Name: 분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 학습하세요 분열 효모에서 성장 결함을 억제하는 돌연변이를 식별하는 돌연변이 유도 없는 억제자 스크리닝 방법을. 이 고효율 프로토콜은 유전적 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학, 보조금 1R15GM119105-01 K.Z. 지원 했다 우리는 모든 검토자를 대 한 통찰력 있는 의견 감사합니다. 우리 또한이 원고에 대 한 의견 및 토론에 대 한 제임스 터 커, 앨 리 앤더슨, 엘리자베스 블랙과 글렌 Marrs을 감사합니다.

1. 스트레인 건설 및 준비
<ol><li>돌연변이 또는 (yfm, 좋아하는 돌연변이) 유전자의 삭제26위에서 설명한 대로 표준 사이트 감독 mutagenesis (SDM)를 사용 하 여 생성 합니다.</li>
	<li>시작 하기 전에 화면, (최적의) 유전 배경 청소 부모의 긴장으로 신선한 태어난 돌연변이 세포를 생성 하는 야생-타입 긴장과 돌연변이 체 긴장 backcross. 연속 부모의 스트레인 개별 식민지 표준 리치 미디어 판에. 무작위로 8 16 독립적인 식민지 (생물 복제) 플레이트 리더 분석 결과 대 한 원하는 돌연변이와 선택 (3.1 참조). 참고:이 프로토콜 부모의 긴장 있다 액체 미디어 (최소 또는 풍부 하 고, 마약, 없이 또는 성장 결함을 일으키는 원인이 되는 온도 교대)에 결함 성장 하는 경우에 효과적입니다. 모든 부모의 긴장 단일 따라서 유전자 보완 짝짓기 형식과 다른 단일 긴장 교차 될 수 있게 해야 합니다.</li>
</ol>2. 플레이트 리더 분석 결과
<ol><li>메 마른 주걱 단계 1.1 (정확한 양을 접종 시작 하는 데 필요한 문화)에서 준비 하는 식민지의 각각의 작은 금액을 소요와 96 잘 폴리스 티 렌 microplate에. (부자 또는 최소한의 또는 약 없이) 적절 한 액체 미디어의 200 µ L에서 식민지의 각각을 일시 중단 합니다. 동일한 미디어 (셀)의 200 µ L을 포함 하는 접시에 모든 행에 대해 빈 잘 포함 됩니다.</li>
	<li>플레이트 리더 탐지 소프트웨어에는 다음 프로토콜 자동된 microplate 리더에 연결 된 실행: 연속 빠른 궤도 흔들어 (425 cpm, 3 m m 진폭)와 30 ° C에서 24 시간 및 온도 대 한 운동 프로그램을 설정. 광학 밀도, 600nm의 파장에서 빛 분산을 측정 하는 광학 읽기 설정 하 고 2 분 (잘 당 24 h 동안 721 총 읽습니다)의 독서 주파수에서 접시까지 읽기 빛을 설정 합니다.</li>
	<li>24 h, 마지막 숨겨진된 광학 밀도 판독 (숨겨진된 OD600)를 기록 하 고 다음 수식을 사용 하 여 각 마약까지 샘플을 희석 하는 데 필요한 볼륨을 확인 후 = 0.1: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59133/59133eq1v2.jpg"> 참고: 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터를 내보내기 하 고 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 일괄 처리 하는 함수에서 각 실험 잘 사용할 수 희석 볼륨 처리로 위의 수식을 삽입할.</li>
	<li>모든 24 시간 하루 0 마약으로 같은 미디어를 사용 하 여 샘플의 각각 희석 0.1 (약 1.5 x 106 셀/mL) = 2.3 단계에 표시 된 수식을 사용 하 여. 모든 성장 곡선 매일 생성 되 고 동일한 유전적 배경 가진 동료의 나머지 부분 보다 훨씬 높은 최종 마약 또는 유사의 성장 곡선에 의해 판단 하는 증가 증가 비율을 보여 주는 어떤 개별 식민지를 저장 야생-타입의 식민지 참고:이 분석 결과 일반적으로 약 7-14 일 걸립니다. 무 균 조건 하에서 모든 단계를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 억압 식민지 형의 확인의 선택.
<ol><li>플레이트 리더 분석 결과 (2.4 단계)의 마지막 날에서 액체 문화를 눈에 띄게 복구 된 성장 율, 아마도 부모의 돌연변이의 표현 형을 완화 수 있는 억압 돌연변이 확보 하 여 저장 합니다. 전송 및 250 µ L 액체 문화 50% 글리세롤의 250 µ L을 포함 하는 cryotube 혼합. 플래시 액체 질소에는 세포를 동결 하 고 무기한-80oC에서 긴장을 저장 합니다.</li>
	<li>억압 돌연변이 유전자 상속 요소 인지를 확인 하려면 메서드 사용 하 여 표준 유전 교차점 yfm P를 (대 한 플레이트 리더 분석 결과의 시작 부분에 사용 되는 부모, 긴장) yfm S (대 한 억압, 부담 끝에 저장 된 플레이트 리더 분석 결과의). 억압 돌연변이 유전자 상속 요소 이면 실제로 yfm P × yfm S까지 있는 두 식민지 부모의 스트레인의 질병 표현 형 있고 두 식민지 억압의 복구 된 성장 율을 산출 해야 한다 스트레인입니다.</li>
	<li>3.2 단계의 십자가에서 억압 형 (S 긴장)와 3 개의 식민지를 선택 하 고 동일한 유전자에서 부모의 표현 형 (P 스트레인)와 3 개의 식민지 (각 3 생물 복제), 교차 하 고 게놈 DNA 추출 진행 및 시퀀싱 단계 아래입니다. 참고: 단계 3.2 및 3.3이 좋습니다 있지만 필요 하지 않습니다. 또는, 하나 하나의 식민지로 풍부한 매체에 3.1에서 수집 하는 복구 된 액체 문화 확산 다음 무작위로 추가 유전자 확인 없이 전체 게놈 시퀀싱에 대 한 생물 학적 triplicates로 3 개의 식민지를 선택 수 있습니다. 이 경우에, 부모의 긴장의 3 개의 생물 학적 triplicates 게놈 시퀀싱 비교를 위해 사용 되어야 한다.</li>
</ol>4. 게놈 DNA 추출, 도서관 생산 및 연속.
<ol><li>DNA 추출, 라이브러리 준비 및 시퀀싱, 무작위로 yfm P 스트레인, 당 3 개의 생물 복제 선택 하 고 3 생물 각 개별적으로 일어 나 yfm S 긴장 또는 유전 십자가 (3.2 단계)에서 복제는 접시 S 스트레인 (단계 3.3 참고)의 단일 식민지를 확산.</li>
	<li>리치 미디어에 10 mL 문화에서 긴장 중간 로그 단계로 성장 (마약 = 0.5-0.8, 0.75-1.2 x 107 셀/mL에 대 한), 떨고 인큐베이터를 사용 하 여 지속적으로 250 rpm 동요 30 ° C에 액체 문화를 성장 하 고. 1000 x g에 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>수송과 세포 DNA 추출 버퍼의 400 µ L 일시 중단 (2% 트라이 톤 X-100, 1 %SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 m m 나2-EDTA), 유리 구슬의 400 µ L 및 400 µ L 25:24:1 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜의 추가. 4 ° c.에 2 분 동안 적극적으로 소용돌이</li>
	<li>여러 번을 반전 하 여 DNA 추출 버퍼와 섞어 추가 200 µ L를 추가 합니다. 20000 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>깨끗 한 관을 수성 단계 전송의 RNase A/T1, 20 µ g을 추가 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>25:24:1 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜, 20000 x g에 4 ° C에서 5 분 동안 회전 급강하의 동등한 볼륨 추가 다음 깨끗 한 관을 수성 단계를 전송 합니다.</li>
	<li>클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가, 여러 번을 반전 하 여 혼합 다음 20000 x g에 4 ° C에서 5 분 동안 회전 깨끗 한 관을 수성 단계를 전송 합니다.</li>
	<li>100% 에탄올의 두 개의 볼륨 플러스 적어도 2 시간 동안-20 ° C에서 3 M NaOAC (pH 4.3)의 10% 볼륨 촉진 DNA는 다음 20000 x g 와 수집 펠 릿에서 4 ° C에서 5 분에 대 한 스핀.</li>
	<li>펠 릿 (침전 된 DNA) 냉장된 70% 에탄올 (20000 x g, 5 분, 4 ° C에서 원심 분리기)로 두 번 세척 하 고 50 µ L 10 mm Tris 버퍼 (pH 7.4)에 펠 릿을 일시 중단.</li>
	<li>사용 라이브러리 준비 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 권장 사항을 전체 게놈 시퀀싱 라이브러리를 준비 하 당. 참고: 오류 돌연변이 PCR 증폭 하는 동안 생성을 최소화 하는 PCR 증폭 없이 게놈 라이브러리의 건설을 허용 하기 때문에 재료의 테이블에 에서 나열 된 키트는 것이 좋습니다. 또한, 게놈 라이브러리 준비 하는 동안 허용 하지 않습니다에 구슬 비드 건조 시간 1-2 분을 단축 하 여 완전히 건조.</li>
	<li>라이브러리 준비 하는 동안 매개 변수를 전단에 대 한 집중된 sonicator 사용 ( 재료의 표참조)와 20%, 버스트, 당 200 사이클 175 W, 피크 전력 듀티 계수를 설정 하 고 5.5oC ~ 6 ° C 45에서 주파수 연소 모드 또는 s., 사용을 DNA와 chomatin 시스템 전단 ( 재료의 표참조) 다음 설정을 가진: 펄스 모드, 15 4 ° C에서 50% 진폭 s에와 15-10 분, 20 분의 총 처리 시간에 대 한 시작.</li>
	<li>주의이 단계에서 사용 되는 유해 물질을 처리 하기 위해 필수적 이다. NaOAC, 에탄올, 25:24:1 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 및 클로 프롬을 처리 하기 위한 적절 한 재료 안전 데이터 시트와 기관의 환경 건강 및 안전 사무실을 참조 하십시오.</li>
	<li>결과 게놈 라이브러리를 시퀀스. 전체 시퀀싱 읽기 단일 뉴클레오티드 범위에서 해상도 전체 게놈의 적어도 3 시간을 포함 해야 한다. 짝-엔드 시퀀싱 (또는 최신 기술) 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. 생물 정보학 분석 억압 돌연변이의 id에 대 한
<ol><li>보호자 사이 일관 되 게 식별 되는 게놈 변화에 초점을 생물 정보학 분석을 수행 하 고 모든 생물에서 억제 yfm 변종 복제 합니다. 참고: 완전 한 파이프라인 프로세스는 아래에 설명 된, 하지만, 또한, 두 개의 일반 텍스트 BASH 스크립트 파일, fastq_to_vcf.sh 및 vcfprocess.sh, VCF variant 읽기의 처리에서 워크플로의 예를 보여을 보충 자료로 포함 되어 있습니다. 파일 처리 및 교차로의 VCF 파일, 각각.</li>
	<li>트림 짧은-읽기 전단 (https://github.com/jbpease/shear) 다음 명령줄 (모든 다른 옵션 기본값)를 사용 하 여: shear.py-fq1 $FASTQ1-fq2 $FASTQ2-out1 $OUTFQ1-out2 $OUTFQ2 \ -barcodes1 $BARCODE-플랫폼 TruSeq-trimqual 20시 20분 \ trimpolyat-0-trimambig-filterlength 50-filterunpaired</li>
	<li>지도는 PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/)에서 얻은 S. pombe 참조 게놈 v2.30 BWA v0.7.1527을 사용 하 여 읽습니다. 다음 명령줄 (모든 다른 옵션 기본값)를 사용 하 여: bwa mem-8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 t &gt; $SAM1</li>
	<li>GATK를 통해 맞춤 SAM 파일을 넣어 유용한28 변형 전화 GATK v 3.629, PicardTools v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard), 그리고 SAMtools v1.3.130을 사용 하 여 파이프라인. 사용 하 여 다음 명령줄과 매개 변수 (모든 다른 옵션 기본값). 자바-Xmx30g-picard.jar AddOrReplaceReadGroups 입력 항아리 $SAM1 = \ 출력 $BAMMARKED RGID = 1 RGLB = lib01 RGPL = illumina = \ RGPU $BARCODE RGSM = $SAMPLENUMBER = samtools fixmate-O bam $BAMMARKED $BAMFIXED samtools 정렬-O bam-o $BAMSORTED-T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED samtools 인덱스 $BAMSORTED 자바-Xmx30g-GenomeAnalysisTK.jar-T 자 HaplotypeCaller \ -R $GENOME-$BAMSORTED-genotyping_mode 발견 나 \ -stand_emit_conf 10-stand_call_conf 30-o $VCFRAW</li>
	<li>Tabix를 사용 하 여 압축 및 인덱스 VCF 파일: bgzip $VCFRAW.vcf tabix $VCFRAW.vcf.gz</li>
	<li>보호자 중 VCF 파일을 비교 및 억압 변종 BCFtools v1.3.127을 사용 하 여 연속 복제. 사용 하 여 다음 명령줄과 매개 변수 (모든 다른 옵션 왼쪽된 기본값). bcftools isec-n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \ $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz &gt; common_variants.list 참고:이 명령은 나왔고 시퀀스 변종만 첫 번째 돌연변이에 나타나는 것이 어디 "000100", "000010", "000111,"로 모든 3 명의 돌연변이 서만 두 번째 돌연변이로 이진 인코딩된 이진 패턴을 사용 하 여 인코딩된 파일 등. 이러한 파일은 보호자의 각 집합에 대해 생성 된 그리고 VCF 파일을 복제 하는 돌연변이.</li>
	<li>UNIX grep 명령을 사용 하 여 각 라인에 추가 하는 파일 이름과 함께 변형 교차로 목록 파일을 컴파일하십시오. grep "." *.list &gt; all.list</li>
	<li>사용자 지정 Python 스크립트 (variant_characterize.py)를 사용 하 여 현재 GFF3 주석 파일 (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3)와 함께 완전 한 변형 목록을 상호 참조 에 단백질 코딩 영역 (동의어 및 비 동의어), 5 '과 3 ' Utr, 및 ncRNA에서 일관 된 SNP 사이트를 식별 합니다. python3 variant_characterize.py-목록 common_variants.list \ -gff schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \ -fasta Schizosaccharomyces_pombe입니다. ASM294v2.30.dna.genome.fa \ -패턴 000100-all.list.filter.000100 개 이 스크립트 수정 반복--패턴 출력 파일의 접미사 (-밖으로) 이진 파일을 사용 하 여 패턴: 000010, 000001, 000110, 000011, 000101, 및 000111</li>
	<li>스프레드시트도 볼 수 있도록 탭으로 구분 된 파일에서 이러한 모든 스크립트 실행의 출력을 결합 합니다. 이체의 주석된 테이블 배경 기준 중 하나 또는 둘 다 돌연변이 strain(s)에 나타나는 포함 합니다. 이진 플래그 필드 나타냅니다 (000100, 000010, 000001), 단일 돌연변이 스트레인에 어느 모양 두 돌연변이 체 긴장 (000011 000101, 000110), 또는 모든 3 개의 돌연변이 체 긴장 (000111).</li>
	<li>변종 부모의 샘플에서 찾을 수 없습니다 하지만 1, 2, 또는 모든 3 개의 돌연변이 샘플에서 발견의 출력 주석 목록을 분석. 주석을 genomic 위치 및 variant (동의어/비-동의어 코딩 영역에서 3/5' UTR, 비 코딩, 등.)의 클래스를 나타냅니다. 후보 돌연변이의이 목록에서 강하게 관련 후보자의 예는 모든 3 개의 긴장에 일관 되 게 나타나는 비 동의어 코딩 변종 수 있습니다. 또 다른 유형의 강한 후보 가깝게 또는 동일한 유전자에서 나타나는 돌연변이 체 긴장에 다양 한 비 동의어 또는 상 상속 규정 돌연변이의 축적 될 것 이다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 방법과 아무 경쟁 금융 관심사에 사용 된 계기의 제조 업체에 의해 아무 보증을 선언 합니다.

여기에 설명 된 프로토콜 나타냅니다 소설과 자발적인 억압 돌연변이 돌연변이 분열 효 모, S. pombe에 400 개 이상의 유전자의 표현 형에 있는 느린 성장 부여의 phenotypic 복구 통해 감지에 대 한 간단한 화면에 함수는 많은의 알 수 없는2,32남아 있습니다. 이전 방법 억압 돌연변이 미생물, 온도 민감한 돌연변이 배경33mutagens21의 사용 또는 온도 변화에의 응용 프로그램을 포함 하 여에 대 한 화면에 다른 접근을 하고있다. 이 프로토콜 phenotypic 복구 추가 환경/화학 간섭 없이 발생 하 고 결국 액체에 사용할 수 있는 리소스를 인계 억제 돌연변이 피트 니스 이용 하이라이트를 표시 하는 반면, 문화입니다. 그것은 elf1∆ 또는 fal1∆ 같은 두 손실의 기능 돌연변이 및 clr6-1, 만큼 돌연변이 점 돌연변이 대 한 효과가 있기 때문에이 화면 우회 진압 또는 상호 작용 진압의 격리를 허용 액체 문화에서 피트 니스 결함을 보여 줍니다.
지금까지 우리가 조사 하는 복구 된 S 긴장 전부 phenotypic 복구의 다양 한 각도 증명 하고있다. 유전자 교차를 통해 감지, 복구 된 표현 형 단일 유전 요소에 기인 이며 상속 (예제 그림2). 이 종종 여러 개의 게놈 loci를 대상 화학 물질 또는 UV 기반 억압 화면에 비해이 방법의 가장 중요 한 장점 중 하나입니다. 16 식민지/스트레인 (약 10%)에서 복구 하는 하나 또는 두 개의 식민지를 관찰 하는 것이 일반적입니다. 내 주. 그러나, 우리는 Rrp6, 핵 관련 exosome 소 단위 적 거의 야생-타입 성장 속도를 복구의 기능의 손실 등 특정 돌연변이 elf1Δ 셀31에서 관찰을 주의 했다. 그것은 가능성이 그 Rrp6의 기능 수만 부분적으로 보상 진압, 달리 다른 돌연변이 테스트, fal1∆, 규제에 그것의 중요 한 기능을 통해 심각한 meiotic 결함을 표시 했다는 등의 함수에 의해 34접합 우리는 yfg 세포 성장에 고유, 비 교체 역할 때 그 대체 억압 심사 방법 같은 문제가 대상이 될 것 이라고 믿습니다.
게놈 시퀀싱을 수행 하기 전에 다시-크로스 플레이트 리더, 유전 배경 선택을 취소 하 고를 가져오는 생물 복제 부모의 긴장에서에서 식별 phenotypically 복구 된 식민지에 최적입니다. 또한, 깊은 전체 게놈 시퀀싱 단일 뉴클레오티드 변화, 대부분의 심사에 대 한 작은 관심의 생물 복제 사이 동일 하지 않은의 수백을 식별 합니다. 예를 들어 우리는 모든 3 개의 염색체 두 elf1Δ P와 5 다른 S 긴장 (그림 3) 사이 걸쳐 660 게놈 변경의 총 발견. 우리 않았다 일반적으로 관찰 하지 각 스트레인의 복제 시퀀스 생물 사이 동일한 돌연변이 새로운 돌연변이 게놈 라이브러리 건설 하기 전에 elf1Δ 세포의 경작 하는 동안 발생할 수 있습니다 또는 임의의 오류가 있을 수 있습니다 제안 라이브러리 건설 및 시퀀싱 하는 동안 도입. 그러므로, 생물 복제에서 일치 하는 돌연변이 고립 시키는 전체 게놈 시퀀싱을 사용 하 여 진압의 성공적인 식별에 중요 한 측면 이다.
우리는 확인 하 고 5 시퀀스 S 긴장에서 CD 영역에 두 개의 진압을 확인. SPBPJ4664.02 에 돌연변이 S a 1과 S-a 2 긴장에서 발견 되었습니다, 하지만 그것은 S-a 1과 S-a 2에서 포함 되지 않은 동일한 유전자에 억압은 서로 (보완 하기 때문에 SPBPJ4664.02 는 유효한 억압 데이터에 표시 되지 않음)입니다. 우리는 또한 rli1 S-A3, 공동 elf1Δ와 backcrossed 때 S 형으로 분리 하지 않았다에 확인 하지 않았다. 또는, 우리는 S-a 1, S-a 2와 S a 3에서 비 코딩 영역에 특정 돌연변이 발견. 이러한 변경 된 비 코딩 게놈 영역 우리의 미래 연구에 해결 될 것입니다 elf1Δ 표현 형을 완화 가능 하다. 연계 분석 결과, 유전자 변이 매핑할 수 년이 걸릴 수 있습니다, 같은 전통적인 방법에 비해 monogenic 요소 S 표현 형 발생을 확인 한 후 2 개월 이내 두 진압 파악. 전체 게놈 시퀀싱 기술의 빠른 발전으로 우리는 낙관적이 방법을 더 효율적 장래에 일관 된 유전자 변이 식별 된다는 것입니다.
요약 하자면,이 프로토콜 성공적으로 액체 문화에서 느린 성장 결함 관심의 모든 유전자에 대 한 억압 돌연변이 식별 하는 단계별 지침을 제공 합니다. 이 분석 결과의 단순 작은 실습 교육의 여러 유전 배경의 대규모 심사에 대 한 수 있습니다. 추가 매일 희석을 수행 하는 액체 처리 로봇을 사용 하 여 프로세스를 자동화 하는 공간이 있다. 미생물의 실험실 조작 성장 액체 문화, 헬스, 본질적으로 선택적 프로세스를 필연적으로 필요 하므로이 프로토콜 박테리아와 같은 다른 큰 인구 모형 유기 체에 광범위 하 게 적용 될 수는 제안 하 고 다른 효 모 종입니다.

유전자 간의 기능 링크 이해의 기초는 분자 따라 장치를 마더보드에는 복잡 한 유전 특성 생산 다양 한 고기1분기를 식별 하는 기능에 의존 합니다. 분열 효 모, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)에서 단백질 코딩 유전자의 대부분은 생존2불가결. 이 결과이 유전자의 unimportance 하지만 이러한 유전자가 속한 생화학 경로 기본 복잡 한 보상 메커니즘에 오히려 말을 하지 않습니다. 이러한 보상 메커니즘을 해 부 epistasis 지도, 포괄적인 유전 상호 작용을 발견 하 고 확대 기능 생화학 경로3,4의 우리의 이해는 생성 했다.
높은 처리량 방법 (예를 들어, 합성 유전자 배열 분석, 또는 SGA) 신진 효 모, 게놈 전체 유전자 상호 작용을 식별 하 여 분열 효 모5,6에 사용 하기 위해 확장 되어 개발 되었습니다. 이러한 방법을 자주 모든 가능한 단일 단백질 코딩 유전자 삭제를 포함 하는 긴장의 라이브러리에 의존 (약 3300 단일 삭제 돌연변이 취재 분열 효 모 게놈의 92% 이상), 사이 유전 십자가 수행 하기 위해 로봇 팔 필요는 관심과 library6에서 모든 가능한 긴장 긴장 또한, SGA 기술을 적절 하 고 효율적인 짝짓기를 라이브러리 긴장의 능력에 따라, 현재 444로 비정상 이다 표현 형 특징 S. pombe2유전자.
유전 상호 작용의 복잡성에도 불구 하 고 각 유전자의 개별 돌연변이 나르는 2 개의 긴장의 표현 형에 2 개의 유전자에 돌연변이 들고 긴장의 표현 형을 비교 하나를 가질 수의 2 개의 주목할 만한 결과: 1) 이중 돌연변이 표현 형이 가장 극단적인 경우, 치 사 율, 또는 질병의 형태로 예상된 곱셈 부모의 고기 보다 더. 이 부정적인 유전자 상호 작용 이라고 그리고 일반적으로 두 유전자 병렬 생물학 통로에 행동 하는 서명입니다. 2) 이중 돌연변이 표현 형 부모의 고기로 알려진 또한 긍정적인 유전자 상호 작용의 예상된 조합 보다 낫다. 때문에이 유전자 동일한 프로세스에서 작동 나타냅니다 긍정적인 유전자 상호 작용 특히 흥미롭습니다. 2 개의 긍정적인 상호 작용 유전자는 3 개의 잠재적인 관계: 돌연변이 유전자 수 최대-규제는 병렬 통로에 다른 유전자의 표현, 두 유전자는 서로 동일한 통로 하류 내 콘서트에서 일할 수 있습니다 또는 두 유전자 인코딩 직접 상호 작용 하는 단백질. 따라서, 긍정적인 유전자 상호 작용 유전자 규정 노드를 지도 하 고 생화학 경로7,8에 새롭거나 유전자 분류를 사용할 수 있습니다.
억압은 돌연변이 다른 유전자의 돌연변이의 질병 표현 형을 완화 수 있는 일반적으로 대표 하는 두 개의 유전자9,10사이의 긍정적인 유전 상호 작용. 그들은 억제 하는 돌연변이의 다른 장소에 억압 돌연변이 extragenic 진압으로 알려져 있습니다. 그들은 합성으로 치명적인 형 (나사로 효과 라고도 함)11를 구출 하 여 비-가능한 유전자 변이 공부에 특히 귀중 한. 그들은 또한 유전 질병12,13치료에 잠재적인 치료 응용 프로그램 있다.
모든 이러한 이유로, 다양 한 모델 생물에서 억압 돌연변이의 식별은 다양 한 생화학 경로14,,1516의 우리의 이해를 촉진 하기 위하여 널리 이용 되어. 진압에 대 한 심사에 돌연변이의 표현 형에 일반적으로 기반으로 하며 돌연변이 표현 형을 완화 것을 임의의 mutagenesis 실시. 거의 모든 모형 유기 체는 무작위 mutagenesis 방법을 설립 했다. 예를 들어 N-에틸-N-nitrosourea (ENU) 및 ethylmethanesulfonate (EMS), 두 mutagens 포인트 DNA에 돌연변이 유도 할 수 있다, 쥐17,,1819 에 박테리아에서 다양 한 모델에서 널리 채택 된다 . 또한, 염화 망간 오래 사용 되었습니다 효 모에 망간 양이온의 능력을 억제 하는 DNA 수 선 통로20에 대 한. 또 다른 일반적인 접근은 UV 유도 된 mutagenesis 생성 게놈 넓은 돌연변이 pyrimidine 이합체21,22.
비록 억압 돌연변이 식별 하기 위해 화학 mutagenesis의 활용은 인기가, 메서드는 위험한 화학 물질, 높은 변수 성공률, 그리고 여분의 혼란 변수의 도입의 사용을 포함 하 여 많은 단점 여러 세포 프로세스23,24에 mutagen의 부정적인 부작용을 제시한. 또한, 화학 mutagenesis는 종종 추가 유전 사용 하 여 복잡 하 고 시퀀싱 기술을 억압 표현 형 유기 체25에서 수 여 하는 정확한 돌연변이 식별 하는 게놈에서 여러 돌연변이 유도 합니다.
현재 mutagenesis 방식의 단점을 해결 하기 위해 우리는 어떤 mutagens 또는 삭제 라이브러리에 의존 하지 않는 분열 효 모에 자발적인 억압 돌연변이 대 한 화면을 방법 제시. 메서드를 사용 하면 격리 긍정적인 선택 분석 결과 통해 진압 합니다. 이 방법의 원리는 자동된 플레이트 리더에 의해 모니터링 될 수 이다 액체 문화에서 돌연변이 억압 부분 모집단의 성장 우위를 기반으로 합니다. 짝짓기와 감수 분열 한 유전 배경 정리 또는 전체 게놈 시퀀싱 전에 진압의 monogenic 대립 유전자의 존재를 확인 하려는 경우에 사용 됩니다. 억제 형 단일 돌연변이 의해 발생 하는 경우 억압 형과 부모의 종자 backcrossing 후 2: 2를 분리 합니다. 억압 돌연변이 다음 전체 게놈 시퀀싱을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 메서드는 액체 문화에서 큰 인구를 성장할 수 있는 모든 미생물에 진압 심사 적용 제안 한다.

<table><tbody><tr><td>아데닌, 분말</td><td>Acros 유기물</td><td>147441000</td><td>액체 및 고체 리치 미디어 (YEA)를 만들기 위해 75 mg / L에서 사용</td></tr> 세<tr><td>균학 페트리 접시</td><td>코닝, 팔</td><td></td>콘 <td>C351029 100 &times; 15 mm, 고체 리치 미디어</td></tr><tr><td>D-글루코스 무수, 파우더</td><td>피셔 화학</td><td>D16-1</td><td>액체 및 고체 리치 미디어 (YEA)를 만들기 위해 30 g/L에서 사용하여</td></tr> <tr><td>Difco Agar, Granuated</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td>를 만드는 데 사용합니다.<td>214530</td><td>20 g / L에서 사용하여 고체 리치 매체 (YEA)</td></tr> <tr><td>DNA 추출 완충액</td><td></td><td></td><td>2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA</td></tr><tr><td>집속 초음파기</td><td>Covaris Inc.</td><td>S220</td><td>또는 QSonica Q800R 초음파 처리기/DNA 및 염색질 전단 시스템</td></tr><tr><td>Gen5 데이터 수집 및 분석 소프트웨어</td><td>Biotek, Inc.를 사용합니다.</td><td>GEN5SECURE</td><td>또는 이에 상응하는 것은 마이크로 판 독자와 호환되어야 하고, 마이크로 판 독자에서 자료 읽기를 수출하기 위하여 사용하십시오</td></tr><tr><td>염산 1N, 액체</td><td>피셔 화학물질</td><td>SA48-4</td><td>액체 및 단단한 풍부한 매체에서 pH를 5.5로 조정하는 데 사용</td></tr><tr><td>액체 풍부 매체 (액체 YEA)</td><td></td><td></td> <td>30 g/L D-포도당, 5 g/L 효모 추출물, 75 mg/L 아데닌, 1M HCl</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더, Synergy H1 하이브리드 다중 모드 리더</td>로 pH를 5.5로 조정한 <td>Biotek, Inc.</td><td>BTH1MG</td><td>또는 이에 상응하는 것은 600nm 파장 범위에서 가시광선을 읽어야 합니다</td></tr><tr><td>리치 미디어 한천 플레이트(YEA 플레이트)</td><td></td><td></td><td>30g/L D-포도당, 5g/L 효모 추출물, 75mg/L 아데닌, 20g/L 한천, 1M HCl로 5.5로 pH 조정.</td></tr><tr><td>RNase A/T1 mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0551</td><td>제조업체 권장 사항에 따라 사용</td></tr><tr><td>멸균 폴리스티렌 접종 루프</td><td>Corning, Inc.</td><td>OS101</td><td>또는 동급, 한천 플레이트에서 96웰 플레이트로 콜로니를 옮기는 데 사용</td></tr><tr><td>멸균 작업 공간 및 버너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 저증발 뚜껑이 있는 96웰 광학 평면 바닥</td><td>Corning, Falcon</td><td>C353072</td><td>또는 이와 동등한 제품, 마이크로 플레이트 준비를 위한 광학 평면 바닥이 있어야 함</td></tr><tr><td>TruSeq DNA PCR-Free LT/HT 라이브러리 준비 키트</td><td>Illumina, Inc.</td><td>20015962</td><td>전체 게놈 시퀀싱 라이브러리</td></tr><tr><td>효모 추출물, 분말</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP1422-500</td>을 준비하는 데 사용 <td>5g/L에서 사용하여 액체 및 고체 리치 미디어(YEA)를 만듭니다.</td></tr></tbody></table>

분열 효 모 schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Phenotypic 결함 돌연변이 의해 발생을 억제 하는 돌연변이 체 대립 유전자에 대 한 유전 스크린 밀접 하 게 관련 된 생화학 경로에 속하는 유전자를 식별 하는 강력한 접근 이다. 합성 유전자 배열 (SGA) 분석, 및 자외선 (UV) 또는 에틸 methanesulfonate (EMS) 또는 N-에틸-N-nitrosourea (ENU) 같은 화학 물질을 사용 하 여 임의의 mutagenesis 기법 등 이전 방법을 널리 사용 하지만 종종 비용이 많이 드는 고 힘 드는. 또한, 이러한 돌연 기반 심사 방법을 자주 분리는 진압의 복합성에 추가 하는 여러 돌연변이 유도 하는 유기 체에 심각한 부작용에 연관 됩니다. 여기, 우리 Schizosaccharomyces pombe성장 결함을 부여 하는 돌연변이에 억압 돌연변이 식별 하는 간단 하 고 효과적인 프로토콜을 제시. 연장된 기간 동안 자동된 96 잘 접시 리더를 사용 하 여 복구에 대 한 표준 풍부한 액체 미디어 또는 합성 액체 미디어 성장 결핍과 세포의 적합성을 모니터링할 수 있습니다. 일단 셀 문화에서 억압 돌연변이 획득, 하위 노르만족 부모의 셀의. 부모 셀의 경쟁력 있는 성장 이점을 복구 된 셀 다음 격리 하 고 부모의 셀과 backcrossed 수 있습니다. 억압 돌연변이 다음 전체 게놈 시퀀싱을 사용 하 여 식별 됩니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 성공적으로 고립 된 Elf1는 AAA + 가족 ATPase 핵 mRNA 전송 및 게놈 안정성의 유지 보수에 중요 한 그의 손실에 의해 발생 하는 심각한 성장 결함을 완화 하는 여러 진압. 현재 400 유전자 이상에 있다 S. pombe 성장 결함을 부여 하는 돌연변이 함께. 이 유전자의 많은 특징이 되지 않습니다, 우리는 우리의 방법은이 사용자 친화적인, 높은 처리량 방법 소설 기능 상호 작용의 id를 서두르는 것입니다 제안 합니다.

느린-성장 돌연변이 액체 문화에서 phenotypic 회복을 보여 우리 다양 한 아픈, 느린 성장 형으로 생물 학적 경로에 관련 된 3 명의 돌연변이 선택: AAA 가족 ATPase Elf1, 히스톤 Deacetylase Clr6, 그리고 엑손 접합 복잡 한 구성 요소 Fal1. 야생-타입 긴장과 긴장 야생-타입 종자와 backcrossed 했다이 3 개의 유전자의 돌연변이 들고 개별 식민지, 줄무늬 했다 그리고 16 단일 식민지 했다 무작위로 선택 교양으로 96 잘 접시를 사용 하 여 풍부한 액체 미디어에 위에서 설명한. 개별 식민지의 성장 곡선 연속 모니터링 플레이트 리더를 사용 하 여 초기 시간 시점 (0 일)과 6 일 동안 기록 되었다. 예상 했던 대로, 야생-타입 식민지 실험31 (그림 1)를 통해 그들의 성장 곡선에 더 눈에 띄는 변화를 보여줍니다. 특히, elf1∆ 배경 4 식민지와 하나의 fal1∆ 식민지 보여 극적인 변화 성장의 몇 가지 다양 한 수준으로 느린 성장에서 성장에 유사 하거나 야생-타입 식민지의 가까이. 극적으로, 모든 clr6-1 돌연변이 분석 결과31 (그림 1)의 끝으로 빠른 속도로 성장 하 고 일관 된 phenotypic 회복을 보여. 다른 고기 특성, 우리는 느린-성장 하 고 "P 긴장" (또는 보호자 긴장)는 원래 긴장 하 고 긴장 phenotypic 복구 "S 긴장" (또는 억제 된 변종)로 표시를 참조 하십시오. 그림 1 심사 실험의 한 라운드의 예 이며, 총 비 보완 진압 식별 및 다음 대표 결과 순차화를 대표 하지 않습니다를 note 하시기 바랍니다.
Phenotypic 복구 상속 특성에 기인 S. pombe 리치 미디어에서 단일 하지만 질소 기아에서 보완 짝짓기 종류 친구와 두 개의 단일 긴장으로 성장할 수 있다. 분열 효 모 감수 분열 세포 분열의 2 라운드 뒤 중복의 라운드를 수반 한다. 성적 사이클 2:2 (그림 2A) 클래식 Mendelian 유전학의 규칙에 따라 유전 형질의 분리와 부모의 스트레인의 유전 물질을 운반 하는 4 개의 단일 포자의 형성 결과입니다. 동일한 시간 동안 동일한 접시에 성장, 우리 확인 2:2 분리 때 다시 건너 모든 억압 긴장 (S 변종)과 작은 2 (성장 결함) 및 대형 2 (억압 형)는 그들의 부모의 종자 (P 긴장) 식민지입니다. 억제 된 elf1∆, clr6-1 및 fal1∆ 세포에 대 한 개별 예제는 그림 2B에 표시 됩니다. 우리는 모든 격리 된 S 긴장 그들의 P 긴장 (데이터 표시 되지 않음)의 느린 성장 형 억제 monogenic 유전적 요소를가지고 확인 했습니다.
전체 게놈 시퀀싱 성공적으로 억압 돌연변이 식별 예를 들어, 우리는 elf1∆ S 긴장에서 phenotypic 복구에 대 한 책임 유전 요소를 식별 하 쌍 간 전체 게놈 시퀀싱을 사용. 데이터 분석의 자세한 설명 사용할 수 온라인31이다. 짧게, 우리 두 독립적으로 생성 된 elf1∆ P 긴장의 생물 triplicates와 elf1∆ S 긴장, 각각 포함 된 다른 진압의 5 비 보완 그룹의 생물 학적 중복 고용. 후 우리 생물 정보학 분석 (6.1-10)에서 주석 변종의 목록 우리는 우리의 분석에 관련 된 이체의 특정 클래스 우선. 우리 모든 개별 elf1∆ S 긴장 그들의 부모의 elf1∆ P 긴장 (그림 3 및 보조 테이블 1-4에 비해의 생물 복제의 동일 했다 일관 된 게놈 변경 식별에 초점을 맞춘 ). 우리는 모두 5 가지 elf1∆ S 변종이 포함 rli1 +, SPBPJ4664.02, cue2 + rpl2702 +에서 CD 영역에서 5 nonsynonymous 변경 확인. S-a 1과 S-a 2 다른 아미노산에는 돌연변이 발생 하지만 돌연변이 SPBPJ4664.02를 포함 되어 있습니다. SPBPJ4664.02 긴 유전자 (11,916 뉴클레오티드)의 반복 이므로 돌연변이 시퀀싱 뒤 PCR을 수행 하 여 확인 될 수 없었습니다. S-a 3 삭제 돌연변이 생물 모두 중복에 일치 하는 rli1 에 포함 되어 있습니다. 그러나, 돌연변이 공동 elf1∆ 배경에서 S 형으로 분리를 하지 않았다. 우리는 아미노산으로 S 1에서 cue2 돌연변이 (cue2-1) 396-400 누락 확인. S-b 2 Aspartate31위치 45에서 아미노산 글리신에서 변경 되는 rpl2702 돌연변이 (rpl2702-1)에 포함 되어 있습니다. 아래와 같이 cue2-1 및 rpl2702-1 elf1∆ 진압으로 확인 되었다.
복구 형의 상속 가능성을 확인 하는 확인 된 억압 돌연변이의 유전자 확인 확인 된 nonsynonymous 변경, cue2-1 rpl2702-1, 2 사이트 지시 된 mutagenesis에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 실험실에서 재건 되었다. 이중 돌연변이 변종 cue2-1 elf1∆ P 와 rpl2702-1 elf1∆ P 무료 elf1∆ P 스트레인31 (그림 4) 교차 했다. 이 화면을 통해 확인 된 nonsynonymous 돌연변이, elf1∆ P를 억제 하기에 충분 했다, 다음 결과 표시 됩니다 2:2 큰 비율에 작은 식민지에 각 tetrad 4 포자에서 결과에. 실제로, 유전자 교차 확인 된 억압 돌연변이 elf1∆ P 의 느린 성장 형 억제에 성공 하는 및 상속는 보여주었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2.jpg"> 그림 1: Phenotypic 복구 플레이트 리더에서 성장 곡선을 기록 하 여 모니터링할 수 있습니다. 야생-타입 (WT), elf1∆, clr6 1, fal1∆ 의 16 단일 식민지 96 잘 접시에 배치 했다. 성장 곡선 24 h 동안 기록 되었다 그리고 식민지 리치 미디어에 (서) 매일 다시 희석 했다. 성장 결함 0 하루에 24 시간 기간의 끝에 낮은 흡 광도 (마약)에 의해 분명 하다. Phenotypically 복구 된 종자는 비슷한, 또는의 가까이, 성장 곡선을 표시 하는 주 6에서 24 h 동안 야생-타입. Elf1∆, fal1∆의 한 식민지 및 clr6-1 의 모든 식민지의 4 식민지 6 일 후 phenotypic 복구의 다양 한 수준으로 나타났다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2.jpg"> 그림 2: 유전 교차점 phenotypic 복구 단일 상속 대립 유전자에 따라 결정 됩니다 확인할 수 있습니다. (A) 때 분열 효 모 세포 질소 기아, 보완 짝짓기 형식과 두 개의 단일 셀을 복종 된다 zygote tetrad 4 포자의 생성 하기 위해 sporulates를 생성할 수 있습니다. 부모의 유전 재료는 Mendelian 유전학의 규칙에 따라 감수 분열 동안 분리 합니다. (B) Phenotypically 식민지 회복 (레이블된 S 표시 되지 대 한)로 나타난 부모의 genotypes 했다 그들의 무료 부모 식민지로 다시 넘어 (아무 phenotypic 복구, P에 대 한 분류를 보여 주는 부모의). 유전 십자가 2:2 작은 표시 (불 쌍 한 피트 니스) 대형 (복구 된 피트 니스) 식민지 phenotypic 복구 상속 이며 단일 유전 요소에 표시 될 수 있습니다 보여줍니다. 빨간 상자는 식민지 억압 대립 유전자를 운반 하 고 파란색 상자는 부모의 대립 유전자를 운반 하는 식민지. 이 그림에서 Marayati 그 외 여러분, 201831수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2.jpg"> 그림 3: 유전 요소 phenotypic 복구의 책임을 식별 하기 위해 전체 게놈 시퀀싱 데이터의 분석. 3 생물 두 부모의 "P" 긴장의 복제 (P A와 P B), 그리고 phenotypically 복구 5의 두 생물 학적 복제 전환 "S" 긴장 (S-a 1, a S 2와 S-a 3에서에서 발견 한 P-A; S-B1 및 P b에서 S-B2), 시퀀싱 했다 변이 (예: P-A 대 S-A1, 등)에서 파생 된 부모의 긴장 게놈에 비교 하 여 복구 된 스트레인에 각 변이의 목록으로 구성 했다. 이러한 모든 인덱스도 비교의 전체 게놈에서 감지 된 변이의 총 수는 660 이었다. 총 44 돌연변이 같은 "S" 스트레인의 두 생물 학적 복제에서 발생 하는 유일한 돌연변이 선정 됐다 때 확인 되었다. 44 돌연변이에서 12 돌연변이 삽입/삭제 (INDEL) 또는 비-동의어 변이 했다. 12에서 INDEL 또는 비 동의어 돌연변이, 5 단백질 코딩 순서에서에서 발생 했습니다. 5 변이 잠재적으로 연관 단일 유전자 요소 phenotypically 복구 된 긴장에 대 한 책임: SPBPJ4664.02 에 비 동의어 돌연변이 발견 S a 1과 S-a 2에서 rli1 에 INDEL INDEL cue2에 a S 3에 S 1와 S b 2에서 발견 되는 rpl2702 에 비 동의어 돌연변이에서 발견. 변이 필터링 된 배경에 대 한 자세한 시퀀스 정보 보충 표 1-4에 포함 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2.jpg"> 그림 4: 전체 게놈 시퀀싱을 통해 식별 하는 진압의 확인. 전체 게놈 시퀀싱 결과 독립적으로 돌연변이 생성 하 고 수행에 의해 확인 되었다 유전 십자가 elf1∆ P 스트레인, 및 elf1∆ elf1∆ cue2-1 변형 건너 phenotypic 복구를 확인 하 rpl2702-1 elf1∆ P 긴장. 3 대표적인 수직까지 표시 됩니다. 빨간 상자는 이중 돌연변이 식민지 (elf1 cue2-1또는 elf1 rpl2702-1); 파란색 상자는 elf1∆ 식민지. 이 그림에서 Marayati 그 외 여러분, 201831수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
보조 테이블 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
추가 표 3 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
추가 표 4 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_4.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
코딩 파일 추가 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

이 프로토콜은 핵분열 효모에 있는 성장 결함이 있는 돌연변이에 있는 억제기 돌연변이를 확인하기 위하여 간단하고 효과적인 억제기 스크린을 기술합니다. 전통적인 돌연변이 발생 방법은 세포에서 다중 돌연변이를 생성할 수 있는 독성 화학 물질 또는 UV를 사용합니다. 반대로, 이 프로토콜은 돌연변이 유도 방법을 사용하지 않고 개별 세포에서 단일 억제제 돌연변이를 풍부하게 할 수 있다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변형 구조 및 준비로 이 절차를 시작합니다. 96웰의 폴리스티렌 마이크로플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 액체 매체를 추가합니다. 멸균 어플리케이터를 사용하면 준비된 각 식민지를 소량 으로 가져가액체 매체를 포함하는 개별 우물에서 각 식민지를 중단하십시오.동일한 미디어의 200 마이크로 리터를 포함하는 플레이트의 모든 행에 대해 빈 우물을 포함합니다. 이제 자동화된 마이크로플레이트 판독기에 연결된 플레이트 판독기 감지 소프트웨어에 프로토콜을 설정합니다. 온도를 섭씨 30도로 설정하고 2분 동안 판독 빈도로 24시간 동안 운동 프로그램을 설정합니다.이로 인해 우물당 24시간 동안 총 721개의 읽기가 발생합니다. 흔들림을 연속 빠른 궤도 흔들림으로 설정합니다. 광학 판독값을 설정하여 600나노미터의 파장에서 광 산란을 측정하여 광학 밀도를 측정하고 플레이트 아래에서 읽을 빛을 설정합니다.24시간 후 최종 빈 광학 밀도 판독값을 기록하고 텍스트 프로토콜의 수식을 사용하여 각 샘플을 0.1의 광학 밀도로 희석하는 데 필요한 부피를 결정합니다. 각 실험에서 사용할 희석 볼륨을 일괄 처리하려면 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터를 내보내고 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 함수와 동일한 수식을 삽입합니다. 매 24 시간, 수식을 사용하여 0.1의 광학 밀도에 각 샘플을 희석하기 위해 일 0과 동일한 미디어를 사용합니다.모든 우물을 0.1의 광학 밀도로 희석하기 위해 수식을 사용해야 합니다. 이것은 그들의 성장 결함에 있는 몇몇 회복을 보여주기 시작했을 지도 모르다 우물을 포함합니다. 매일 생성된 모든 성장 곡선을 저장합니다.동일한 유전 적 배경을 가진 코호트의 나머지 부분보다 훨씬 높은 최종 광학 밀도 또는 야생 형 식민지와 유사한 성장 곡선에 의해 판단 증가 성장 속도를 보여주는 개별 식민지를 유의하십시오. 이 분석은 일반적으로 약 7~14일 정도 걸립니다. 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다.플레이트 판독기 분석의 마지막 날부터, 일부 액체 배양은 아마도 부모 돌연변이의 표현형을 완화할 수 있는 억제돌연변이를 확보함으로써 눈에 띄게 회복된 성장속도를 갖는다. 페노전성 회수 된 배양을 저장하려면 액체 배양 250 마이크로 리터를 50 % 글리세롤의 250 마이크로 리터가 함유 된 냉동 튜브에 옮기고 혼합하십시오. 플래시액체 질소에 세포를 동결 하 고 무기한 영하 80도에서 균주를 저장 합니다.억제제 돌연변이가 유전적으로 유전적 원소인지 확인하려면 표준 유전 교차 방법을 사용하여 좋아하는 돌연변이 S 세포와 좋아하는 돌연변이 P 세포를 교차하십시오. 무료 짝짓기 타입을 가진 2개의 haploid 세포가 혼합되고 질소 기아를 복종할 때, 그(것)들은 4개의 포자의 tetrad를 형성하기 위하여 포자를 포자화하는 zygote를 생성할 수 있습니다. 부모의 유전 물질은 멘델리안 유전학의 규칙에 따라 메이오시스 도중 분리될 것입니다.포자 후, 동일한 테트라드에서 개별 포자는 해부될 수 있고 접시에 수직으로 관찰된 4개의 개별 식민지를 형성할 수 있다. 마이크로니들을 사용하여 포자를 접시에 하나씩 고르게 놓습니다. 해부 후, 식민지가 나타날 때까지 며칠 동안 섭씨 30도 에서 성장하는 세포를 둡니다.억제제 돌연변이가 유전적 유전적 원소인 경우, 이 십자가는 두 개의 식민지가 부모 긴장의 질병 표현형을 가지고 있으며 두 개의 식민지가 억제제 균주의 회복 성장속도를 갖는 테트라드를 산출해야 한다. 억제제 표현형과 동일한 유전적 교차체의 부모 표현형을 가진 3개의 식민지를 선택하고 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 게놈 DNA 추출 및 시퀀싱 단계를 진행한다. 그런 다음 텍스트에 자세히 설명된 바와 같이 억제제 돌연변이의 식별을 위한 생물정보학 분석을 수행한다.개별 식민지의 성장 곡선은 플레이트 리더를 사용하여 연속 모니터링을 통해 초기 시점과 6일 동안 기록되었습니다. 예상대로 야생 형 식민지는 실험 전반에 걸쳐 성장 곡선에 눈에 띄는 변화를 보이지 않습니다. 특히, elf1 삭제 배경과 1 개의 fal1 삭제 식민지를 가진 네 개의 식민지는 느린 성장에서 야생 유형 식민지와 유사한 성장의 일부 다양한 수준으로 성장의 극적인 변화를 보여줍니다.극적으로, 모든 clr6 돌연변이는 분석의 끝에 의해 더 빠른 속도로 성장하는 일관된 현상 복구를 보여줍니다. 확인된 비대명변화 중 2개는, cue2 돌연변이 및 rpl2702 돌연변이는 현장 지향 돌연변이 발생에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 실험실에서 재구성되었다. Cue2 elf1 이중 돌연변이체 및 rpl2702 elf1 이중 돌연변이체는 무료 elf1 삭제 돌연변이 균주와 교차하였다.유전 횡단은 확인된 억제제 돌연변이가 elf1 삭제 돌연변이의 느린 성장 표현형을 억제하는 데 성공하고 유전성이 있음을 보여주었습니다. 96웰 플레이트의 일일 희석 기간 동안 인공 성장 회복을 피하기 위해 모든 우물을 동일한 농도로 희석하는 것이 중요합니다. 이 방법은 핵분열 효모 및 기타 미생물에서 잘 특성화되지 않은 수백 개의 유전자의 발견을 가속화하는 높은 처리량 방식으로 억제제 돌연변이를 격리할 수 있게 합니다.이 방법은 성장 결함을 일으키는 돌연변이가 있고 액체 배양에서 큰 인구로 성장할 수 있는 모든 미생물에 대한 억제제를 격리하는 데 사용될 수 있다. 분열 효모에 있는 억제제 돌연변이를 확인하는 것은 인간에 효모에서 높게 보존된 통로에 관해서 특히 겹치는 통로에 있는 질병을 일으키는 원인이 되는 유전자를 찾아내는 에 있는 잠재적인 연루가 있을 수 있었습니다.

a-deep-sequencing-assisted-spontaneous-suppressor-screen-fission

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

여기에서는 발아 효모에서 화학적-유전적 상호 작용을 정의하기 위한 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 효모 분자 생물학의 기본 기술을 기반으로 하며 중소 규모의 화학 물질 및 기타 매체 환경에 대한 기계론적 조사에 매우 적합합니다.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

세균성 병원체는 중요한 생물학 프로세스를 표적으로 하는 호스트로 단백질을 은닉합니다. 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로를 확인하는 것은 분자 병인을 해결하는 열쇠입니다. 여기서, 독성 세균 이펙터 단백질에 의해 표적화된 숙주 경로를 해명하기 위해 변형된 효모 억제기 및 독성 스크린을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

다음은 Saccharomyces cerevisiae에서증가 된 복사 번호 억제기 화면을 통해 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단명한 효모 돌연변이체에서 억제제를 식별, 복제 및 테스트할 수 있습니다. 우리는 autophagy null 돌연변이의 수명에 SIR2의 복사 수 증가의 효과를 테스트합니다.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

분열 효모인 Schizosaccharomyces pombe 는 미토콘드리아를 연구하기 위한 매력적인 모델로 부상하고 있습니다. 여기에서는 S. pombe에서 미토콘드리아 호흡 복합체의 풍부함과 조립을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 미토콘드리아 호흡 사슬에서 보존된 유전자의 새로운 기능을 특성화할 수 있습니다.

핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

학습하세요 분열 효모에서 성장 결함을 억제하는 돌연변이를 식별하는 돌연변이 유도 없는 억제자 스크리닝 방법을. 이 고효율 프로토콜은 유전적 상호작용 연구에 활용됩니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

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