Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름
2019년 2월 12일
프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.
세포 외 소포는 점점 많은 분야에서 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 치료 도구로 사용되고 있습니다. 흐름 세포측정은 슈트 얼굴 마커를 특성화하는 가장 직선적인 분석 방법은 이 프로토콜이 크기 가중 입자를 분석하는 데 사용될 수 있으며, 빠르며, 특별한 설정이나 전용 기기없이 종래의 지진계에 적용할 수 있다. 이 프로토콜은 말의 상태 및 매체에서 세포외 소포를 분류하는 데 사용되지만, 환자에서 침습적 조직 생검을 대체하기 위해 도착 한 AV의 분류로 확장 될 수 있습니다.
프로토콜에 새로운 연구원의 경우, 설정 방법 섹션에 설명된 단계를 수행하고, PBS에서 02%의 돼지 피부 젤라틴으로 55센티미터 제곱 페트리 접시를 코팅하여 시연된 얻기 전략을 밀접하게 따르는 것이 중요합니다. 15분 후, 접시와 접시를 4.4배 10회 각 접시에 각 접시에 10번 씻고, 이스코브의 변형된 덜베코 의 매체 또는 IMDM의 7밀리리터로, 20%의 태아 소 혈청, 1%페니실린과 연쇄상구균을 섭씨 57%에서 배양하여 1%를 보충한다. 세포가 약 80%의 합류에 도달하면 칼슘과 마그네슘없이 덜벡코의 PBS로 배양을 두 번 세척하고 혈청 무료 외식 생산 매체의 10 밀리터로 세포를 공급합니다.
7 일 후, 각 플레이트에서 조건된 배지를 단일 폴리 프로필렌 원심분리기 튜브로 풀을 만들고 배지를 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 100킬로달톤 원심분리기 필터 튜브로 슈퍼네텐트를 전송하고, 추가 원심분리로 클리어, 컨디셔닝, 배지를 농축한다. 최종 벤치탑 원심분리를 위해 마이크로 원심분리기 튜브로 농축을 옮기고 초나텐트를 폴리카보네이트 두꺼운 벽 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.
3.2 밀리터의 최종 부피로, PBS로 튜브를 채우고, 티타늄 고정 천사 로터에 샘플을로드합니다. 그런 다음 로터를 탁상 초원심분리기에 적재하여 초원심분리기를 하고, 신선한 PBS 의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재보페한다. 나노입자 추적 및 분석 정량화를 위해, PBS의 999 마이크로리터에서 초원심분리시 샘플의 마이크로리터 1을 희석하고, 기포 없이 1 밀리터 주사기에 샘플을 적재한다.
주사기를 검사실의 입구 포트에 적재하고 레이저를 켭니다. 캡처 버튼을 사용하여 카메라를 열고 포커스를 조정합니다. 그런 다음 각각 60초의 세 가지 프레임 이상을 기록하고 소프트웨어의 배치 프로세스 옵션을 사용하여 세 가지 다른 인수를 분석합니다.
수집을 위해 샘플을 준비하기 위해 먼저 적절한 실험적인 단일클론 항체 공액 포획 구슬을 1:1:1 비율로 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고, 그 결과 포획 비드 풀을 소용돌이시다. 다음으로, 적절한 샘플 부피를 캡처 비드 풀 1마이크로리터에 추가하여 8개 입자에 1배 10회, 시험 농도당 5구슬에 1.2배 10을 생성한다. 비드 1마이크로리터를 음수 조절으로 표시된 튜브에 추가하고 각 튜브의 볼륨을 신선한 PBS로 100 마이크로리터로 조정합니다.
그런 다음 튜브를 보온 믹서에 넣고, 분당 400회전, 하룻밤 사이에 섭씨 4~10°C로 흔들어 놓습니다. 다음 날, 샘플을 원형 하단 96 웰 플레이트로 전송하고, 각 우물에 적절한 플로레스시공 공액 항체를 추가한다. 섭씨 4~10도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 추가하고 인수 소프트웨어를 엽니다.
사이토미터 및 시스템 시작 프로그램을 선택하여 계측기를 시작하고 새로운 실험을 엽니다. 실험 템플릿을 만들고 플레이트를 선택하고 플레이트를 추가합니다. 플레이트의 샘플 위치를 선택하고 샘플을 잘 클릭하여 설정합니다.
명명 규칙에 샘플 이름을 입력하고 채널 탭을 열고 적절한 플로멘스 신호 채널을 선택합니다. 이제 접시를 기기에 로드합니다. 그리고 점 플롯을 클릭하여 측면 분산 영역 점 플롯과 비교하여 새 전방 분산 영역을 만듭니다.
초기화를 선택하여 레이저와 유체를 시작하고 실행을 클릭하여 인수를 시작합니다. 축척을 조정하여 전방 및 측면 산란 플롯의 중간에 있는 인구를 표시하고 전체 샘플 개체수 주위에 구슬 게이트를 그려 이물질을 제외합니다. 중지 및 점 플롯을 클릭하여 앞으로 분산 영역 점 플롯과 비교하여 전방 분산 높이를 만들고 구슬 모집단의 샘플을 게이트합니다.
더 큰 인구 주위에 새 게이트를 그리고 Singlets의 이름을 지정하고, 점 도표를 클릭하여 사용되는 실험형 형광당 당 측면 산란 영역 점 플롯에 비해 하나의 형광 신호를 만듭니다. 싱글츠의 새 점 플롯을 게이트합니다. 그런 다음 기록할 이벤트 수를 선택하고 레코드를 선택하여 실험 인수를 시작합니다.
분석이 끝나면 수집 파일을 적절한 분석 소프트웨어에 로드하고 새 프로토콜을 엽니다. 각 파일에 대해 점 플롯을 방금 설명한 대로 만들고 모든 분산 축을 선형 축으로 설정하고 모든 플로리스트센트 축을 로그 스케일로 설정합니다. 그런 다음 관련 신호 채널에서 플로레시엔스 기하학적 평균을 표시하여 다른 세포외 소포 제제에서 평균 꽃집 강도의 전체 변화를 계산합니다.
평균 플로레시센 강도 곡선의 초기 지수상에 도달하기 위해 세포외 소포의 가장 작은 총량을 설정하는 상이한 조건을 테스트한 후, 최소 입자 수는 염색당 8입자로 1배 10으로 결정되었다. 비특이적 항체 결합 없이 가장 높은 신호를 달성하기 위해 8입자에 대한 항체의 최적 농도는 항체에 대한 항체 CD9_FITC 및 항체 CD63_PE 항체 및 밀리리터 당 5마이크로그램 모두에 대해 밀리리터당 10 마이크로그램으로 결정되었으며, 항체에 대한 CD81_PE 항체에 대한 5마이크로그램. 방법의 적합성을 확인하기 위해, 컵 모양의 세포외 소포를 분석하기 위한, 멤브레인 파편이 아닌 세포외 소포는 초음파 처리되어 30 초의 초음파 처리 후 평균 꽃집 강도가 감소했으며 기계적 중단 1 분 후에 전혀 꽃을 감지하지 못했습니다.
입증 된 바와 같이 심장 전구 세포에서 X의 자신의 정제, 두 세포 집단에서 CD9와 CD81의 낮은 수준을 표현, 세포 외 소포를 산출한다. 또한 X의 표면 마커는 초원심 분리 없이 명확하게 식별할 수 있지만, 이 농축 단계는 이러한 마커의 평균 꽃집 강도를 크게 향상시킵니다. 세포 외 소포로 작업 할 때, 더 부주의 나노 입자 펠릿은 쉽게 놓칠 수 있다.
따라서 프로토콜에서 설명한 대로 모든 단계를 따르는 것이 필수적입니다. 세포외 소포를 바이오마커로 사용하는 것은 이제 가장 새로운 분야 연구 중 하나입니다. 그리고 곧, 대체 스크리닝 도구로 사용되는 임상 진단으로 번역될 수 있다.
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개요
이 프로토콜은 세포 배양 상청액을 사용하여 작은 세포외 소포체(EV)의 표면 에피토프를 검출하는 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 방법은 항체와 결합된 비드를 사용한 특정 EV 면역침전을 통해 표면 항원 CD9, CD63, CD81을 식별하고, 유세포 분석에 최적화되었습니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 세포외 소포체(EV)
- 진단 바이오마커
- 세포 배양 기술
배경
- EV는 중요한 진단 도구로 부상하고 있습니다.
- 유세포 분석은 EV를 특성화하기 위한 간단한 분석 방법을 제공합니다.
- 이 프로토콜은 다양한 생물학적 출처에서 나온 EV의 분류를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 특정 항체를 사용한 면역침전
- 심장 줄기 세포의 세포 배양
- 표지된 EV 분석을 위한 유세포 분석
주요 결과
- 이 방법은 EV의 표면 마커를 성공적으로 식별하고 정량화합니다.
- 검출을 위한 항체 농도의 최적 조건을 시연합니다.
- 별개의 EV 집단을 분석하는 데 적합함이 입증되었습니다.
결론
- 이 연구는 비침습적으로 EV를 특성화하는 방법을 설명합니다.
- 이 접근법은 다양한 분야의 진단 및 치료 개발에 중요한 의미를 가지고 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Flow cytometric analysis of extracellular vesicles (EVs) from cell-conditioned media enables semi-quantitative, high-throughput profiling of EV surface antigens, supporting early-stage biomarker discovery and mechanistic de-risking. This approach provides scalable, reproducible data on vesicle populations, facilitating confident target validation and translational continuity across discovery and preclinical pipelines. The method's compatibility with conventional flow cytometers enhances accessibility and enterprise-wide adoption for EV-based research initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV surface marker expression to clarify cellular communication pathways.
- Supports biological de-risking by distinguishing intact vesicles from membrane debris through sonication controls.
- Provides quantitative MFI data to inform predictive confidence in target selection and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated EV samples for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Standardizes assay conditions using antibody-conjugated beads and defined particle counts for reproducibility.
- Delivers scalable, quantitative outputs suitable for screening and comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV marker profiling with emerging translational biomarker strategies for non-invasive diagnostics.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation by supporting robust EV characterization.
- Reduces risk of false positives by confirming specificity for intact vesicles over debris.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust EV marker analysis from cell culture supernatants, supporting both early hypothesis testing and downstream translational research.
- Discovery Biology: Provides quantitative, reproducible EV marker data for hypothesis-driven pathway analysis.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility through standardized bead-based capture and MFI quantification.
- Analytics: Generates linear MFI-concentration correlations and enables statistical comparison of EV populations.
- Translational Research: Supports biomarker alignment for non-invasive diagnostic development when validated in relevant fluids.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly implementable protocol for EV analysis across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible EV analysis using widely available instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative EV data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-related discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and EV biology for optimal assay setup and interpretation.
- Needs access to conventional flow cytometers and ultracentrifugation equipment for sample preparation.
- Demands cross-team standardization of antibody panels and particle quantification protocols.
- Adaptable to various cell types and biological fluids with appropriate validation.
- Careful handling of nanoparticle pellets is essential to avoid sample loss, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Conditioned Medium Collection and Processing
2:45
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Quantification
3:27
Sample Preparation
4:17
Sample Acquisition and Analysis
6:32
Results: Representative Flow Cytometric Analyses of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Medium
7:58
Conclusion
