Name: Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 세포 배양 상청액에서 세포외 소포체(EV) 표면 표지자 CD9, CD63, CD81을 유동 세포 분석으로 검출하는 방법을. 항체 결합 비드를 이용한 면역침전법으로 재현성 높은 진단 바이오마커 분석이 가능합니다.

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앨라배마는 헬무트 호르 텐 재단 및 Velux 재단, 취리히 (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다. G.V. 스위스 국립 과학 재단, 세실리아-오 거 스타, 루가 노, 재단과 SHK 재단에 Herz-und Kreislaufkrankheiten (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다

1. 수집 및 바른된 미디어의 처리
<ol><li>PBS에서 0.02% 돼지 피부 젤라틴 55 cm2 페 트리 디쉬 코트.</li>
	<li>7 mL Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM)의 하 20 보충 CPC (8000/cm2) 미리 코팅 요리에서 접시 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 1% 페니실린/스 (P/S). 참고: 기간 "클릭 당" 언급 된 인간의 explant 파생 셀에 다른14설명. CM은 특정 문화 조건에서 경작 하는 다른 세포 유형에서 수집할 수 있습니다. 장갑을 착용 하 고 생물학 후드 작동.</li>
	<li>셀에 대 한 도달 80% 합류, 문화 매체를 제거, 세척 셀 두 번 Dulbecco의 PBS (PBS) Ca-, Mg-무료 하 고 혈 청 무료 엑 소 생산 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM] 높은 포도 당, 4.5 g/mL)의 10 mL와 함께 그것을 대체. 참고: 점차적으로 셀 세럼 무료 조건 (SF)에 맞게 문화 매체에서 혈 청 농도의 진보적인 감소로 진행 합니다. 셀에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 민감한 FBS를 포함 하는 매체를 준비 하지만 EV의 고갈. 모든 영양소와 플러스 10%-20% (v/v) FBS 보충 하는 매체를 준비 합니다. 100000 × g, 4 ° c.에 하룻밤 매체 원심 이 절차 FBS 파생 EV의 100% 제거를 보증 하지 않습니다 것을 유의 하십시오.</li>
	<li>7 일 후, 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브에 CM을 수집 합니다. 참고: 중간 컨디셔닝 위한 시간 셀 형식에 따라 달라 집니다. 혈 청 무료 매체에 민감한 세포에 대 한 매체의 초기 볼륨을 증가 하 고 24-48 h CM 컬렉션에 대 한 시간을 줄입니다.</li>
	<li>4-10 ° c.에 20 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리기에 의해 세포 파편에서 CM을 취소 100 kDa 원심 분리기 필터 튜브에 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>집중 2000 x g 4-10 ° c.에 20 분에 관을 회전 시켜 CM 허가 참고: 이 단계는 고속 원심 분리기 단계 작은 볼륨 튜브를 사용 하 여 수 CM의 초기 볼륨을 줄일 것입니다 하 고 작은 단백질 집계 제거에 기여할 것입니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브에 집중을 수집 합니다. 4-10 ° c.에 15 분 동안 10000 x g 에서 원심 분리기</li>
	<li>상쾌한을 수집 하 고 절 2 (EV 농축). ultracentrifuge를 사용할 수 없는 경우 섹션 3 (나노 추적 분석 (NTA) 부 량)에 직접 진행 합니다. 참고: EV 분수의 사전 농축 형광 강도 (참조 대표 결과 및 그림 4)에서 최종 읽기를 향상 시킵니다. 맑게 CM (1.8 점)에서 4 ° C에서 더 이상 다음 1-2 일 저장할 수 없습니다 또는 양자 택일로 몇 달 동안 −80 ° C에. 5 CM 미리 exosome 크기의 파편은 동결-해 동 과정에서 형성 하지 있도록-80 ° C에서 저장 하기 전에 어떤 세포질 파편 든 지 제거를 삭제 해야 합니다.</li>
</ol>2. 세포 외 소포 농축 Ultracentrifuge (옵션)에 의해
<ol><li>폴 리 카보 네이트 두꺼운 벽 ultracentrifuge 튜브에서 단계 1.8에서에서 상쾌한을 놓습니다. 채워 튜브 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x (3.2 mL)의 최대 용량에 도달할 때까지.</li>
	<li>(8 x 3.2 mL, k-팩터 13) 티타늄 고정 각도 터에 샘플을 로드 합니다. 탁상 ultracentrifuge에로 터를 로드 합니다. 3 h 4-10 ° c.에 대 한 100000 x g 에서 ultracentrifuge</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 1 x PBS의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>3. 나노 추적 분석 (NTA) 정량화
<ol><li>1 x PBS의 999 µ L에서 (어느 단계에서 2.3 또는 1.8) 샘플의 1 µ L를 희석. 거품 형성을 피하고 1 mL 주사기에 샘플을 로드 합니다. 시험 챔버의 입구 포트에 주사기를 로드 합니다.</li>
	<li>레이저를 켭니다. 캡처 버튼으로 카메라를 엽니다. 초점을 조정 합니다.</li>
	<li>3 다른 프레임 60의 기록 s 각.</li>
	<li>3 다른 인수는 소프트웨어에서 일괄 처리 옵션을 사용 하 여 분석 합니다. 참고: NTA 기술을 사용할 수 없는 경우에, Bradford 분석 실험에 의해 단백질 정량화를 수행 (1 x 108 입자 해당 ultracentrifugation 후 총 단백질의 1-2 µ g 또는 50-60 µ g 총 단백질 정량화로 CM에 대 한 직접 수행 하는 경우 EV; 다른 단백질 오염 물질을 포함 하 고 있습니다. 표 1참조)5.</li>
</ol>4. 샘플 준비
<ol><li>캡처 구슬의 3 종류의 풀 준비 (CD9 구슬, CD63, 구슬과 CD81 비즈는 1:1:1 비율; 참조 테이블의 자료) 및 소용돌이. 참고: 수영장은 1 달 동안 안정적인 것으로 테스트 되었습니다. 구슬의 단일 유형을 사용할 수 있습니다, 그리고 그러면 EV 부분 모집단의 탐지 하지 discriminable 구슬의 수영장. 단일 항 구슬 캡처를 사용 하 여 될 것입니다 가능한 현대 CD9, CD81, 등 CD63, tetraspanin 단백질의 존재 확인 하며 관심의 항 원 형광 항 체에 의해 감지. 대체 알데하이드-황산 라텍스 구슬 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 구슬 MV와 EV의 흡착에 대 한 소수 성 표면을 제공합니다.</li>
	<li>둥근 바닥 튜브에 1 x 108 입자 플러스 (각 시험)에 대 한 총 105 구슬 x 1.2 해당 구슬 풀의 1 µ L에 해당 하는 볼륨의 금액을 추가 합니다.</li>
	<li>이로써 "구슬" 라고 부정적인 컨트롤 역할을 하는 EV 없이 구슬의 1 µ L을 포함 하는 튜브를 준비 합니다.</li>
	<li>1 x PBS 가진 100 µ L 볼륨을 조정 합니다. 튜브 열 믹서에 놓고 4-10 ° c.에 하룻밤 400 rpm에서 흔들</li>
	<li>다음 날에 둥근 바닥 96 잘 접시 (FC 관) 샘플을 이동 합니다.</li>
	<li>항 체 (CD9_FITC의 10 µ g/mL, 10 µ g/mL CD63_PE, 및 CD81_PE의 5 µ g/mL)를 추가 합니다.</li>
	<li>4-10 ° c.에 1 시간을 품 어</li>
	<li>각 음에 1 x PBS의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>수집을 진행 합니다.</li>
</ol>5입니다. 취득
<ol><li>수집 소프트웨어를 열고 악기를 시작 (Cytometer > 시스템 시작 프로그램). 새로운 실험을 엽니다.</li>
	<li>실험적인 서식 파일을 만들 다음 접시 와 접시 추가선택 합니다. 접시에 샘플의 위치를 선택 하 고 설정으로 예제 잘키를 누릅니다.</li>
	<li>명명 규칙에 샘플 이름 (예: CPC #1_CD9FITC)를 입력 합니다. 채널 탭 열고 FITC와 PE 채널에 전환 합니다.</li>
	<li>악기에 접시를 로드 합니다.</li>
	<li>점 작 누르고 새로운 점 플롯 (P1)을 만들. 앞으로 분산형 영역을 설정 (FSC-A) 측면 분산형-지역 대 (SSC-A) 합니다.</li>
	<li>레이저는 응용 시작 초기화 를 선택 합니다. 취득 취득을 시작을 누릅니다.</li>
	<li>표시는 P1 중간 인구 규모를 조정 합니다. P1 그릴 (파편 제외) 전체 인구 주위 "구슬" 게이트 (그림 2A). 중지를 누릅니다.</li>
	<li>점 작 누르고 새로운 점 플롯 (P2)을 만들. 앞으로 FSC-. 대 분산형-높이 (FSC-H)를 설정 "구슬"에 새로운 점 작 게이트 P2에서 더 큰 인구 주위 새로운 게이트 그릴 하 고 그것의 이름을 "SINGLETS" (그림 2A). 참고: 이 전략은 많은 구슬 집계 수집 및 분석 단계에서의 가능한 포함을 피하기 위해 설계 되었습니다.</li>
	<li>점 작 누르고 만들 두 개의 서로 다른 점 음모; SSC A 대 한 FITC와 SSC-. 대 한 PE "SINGLETS"에 새로운 점 작 게이트</li>
	<li>기록 하는 이벤트 (예: 20000)을 선택 합니다. 레코드 를 선택 하 고 실험을 시작.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>분석 소프트웨어 취득 파일을 로드 합니다. 참고: 다음 단계는 구슬만 및 모든 불명된 한 견본을 포함 하 여 모든 샘플에 적용 해야 합니다.</li>
	<li>새로운 프로토콜을 열고 다음 단계 5에서에서 설명한 동일한 전략 점 플롯을 만들.</li>
	<li>선형 눈금에 모든 분산형 축과 모든 형광 축 눈금을 로그를 설정 합니다.</li>
	<li>FITC와 PE 채널에는 형광은 (X-Gmean-MFI)를 표시 합니다.</li>
	<li>X-G의미 는 샘플의 비율 / X-G 구슬의의미 를 물 exosome 없이 항 체.</li>
	<li>배 변경 다른 EV 준비의 MFI를 비교 합니다.</li>
</ol>7. 세포 외 기 수 적정
참고: 섹션 7 ~ 10 입자, 항 체 농도 및 특이성의 수를 설정 하려면 수행할 수 있지만 경우 건너뛸 수 있습니다 셀 유형에서 EV 파생 되 고 항 체는 동일 하 게 유지.
<ol><li>2.3, 2.5 108 입자 x 5 x 105 에서 배열 하는 정지의 시리즈를 1 x PBS에 단계에서 얻은 입자를 희석.</li>
	<li>각 정지에 대 한 라운드 하단 튜브에 추가할 캡처 구슬 풀의 1 µ L.</li>
	<li>4.3 단계에서 프로토콜을 따릅니다.</li>
</ol>8. 항 체 적정
참고: 항 체의 적정은 일반적으로 각 관에 대 한 단일 항 체를 추가 하 여 수행 됩니다.
<ol><li>모든 샘플에서 일정 EV (총 입자 또는 단백질 콘텐츠)의 수를 유지. 참고: 적절 한 수 위의 섹션에서에서 설명한 대로 7에 경험적으로 결정 됩니다.</li>
	<li>4.1 4.5 단계에서 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>공급 업체에서 권장 금액 아래와 위의 항 체 농도의 범위를 테스트 합니다. 예를 들어 제안된 테스트 당 10 µ g/mL의 농도와 항 체, 1, 2, 5, 10, 20, 50 µ g/mL 테스트. 항 체의 높은 농도 추가 "구슬 만" 샘플을 포함 합니다.</li>
	<li>1 h 4-10 ° c.에 품 어</li>
	<li>각 샘플에 대 한 1 x PBS의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>샘플을 획득 합니다.</li>
</ol>9. 보육 시간
<ol><li>보육 시간 수행 하는 다른 시간 지점 (예: 1 시간, 2 시간, 그리고 5 h)에서 인수를 확인 합니다.</li>
	<li>섹션 4에서에서 시작 하는 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>4-10 ° C에서 1 시간에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>샘플을 획득 합니다.</li>
	<li>3 h 4-10 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>샘플을 획득 합니다.</li>
</ol>10. 프로토콜 유효성 검사
<ol><li>
EV 바인딩
	<ol>
<li>둥근 바닥 튜브에 1 x 108 입자 또는 총 단백질의 해당 금액에 해당 하는 볼륨의 금액을 추가 합니다.</li>
		<li>1 x PBS 가진 100 µ L 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>방해 하 여 EV 멤브레인 제조업체의 지침에 따라 (또는 열 충격 단계 적용 될 수 있다) 쥡니다. 빈도 강도 설정 합니다. 시간-과정 실험 설정 쥡니다 기간을 실험적으로 설치 될 수 있다 (즉, 0 s 30 s, 1 분, 5 분, 등.).</li>
		<li>구슬 풀의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>4.4 단계에서 시작 하는 프로토콜을 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 체 특이성
	<ol>
<li>각 형광 색소 활용 된 IgG에 대 한 1 개의 관을 준비 하 고 구슬 EV의 복잡 한 단계 4.6에서에서 설명 된 대로 추가. 참고: 형광 색소 활용 된 Isotype 사용된 항 체의 IgG와 일치 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

아무것도 선언입니다.

기존의 FC 기술을 마커 EV의 표면에 표현 하는 가장 간단한 분석 방법에 남아 있다. 이와 관련, 가장 적합 한 프로토콜을 선택은 악기 감도 인해 한계를 방지 하 여 개별 입자의 분수에 대 한 유용한 정보를 얻을 중요 합니다. 우리 엑 소 및 다운스트림 FC 응용 프로그램에 대 한 적당 한 작은 EV 표면 항을 인식 하는 항 체와 결합 하는 자기 입자를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리 확인 방법을 사용 하 여 두 개의 서로 다른 세포 유형: 기본 인간의 CPC 심장 질환;에 대 한 엑 소-기반 치료 접근에 대 한 주요 셀 소스로 떠오르고 있다 그리고 HEK293 세포, 신뢰할 수 있는 세포 성장 및 소성 세포 생물학 연구에서 널리 이용 되는 불멸 하 게 셀 라인.
메서드는 ultracentrifuge 농축 EV에 적용할 수 있는 하 고, 빠른 분석을 위해 또한 생체 외에서 직접 세포 유래 CM 없이 사전 농축과 ultracentrifugation에 의해. 시작 자료 샘플을...

세포에는 세포 외 소포 (EV) microvesicles (MV) 및 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 다양 한 크기의 분 비. 후자는 구분할 수 MV에서 크기와 근원의 subcellular 구획. MV (크기에 200-1000 nm)는 부모 세포에서 원형질 막에서 흘리기에 의해 해제 됩니다. 반대로, 엑 소 (30-150 nm) endosomal 막에서 발생 하 고 세포 막1,2multivesicular 시체 (MVB) 퓨즈 때 세포 외 공간으로 해제 됩니다.
EV는 점점 사용 진단 바이오 마커 뿐만으로, 잠재적으로, 종양학, 신경학, 심장학, musculoskeletal 질환3,,45등 많은 분야에서 치료 도구. 치료제의 체 외 배양된 세포의 세포 조절 매체 (CM)에서 소포 악용으로 EV를 사용 하 여 지속적인 연구의 대다수. 여러 문맥에서 유익한 효과 발휘 하는 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 그리고 MSC 파생 EV 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해6 및 뇌 부상7모델에서 혜택 나타났습니다. MSC 파생 EV는 또한 치료-내 화 이식-비교-호스트 질병8모델에서와 같이 면역 제거 치료에 악용 될 수 있는 면역 modulatory 활동 전시. 양수 내 유체 줄기 세포 (hAFS) 적극적으로 풍요롭게 CM MVs와 엑 소, heterogeneously 배포 크기 (50-1000 nm), 차별화 된 셀, 신생 혈관, 섬유 증, 억제의 확산 등의 여러 생물학적 효과 중재 하 고 cardioprotection4. 우리 것으로 나타났습니다 최근 EV, 그리고 엑 소 특히, 인간의 심장에서 파생 된 조상 세포 (엑 소-클릭 당)에 의해 분 비 쥐5,9에서 심근 경색 크기를 감소 시키기.
엑 소 공유 tetraspanins (CD63, CD81, CD9) 등 중요 한 조직 적합성 복잡 한 그들의 표면에 단백질의 공통 된 종류 I (MHC-나). 단백질의이 공통 집합, 뿐만 아니라 엑 소 또한 프로듀서 셀 형식의 EV 하위 집합에 대 한 단백질 특정 포함 되어 있습니다. 그들은 많은 생물 학적 과정5,10를 그로 인하여 규제 간 셀룰러 통신에서 중요 한 역할 때문에 엑 소 마커 파라마운트 중요성을 얻고 있다. 그들의 소형 때문에 도전 과제 EV 클래식 흐름 cytometry (FC) 남아를 사용 하 여 분석 하는 쉬운 방법을 찾는.
여기, 우리 ultracentrifugation를 통해 미리 농축된 샘플 또는 CM (그림 1)에 직접 적용할 수 있는 FC를 사용 하 여 EV 분석에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 메서드 추가 세척 없이 정식 엑 소 관련 표면 epitopes (CD63, CD9 CD81)는 특정 항 체로 입힌 구슬을 사용 합니다. FC 분석 측정 전에 조정에 대 한 필요와 함께 기존의 cytometer를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 교류 cytometers를 사용 하 여 개별 작은 입자에 항 원 특성에 대 한 메서드는 다양 한 응용 프로그램11,,1213에 관하여 다른 그룹에 의해 기술 되었다. 여기, 우리는 작은 입자와 엑 소, FC에 의해 캡처된 입자의 형질 다음 캡처에 대 한 기능성된 자석 구슬 사용. 이 메서드는 작은 소포 생체 외에서 어떤 셀 형식에 의해 발표의 항 원 성분의 특성을 사용할 수 있습니다, 하지만 여기 우리가 제공 적용 되는 특정 세포 배양 조건을 인간의 심장 조상 세포 (CPC)의 문화를 가장 이 세포에 의해 EV 생산을 위한 적절 한 환경.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&nbsp; kDa&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>CytoFlex, 유세포 분석기 플랫폼</td><td>, Beckman Coulter</td>, <td>CytoFlex,</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, HEPES, 페놀 레드</td><td>없음 Gibco</td><td>21063045</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS(PBS) Ca- 및 Mg-free</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr>, <tr><td>ExoCap CD63 캡처 키트</td><td>, JSR Life Sciences,</td><td>Ex-C63-SP</td><td></td></tr>, <tr><td>ExoCap, CD81 캡처 Kit</td><td>JSR Life Sciences</td><td>Ex-C81-SP</td><td></td></tr><tr><td>ExoCap CD9 Capture Kit</td><td>JSR Life Sciences</td><td>Ex-C9-SP</td><td></td></tr><tr><td>Exosome-Depleted FBS</td><td>Thermofisher</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Exosome-depleted FBS Media Supplement</td><td>SBI</td><td>EXO-FBS-250A-1</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-human CD9 항체</td><td>바이오레전</td><td>드 312104&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RRID: AB_2075894</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기 분석 소프트웨어</td><td>Beckman Coulter</td><td>Kaluza</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td>NanoSight LM10</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight 소프트웨어</td><td>Malvern</td><td>NTA 2.3</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human CD63 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>353004&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RRID:AB_10897809</td><td></td></tr><tr><td>PE 항인간 CD81 (TAPA-1) 항체</td><td>Biolegend</td><td>349505&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RRID:AB_10642024</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>써모믹서 C</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000 015</td><td></td></tr><tr><td>TLA-110</td><td>Beckman Coulter</td><td>TLA-110 로터</td><td></td></tr></tbody></table>

extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 cytometric 분석 흐름

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Cytometry (FC)는 세포 표면 항 원 표시의 반 정량적 측정에 대 한 선택의 방법입니다. 최근,이 기술은 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 말 초 혈액과 다른 체액에 extracellular 소포 (EV)의 phenotypic 분석을 위해 사용 되었습니다. EV의 작은 크기 명령 주위 검출 임계값을 갖는 전용된 기기를 사용 하 여 50-100 nm. 또는, EV FC에 의해 검출 될 수 있는 라텍스 microbeads에 바인딩할 수 있습니다. Microbeads, EV 관련 마커/클러스터 차별화 CD63, CD9, 및 CD81 인식 하는 항 체와 활용을 사용할 수 있습니다 EV 캡처. CM에서 고립 된 엑 소 ultracentrifugation에 의해 또는 사전 농축 하지 않고 분석할 수 있습니다. 이 접근은 기존의 FC 악기를 사용 하 여 EV 분석에 적합 합니다. 우리의 결과 형광 강도 의미 (MFI) 값과 EV 농도 사이의 선형 상관 관계를 보여 줍니다. 극적으로 쥡니다 통해 EV를 방해 MFI는 방법 막 파편을 검색 하지 않습니다 나타내는 감소. 우리 보고 어떤 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 EV 표면 항 원 분석에 대 한 정확 하 고 신뢰할 수 있는 방법.

단일 얼룩에 대 한 입자의 총 수
이후 하나의 구슬 하나 이상의 입자를 바인딩할 수 있습니다, 우리 MFI 곡선의 초기 지 수 단계에 도달 총 EV (관 당 단일 항 체)의 작은 금액을 설정 하는 다른 조건을 테스트. 항 체의 고정된 농도 2.5 x 10 5 x 105 에서 배열 했다 입자의 총 수 하는 동안 사용 되었다8. 그림 3A, 항 체는 허용 MFI 내에서 수행 되도록 우리가 수 있는 입자의 수와 같이 1 x 108 입자/얼룩은 EV의 과잉 사용을 피하고.
항 체 적정
...

프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

세포 외 소포는 점점 많은 분야에서 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 치료 도구로 사용되고 있습니다. 흐름 세포측정은 슈트 얼굴 마커를 특성화하는 가장 직선적인 분석 방법은 이 프로토콜이 크기 가중 입자를 분석하는 데 사용될 수 있으며, 빠르며, 특별한 설정이나 전용 기기없이 종래의 지진계에 적용할 수 있다. 이 프로토콜은 말의 상태 및 매체에서 세포외 소포를 분류하는 데 사용되지만, 환자에서 침습적 조직 생검을 대체하기 위해 도착 한 AV의 분류로 확장 될 수 있습니다.프로토콜에 새로운 연구원의 경우, 설정 방법 섹션에 설명된 단계를 수행하고, PBS에서 02%의 돼지 피부 젤라틴으로 55센티미터 제곱 페트리 접시를 코팅하여 시연된 얻기 전략을 밀접하게 따르는 것이 중요합니다. 15분 후, 접시와 접시를 4.4배 10회 각 접시에 각 접시에 10번 씻고, 이스코브의 변형된 덜베코 의 매체 또는 IMDM의 7밀리리터로, 20%의 태아 소 혈청, 1%페니실린과 연쇄상구균을 섭씨 57%에서 배양하여 1%를 보충한다. 세포가 약 80%의 합류에 도달하면 칼슘과 마그네슘없이 덜벡코의 PBS로 배양을 두 번 세척하고 혈청 무료 외식 생산 매체의 10 밀리터로 세포를 공급합니다.7 일 후, 각 플레이트에서 조건된 배지를 단일 폴리 프로필렌 원심분리기 튜브로 풀을 만들고 배지를 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 100킬로달톤 원심분리기 필터 튜브로 슈퍼네텐트를 전송하고, 추가 원심분리로 클리어, 컨디셔닝, 배지를 농축한다. 최종 벤치탑 원심분리를 위해 마이크로 원심분리기 튜브로 농축을 옮기고 초나텐트를 폴리카보네이트 두꺼운 벽 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.3.2 밀리터의 최종 부피로, PBS로 튜브를 채우고, 티타늄 고정 천사 로터에 샘플을로드합니다. 그런 다음 로터를 탁상 초원심분리기에 적재하여 초원심분리기를 하고, 신선한 PBS 의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재보페한다. 나노입자 추적 및 분석 정량화를 위해, PBS의 999 마이크로리터에서 초원심분리시 샘플의 마이크로리터 1을 희석하고, 기포 없이 1 밀리터 주사기에 샘플을 적재한다.주사기를 검사실의 입구 포트에 적재하고 레이저를 켭니다. 캡처 버튼을 사용하여 카메라를 열고 포커스를 조정합니다. 그런 다음 각각 60초의 세 가지 프레임 이상을 기록하고 소프트웨어의 배치 프로세스 옵션을 사용하여 세 가지 다른 인수를 분석합니다.수집을 위해 샘플을 준비하기 위해 먼저 적절한 실험적인 단일클론 항체 공액 포획 구슬을 1:1:1 비율로 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고, 그 결과 포획 비드 풀을 소용돌이시다. 다음으로, 적절한 샘플 부피를 캡처 비드 풀 1마이크로리터에 추가하여 8개 입자에 1배 10회, 시험 농도당 5구슬에 1.2배 10을 생성한다. 비드 1마이크로리터를 음수 조절으로 표시된 튜브에 추가하고 각 튜브의 볼륨을 신선한 PBS로 100 마이크로리터로 조정합니다.그런 다음 튜브를 보온 믹서에 넣고, 분당 400회전, 하룻밤 사이에 섭씨 4~10°C로 흔들어 놓습니다. 다음 날, 샘플을 원형 하단 96 웰 플레이트로 전송하고, 각 우물에 적절한 플로레스시공 공액 항체를 추가한다. 섭씨 4~10도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 추가하고 인수 소프트웨어를 엽니다.사이토미터 및 시스템 시작 프로그램을 선택하여 계측기를 시작하고 새로운 실험을 엽니다. 실험 템플릿을 만들고 플레이트를 선택하고 플레이트를 추가합니다. 플레이트의 샘플 위치를 선택하고 샘플을 잘 클릭하여 설정합니다.명명 규칙에 샘플 이름을 입력하고 채널 탭을 열고 적절한 플로멘스 신호 채널을 선택합니다. 이제 접시를 기기에 로드합니다. 그리고 점 플롯을 클릭하여 측면 분산 영역 점 플롯과 비교하여 새 전방 분산 영역을 만듭니다.초기화를 선택하여 레이저와 유체를 시작하고 실행을 클릭하여 인수를 시작합니다. 축척을 조정하여 전방 및 측면 산란 플롯의 중간에 있는 인구를 표시하고 전체 샘플 개체수 주위에 구슬 게이트를 그려 이물질을 제외합니다. 중지 및 점 플롯을 클릭하여 앞으로 분산 영역 점 플롯과 비교하여 전방 분산 높이를 만들고 구슬 모집단의 샘플을 게이트합니다.더 큰 인구 주위에 새 게이트를 그리고 Singlets의 이름을 지정하고, 점 도표를 클릭하여 사용되는 실험형 형광당 당 측면 산란 영역 점 플롯에 비해 하나의 형광 신호를 만듭니다. 싱글츠의 새 점 플롯을 게이트합니다. 그런 다음 기록할 이벤트 수를 선택하고 레코드를 선택하여 실험 인수를 시작합니다.분석이 끝나면 수집 파일을 적절한 분석 소프트웨어에 로드하고 새 프로토콜을 엽니다. 각 파일에 대해 점 플롯을 방금 설명한 대로 만들고 모든 분산 축을 선형 축으로 설정하고 모든 플로리스트센트 축을 로그 스케일로 설정합니다. 그런 다음 관련 신호 채널에서 플로레시엔스 기하학적 평균을 표시하여 다른 세포외 소포 제제에서 평균 꽃집 강도의 전체 변화를 계산합니다.평균 플로레시센 강도 곡선의 초기 지수상에 도달하기 위해 세포외 소포의 가장 작은 총량을 설정하는 상이한 조건을 테스트한 후, 최소 입자 수는 염색당 8입자로 1배 10으로 결정되었다. 비특이적 항체 결합 없이 가장 높은 신호를 달성하기 위해 8입자에 대한 항체의 최적 농도는 항체에 대한 항체 CD9_FITC 및 항체 CD63_PE 항체 및 밀리리터 당 5마이크로그램 모두에 대해 밀리리터당 10 마이크로그램으로 결정되었으며, 항체에 대한 CD81_PE 항체에 대한 5마이크로그램. 방법의 적합성을 확인하기 위해, 컵 모양의 세포외 소포를 분석하기 위한, 멤브레인 파편이 아닌 세포외 소포는 초음파 처리되어 30 초의 초음파 처리 후 평균 꽃집 강도가 감소했으며 기계적 중단 1 분 후에 전혀 꽃을 감지하지 못했습니다.입증 된 바와 같이 심장 전구 세포에서 X의 자신의 정제, 두 세포 집단에서 CD9와 CD81의 낮은 수준을 표현, 세포 외 소포를 산출한다. 또한 X의 표면 마커는 초원심 분리 없이 명확하게 식별할 수 있지만, 이 농축 단계는 이러한 마커의 평균 꽃집 강도를 크게 향상시킵니다. 세포 외 소포로 작업 할 때, 더 부주의 나노 입자 펠릿은 쉽게 놓칠 수 있다.따라서 프로토콜에서 설명한 대로 모든 단계를 따르는 것이 필수적입니다. 세포외 소포를 바이오마커로 사용하는 것은 이제 가장 새로운 분야 연구 중 하나입니다. 그리고 곧, 대체 스크리닝 도구로 사용되는 임상 진단으로 번역될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 형광 표지 포획 항체-자기 나노입자 접합체를 사용하여 세포외 소포체의 면역 캡처를 보여줍니다. 이 프로세스에는 복잡한 형성, 형광 표지된 검출 항체를 사용한 염색, 자기 분리 및 항원 특성 분석을 위한 유세포 분석이 포함됩니다.

항원 특성 분석을 위한 세포외 소포체의 면역포획 및 유세포 분석(Immunocapture and flow cytometry of Extracellular Vesicles for Antigenic Characterization)

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

이 프로토콜에서 우리는 형광 기반 나노-추적 분석 하 여 인간의 전체 혈액에서 세포 외 vesicles의 신속한 격리 및 특정 마커의 특성화에 대 한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 제시 결과 재현성의 높은 레벨을 표시 하 고 셀 문화 supernatants 조정 될 수 있습니다.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

여기서는 형광 표지된 microRNA의 풍부함에 대한 체외 평가를 통해 microRNA 패키징의 역학을 연구하고 세포외 소포체(EV)로 내보낼 수 있는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

유세포 분석을 사용하여 세포외 소포체로의 miRNA 방출 추적

이 프로토콜은 중간엽 기질 세포에서 방출되는 세포외 소포체(EV)를 분류하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히 기기 설정 및 분류 조건의 최적화에 중점을 둡니다. 목표는 세포외 소포체의 특성을 보존하면서 분류하는 것입니다.

세포외 소포 격리를 위한 성공적인 분류 설정

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

배우세요 세포 배양 상청액에서 세포외 소포체(EV) 표면 표지자 CD9, CD63, CD81을 유동 세포 분석으로 검출하는 방법을. 항체 결합 비드를 이용한 면역침전법으로 재현성 높은 진단 바이오마커 분석이 가능합니다.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

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