EStim 단종 후에 오랫동안 지속 되는 중요 한 것은, 발견. 이 이렇게 pretreating EStim osteogenic 차별화를 강화 하기 위하여와 MSCs의 뼈 조직 공학 치료 결과 최적화 하 고, 따라서, 그들의 전체 치료 잠재력을 달성 하는 데 도움이 사용 될 수 있습니다. 이 응용 프로그램 뿐 아니라이 EStim 셀 문화 실과 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다 다른 EStim 민감한 셀 동작, 마이그레이션, 확산, apoptosis, 비 계 첨부 파일 등을 조사 하.

100 mV/mm EStim의 MSCs, 셀 EStim 3에 대 한 치료의 osteogenic 차별화에의 효과 평가 하기 위해 7 그리고 14 일 또는 nontreated (제어) 형태학 상 변화 고 칼슘 증 착 (그림 2를 평가 하 여 경작의 14 날에 분석 되었다 ). 밝은 분야 현미경 검사 법 (형태 변화)를 사용 하 여 셀 이미징 하거나 4 %paraformaldehyde 솔루션에서 세포를 고정, 0.02% 알리자린 레드 솔루션 얼룩을 다음 이미징 그들은 이렇게 밝은 분야 현미경 검사 법 (칼슘 증 착을 사용 하 여 분석)입니다.
Osteogenic 마커 유전자 표현의 변화에 대 한 자세한 분석은 3, 7, 및 자란 (그림 3)의 14 일에 수행 되었...

여기 우리는 다양 한 유형의 전기 자극 및 osteogenic 차별화를 향상 시키기 위해 중간 엽 줄기 세포를 치료에 사용 하는 셀을 표시 하도록 셀 문화 챔버의 건설에 대 한 프로토콜을 제시.

건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/Stromal 세포 Osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

여기서는 일반적인 6개의 벽 배양판을 사용하여 전기 자극챔버를 구축하는 방법과 중간엽 줄기 세포에서 골성 분화를 자극하기 위해 이를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 챔버는 쉽게 빌드 비용이 많이 들며 여러 실험에서 재사용할 수 있습니다. 우리의 챔버에서 전기 자극으로 사전 치료 된 후, 중간 엽 줄기 세포뼈 조직 공학 치료에 있는 결과를 향상 하기 위해 사용할 수 있습니다.이 챔버는 또한 다른 세포 유형 및 이동 같은 전기 에 민감한 세포 거동을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다., 증식, 막 잠재력의 변화, 세포 사 멸 증, 그리고 신중 한 첨부 파일. 6개의 웰 플레이트 뚜껑에서 마크한 다음 직경 25mm의 두 개의 1mm 구멍을 각각 6개의 우물의 바깥쪽 가장자리 근처에서 드릴링합니다. 다음으로 백금 와이어를 12 5센티미터 길이의 섹션으로 자른다.5센티미터 의 각 부분을 L"모양으로 수동으로 구부리면 한쪽 끝은 3센티미터, 다른 한쪽은 길이가 2센티미터입니다. 그런 다음 은 코팅 와이어를 두 개의 35센티미터 길이로 자른다. 플래티넘 와이어의 긴 구부러진 끝을 드릴 구멍에 삽입하여 뚜껑 바깥쪽에서 1~2밀리미터돌출됩니다.집게를 사용하여 구부립니다. 그 후, 매우 전도성 접착제로 뚜껑 구멍에 백금 와이어를 고정하고 약 6 시간 동안 건조하게 둡니다. 음극을 준비하려면 뚜껑에서 은코팅 와이어 중 하나로 튀어나온 6개의 플래티넘 와이어의 팁을 납땜합니다.양극을 준비하려면 나머지 6개의 플래티넘 와이어를 다른 실버 코팅 와이어로 납땜합니다. 이어서, 6개의 양극 음극 백금 전극 쌍 의 각 회로에 LED를 추가하여 기능을 확인합니다. 각 LED 아래에 검은 절연 테이프를 배치하여 배양 판의 세포가 LED 조명에 노출되는 것을 방지합니다.다음으로 와이어 단말 블록 커넥터를 6웰 플레이트 뚜껑의 왼쪽 상단 모서리에 붙이고 은 코팅 된 와이어를 입력 단자와 연결합니다. 그런 다음, 첫 번째 뚜껑의 터미널 블록 커넥터를 수용하기 위해 두 번째 6 웰 플레이트 뚜껑의 왼쪽 상단 모서리에서 20mm의 사각형 섹션을 잘라냅니다. 두 번째 뚜껑을 장착한 첫 번째 뚜껑을 덮고 접착제 테이프로 테이프를 붙입니다.두 개의 표준 절연 구리 와이어의 한쪽 끝을 와이어 커넥터의 출력 단말에 연결하고 다른 쪽 끝을 바나나 남성 커넥터에 연결합니다. 전면 패널의 ON-OFF 버튼을 눌러 전원 공급 장치를 켭니다. 버튼을 하나 눌러 채널 하나를 활성화합니다.그 후 버튼을 4번 눌러 전압을 설정합니다. 하중 출력을 2.5볼트로 설정합니다. 그런 다음 Enter를 누릅니다.당일 세포는 E 줄기로 처리되고, 전극을 70%에탄올 용액으로 30분 동안 살균한다. 그런 다음 안전 캐비닛에서 UV 빛 아래에서 30 분 동안 건조하십시오. 라미나르 플로우 후드에서 전극이 장착된 뚜껑을 가진 배양된 MSC를 함유한 6웰 플레이트를 덮어 전극이 매체에 완전히 침수되도록 한다.그런 다음, 커버된 6웰 플레이트를 셀로 인큐베이터로 옮기고 전선을 전원 공급 장치에 연결합니다. 다음으로 전원 공급 장치를 2.5볼트 하중 출력으로 설정하고 세포를 E 줄기로 1시간 동안 처리합니다. 자극 후 전원 공급 장치를 분리하고 인큐베이터에서 E 줄기 챔버를 제거합니다.멸균 조건에서, 표준 6 웰 플레이트 뚜껑, 전극장착 뚜껑을 교체하십시오. 그 후 세포를 인큐베이터로 돌려보내 하룻밤 동안 둡니다. 먼저 PBS로 전극을 청소한 다음 70% 에탄올 용액으로 청소합니다.그런 다음, 전극 표면에서 축적 된 부식 제품을 미세 한 사포로 청소하십시오. 6일 연속 E줄기 치료를 반복한다. 4일째, 전기 자극을 적용하기 전, 멸균 조건하에서, 배지 1.5 밀리리터를 흡입하고 1.5밀리리터의 사전 따뜻하고 신선한 골분화 분화 매체로 대체하여 배양 배지를 변경한다.7일 연속 전기자극을 적용한 후, 3~4일마다 배지를 교환하여 7일 간 배양시 세포를 유지한다. 치료가 완료되면 현미경으로 세포 형태 변화를 분석하십시오. MSC 골성 분화에 대한 전기 자극의 효과를 평가하기 위해 다른 곳에서 설명된 바와 같이 칼슘 증착, 알칼리인포스파아제 활성 및 골조성 마커 유전자 발현을 측정합니다.MSC 골성 분화에 대한 전기 자극의 밀리미터당 100 밀리볼트의 효과를 평가하기 위해, 3, 7, 14일 및 비처리 된 세포를 전기 자극으로 처리된 세포는 형태학적 변화 및 칼슘 증착을 평가하여 배양 14일째에 분석하였다. 세포 형태와 칼슘 침전의 중요한 변화는 7 일과 14 일 동안 전기 자극으로 처리 된 세포에서 볼 수 있었습니다. 골성 마커 유전자 발현 변화에 대한 상세한 분석은 문화의 3일, 7일 및 14일에 수행되었다.배양 7일째에 RunX2 발현은 7일 동안 전기 자극으로 처리된 세포에서 현저히 높았다. Colla1 발현은 배양의 14일째에 측정된 7일 동안 처리된 세포에서 상당히 높았습니다. 골테오폰틴의 발현은 배양의 3일, 7일, 14일 동안 전기자극세포에서 현저히 증가하였다.Osterix 발현은 항상 제어 세포에 결석했으며 전기 자극에 노출된 세포에서 7 일 및 14 일 배양에서만 볼 수 있었습니다. 전기 자극 챔버는 비교적 쉽게 구축할 수 있습니다. 그러나 백금 와이어를 취급할 때, 전극을 청소하고 살균할 때도 특별한 주의를 기울여야 합니다.우리 챔버에서 전기로 전처리된 세포는 단독으로 또는 비계 재료에 앉은 동물 모델에 이식되어 전기 자극의 긍정적 인 효과가 체외에서 지속되는 방법을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 전기 자극이 세포 기능을 조절하는 메커니즘을 연구하는 간단하면서도 강력한 도구를 제공합니다. 이 지식은 재생 의학 세포에서 사용할 수 있습니다.

construction-use-an-electrical-stimulation-chamber-for-enhancing

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

그것은 널리 본문에 기계적 세력 세포 분화와 증식에 영향을 미칠 수 있음을 이해합니다. 여기 유연한 micropatterned 기판에 교양 세포를 막기 위해 uniaxial 순환 인장 응력을 제공하는 맞춤식 생물 반응기의 사용을 보여주는 비디오 프로토콜을 제시한다.

순환 Uniaxial 스트레인을 사용하여 줄기 세포의 기계적 자극

이 비디오는 전기 자극을 통해 신경 줄기 및 전구 세포 또는 NPC를 구별하기 위해 세포 외 매트릭스로 코팅된 미세유체 칩을 사용하는 방법을 보여줍니다. 코팅된 부위에 파종하고 부착한 후 NPC는 성장하고 직류를 가하면 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포로 분화됩니다.

전기자극 유도 신경줄기세포와 전구세포의 분화

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

자가 혈청 인간 중간 엽 기질 세포 (중배엽 줄기 세포)를 배양, 이종 재료 및 기타 부정적인 영향에 의한 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 신선한 중배엽 줄기 세포를 제공 할 수 중배엽 전구 세포의 부분 집합의 복구 할 수 있습니다. 자가 섬유소 응고에 중배엽 줄기 세포를 포함하면 취급이 용이하고 효과적인 수술 주입을 할 수 있습니다.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.

변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계

여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

이 프로토콜은 생물학적 조직을 자극하는 데 사용되는 전기 및 자기 자극기를 모두 구축하는 단계별 프로세스를 설명합니다. 이 프로토콜에는 전산 전기 및 자기장을 시뮬레이션하고 자극기 장치의 제조를 위한 지침이 포함되어 있습니다.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

우리는 세 가지 차원 재구성 된 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 조직 모델을 활용하여 눈 자극 테스트를 개발했습니다. 시험은 안구 자극과 부식성 물질 (GHS 분류 1과 결합 2) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 구별 할 수있다.

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

배우세요 중간엽 줄기세포의 골형성 분화를 강화하는 전기자극 챔버 구축 방법을. 6공 배양 플레이트와 백금 전극을 활용한 이 프로토콜은 저렴하고 재사용 가능하며 뼈 조직 공학 연구에 효과적입니다.

건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/Stromal 세포 Osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용

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