Name: 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 쥐의 고급 동맥 경화성 병변에서 면역형광 염색을 이용한 세포 성분 정량 분석 방법을. 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스 모델을 사용하여 복잡한 질병 조직의 세포 역학을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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우리는 그들의 도움에 대 한 피츠버그 대학에서 생물 학적 이미징 (NIH 1S10OD019973-01에 의해 지원)에 대 한 중심을 감사 합니다. 이 작품은 지원 여 D.G. R.A.B.에는 미국 심장 협회에서 15SDG25860021에 의해 지원 되었다 과학 개발 교부 금에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 F30 HL136188.

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저자는 공개 없다.

수십 년간의 연구 및 동맥 경화를 공부 하 고 기술 발전에 불구 하 고 필드 임상 치료34,35과학적인 발견을 번역의 실망 스러운 역사를가지고 있습니다. 이 현상 동물 모델, 실험적인 디자인, 그리고 병 변 분석에 불일치에 의해 부분적으로 설명 될 수 있습니다. 여기는 우리 혈통 추적 마우스7를 사용 하 여 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 구성 분석 하는 데 사용 하는 실험적인 파이프라인에 설명 합니다. 세포 운명 매핑 및 형질, 세심 한 조사를 위해이 방법을 사용 하면 잠재적인 메커니즘에 의해 제어 하는 주요 매개 변수는 고급 동맥 경 화성 병 변에서 재생할 수 있습니다.
SMC-혈통 추적 마우스 모델 동맥 경화 병 인에 운명과이 혈통과 그들의 공헌의 phenotypic 변조를 정확 하 게 추적 하는 강력한 도구입니다. Tamo...

동맥 경화 병 적 상태와 사망률 전세계 기본 관상 동맥 질환, 말 초 동맥 질환 및 뇌졸중의 대부분의 주요 원인입니다. 단계의 관상 동맥 경화는 심근 위반 회계 세계 인구 사망률1,2의 거의 16%를 포함 하 여 심각한 합병증으로 이어질 수 있습니다. 때문에 공중 보건에 미치는 파괴적인 영향, 상당한 노력이 했다 비 발한 치료 전략 개발로 동맥 경화 진행을 운전 메커니즘을 해독. 그러나, 심장 혈관 질환에 대 한 임상 시험의 승인 가능성 (LOA) 속도 (단 대 8.7% 단계) 다른 임상 분야와 비교할 때 낮은 중3입니다. 이 설명 될 수 있는 부분에 많은 방 벽에 의해 그 롬 포즈 효율적인 신약 개발 거의 유비 쿼터 스 자연, 침묵-임상 진행 및 중요 한 질병이 포함. 또한, 전 임상 동물 연구의 차선 디자인 또한 임상 번역에 성공의 부족에 대 한 차지 수 있습니다. 특히, 우리는 개입 연구 가능한 치료 전략의 효능을 조사 하기 위해 구현 해야 하는 것을 믿는다. 또한, 병 변 분석 단계의 동맥 경 화성 병 변 세포 구성의 고급 특성을 포함 하 여 운명 매핑 및 형질에 대 한 표준화 된 절차를 수행 하는 중요 한 필요가 있다.
아 테 롬 연구의 대부분은 동맥 경화 예방 약물 치료 나 유전자 조작 (녹아웃 또는 노크-) 질병 개시 및 진행 하기 전에 건강 한 젊은 쥐에서 구성 된 모델에 초점. 이러한 연구는 유전자 및 아 테 롬 개발에 역할을 하는 신호 분자의 많은 수를 발견 했다. 그러나, 이러한 목표의 대부분 인간의 효율적인 치료를 번역 하지 못했습니다. 사실, 고급 동맥 경 화성 병 변 노인 환자에 게 건강 한 젊은 쥐에는 치료 효과 추정 하는 것이 어렵습니다. 등, 구현 가능성이 전 임상 실험 진행중 개입 연구의 관련성 및 새로운 효능 치료의 더 정확한 묘사를 제공 한다. 아이디어는 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨-1β (IL 1β)을 억제 하는 예방4,,56 또는 개입 전략7을 사용 하는 경우의 현저 하 게 분기 효과 의해 지원 됩니다. 예방 및 개입 연구의 차이점 제안 다른 세포질 과정 동맥 경화 증 개발의 여러 단계에서 발생 하 고 예방 연구 가능성이 있다는 사실을 강조 임상 시나리오를 모델링 하는 데 부족 한 적절 하 게.
미국 심장 협회는 최근 과학 문을 자세히 적절 한 실험 설계, 절차 표준화, 분석, 및 동물 아 테 롬 연구8의 보고에 대 한 권장 사항을 출판. 그것은 혜택 및 필드에 사용 되는 주된 기술의 한계를 강조 표시 합니다. 예를 들어 en 얼굴 수단 IV는 대동맥의 얼룩 종종 첫 번째 읽기로 수행 됩니다. En 얼굴 수단 IV의 지질 증 착 얼룩 글로벌 패 부담에 대 한 평가 적당 한 방법 이지만, 고급 단계의 병 변 초기 단계 지방 조 흔 병 변을 구별할 수 아니다. 이와 같이, en 얼굴 얼룩의 해석 종종 모호 하 고 피상적인9입니다. 조심 분석 조직의 횡단면 형태 론 적 매개 변수 그릇, 병 변, 고 루멘 크기와 병 변 안정성의 지표의 정량화를 사용 하 여 실험의 효과의 더 정확한 이해를 제공 합니다.
마지막으로, 인간의 histopathology 연구 세포 구성 부드러운 근육 세포 (SMC)에 병 변 가난한와 풍부한 세포10, 파열을 더 따르게 되 고, 병 변 크기 보다 파열의 더 나은 예언자는 제안 했다 11. 이러한 관측 마커 고전적인 셀 식별에 사용에 대 한 얼룩에 근거 했다 (즉, SMC 및 LGALS3 또는 세포에 대 한 CD68 ACTA2). 그러나, 이러한 마커 표현의 여러 계보 SMC, 골수성 세포12, 내 피 세포 등의 동맥 경 화성 병 변에서가 소성 때문에 단일 셀 형식에 엄격 하 게 제한 되지 않습니다. 특히, 동맥 경 화성 병 변 내 SMC의 명확한 식별 사실상 불가능 했다 지난 10 년간까지 dedifferentiate 및 그들의 계보 특정 마커 유전자 (프로세스 라고 참다 이러한 셀의 속성 때문에 phenotypic 스위칭) 부상 또는 질병 혈관13에. SMC 식별에서이 제한 혈통 추적7,14,15,,1617,18, 의 개발에 의해 피할 되었습니다. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 영구적으로 Cre recombinase SMC 특정 발기인에 의해 구동의 식의 조합을 사용 하 여 동맥 경화의 진행 하는 동안 그들의 운명 및 phenotypic 발전을 추적 하는 SMC와 그들의 자손을 라벨로 구성 됩니다 (즉, Myh117,15,17,18,19,20,21,,2223 , 24, Acta225,26 , SM22α14,16)와 기자 (형광 단백질, β-galactosidase) [검토 Bentzon와 Majesky의 활성화 201827]입니다. 첫 번째 연구 채용 embryogenesis 설정 외부 SMC 혈통 추적 중 하나에서 Speer 외.14 는 SMC 수 변조 그들의 표현 형 및 transdifferentiate chondrogenic 세포로 혈관 석 회화 하는 동안 사용 하 여 증거를 제공 SM22α Cre R26R LacZ 혈통 추적 모델. 그 질병의 설정에서 어떤 주어진된 비 SMC 표현 SM22α 기자에 의해 표시 된 것이 이러한 연구 개척 SMC 혈통 추적, 비록 그들은 부분적으로 애매 했다. 이 제한 사항은 개발 및 사용의 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cre ERT/LoxP 셀 라벨의 일시적인 제어 허용에 의해 무시 되었습니다. 셀 라벨 tamoxifen 전달 중 독점적으로 발생 하 고 다른 종류의 세포에 Cre 활성화 추적을 피하고 셀 형식 관련 발기인 Cre ERT 식 tamoxifen 노출 시간에 운전을 표현 하는 셀을 제한 될 것 이다는 질병의 진행의 설정입니다. 동맥 경화, tamoxifen을 유도할 수 있는 Myh11-Cre/ERT2 transgene 형광 기자 (eYFP7,15,,1718 연관에 SMC의 혈통 추적에 대 한 , 21, mTmG19,25, 클론 확장 연구 색종이20,,2223 ) 놀라운 효율성과 SMC 라벨에 특이성을 입증 했다 고 최근 연구에서 동맥 경 화성 병 변에서 운명 지도 SMC 인구에 사용 되었습니다. 중요 한 것은, 이러한 연구는 계시 했다: 1) SMC의 80% 이내 고급 동맥 경 화성 병 변 할 표현 하지 어떤 기존의 SMC 마커 (ACTA2, MYH11) immunohistological 분석에 사용 하 고 따라서 것가지고 되었습니다 오인 혈통 추적 없이 17; 다른 종류의 세포 대 식 세포 마커 또는 중간 엽 줄기 세포 마커16,,1719;를 포함 하 여 마커를 표현 하는 2) SMC의 하위 집합 그리고 3) SMC 투자 oligoclonal 확장 동맥 경 화성 병 변 채울 및 SMC 클론 phenotypically 다른 인구20,23전환가 소성 유지. 요약, 그것은 이제 분명 부드러운 근육 세포 동맥 경 화성 병 변에서 놀라운 phenotypic 다양성을 제시 하 고 그들의 phenotypic 전환의 성격에 따라 병 변 병에 유익한 또는 해로운 역할을 가질 수 있습니다. 이러한 발견 단계의 동맥 경화에 athero 홍보 phenotypic 전환 SMC 대상에 대 한 놀라운 새로운 치료 애비뉴를 나타냅니다.
여기, 우리는 분석 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변을 포함 하 여 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 방법에 대 한 표준화 된 프로토콜을 제안 합니다. SMC 운명과 표현 형에 인터 루 킨-1β 억제의 효과 확인 하려면 우리는 SMC 혈통 ApoE-/- 생쥐는 안티-IL1β 항 체의 IgG 제어 isotype 일치 주간 주사를 받기 전에 18 주 동안 서쪽 규정식 먹이 추적을 사용 합니다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 15710</td><td>조직 관류 및 고정</td></tr><tr><td>23G 나비 바늘</td><td>Fisher</td><td>BD367342</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>Fisher</td><td>14-821-13D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>A1 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>ACTA2-FITC 항체 (마우스)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Alexa-647 anti goat</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>항원 Unmasking solution, 구연산 기반</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td>항원 회수 솔루션</td></tr><tr><td>Chow Diet</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.7012</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td>Any 50 x 24 mm cover glass</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Nucleus 형광 대조 염색</td></tr><tr><td>당나귀 Alexa-488 anti-rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Donkey Alexa-555 anti-rat</td><td>Abcam</td><td>ab150154</td> 칼슘 및 마그네슘이 없는 <td>2차 항체</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td> 용액 희석 및 세척을 위한 <td>Gibco 14200166</td><td></td><td>PBS. 탈이온수에 1x로 희석</td></tr><tr><td>임베딩 카세트</td><td>Fisher</td><td>15-182-701D</td><td></td></tr><tr><td>ETDA 진공관</td><td>Fisher</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200 프루프</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>폼 패드</td><td>Fisher</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>냉수 어류 피부의 젤라틴</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>GFP 항체(염소)</td><td>abcam</td><td>ab6673</td><td>1 차 항체</td></tr><tr><td>염소 IgG 제어</td><td>Vector Labs</td><td>I-5000</td><td>IgG 제어</td></tr><tr><td>고지방 다이어트</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>컴퓨터 프로그램 https://imagej.nih.gov/ij/&nbsp;</td></tr><tr><td>LGALS3 항체 (쥐)</td><td>Cedarlane</td><td>CL8942AP</td><td>일차 항체</td></tr><tr><td>LSM700 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, Superfrost Plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>Fisher</td><td>30-538-35</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG 제어</td><td>Vector Labs</td><td>I-2000</td><td>IgG 제어</td></tr><tr><td>NIS 요소 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td></td><td>이미징 소프트웨어 z-stack 이미지 획득</td></tr><tr><td>Normal Horse serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Pap Pen</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>땅콩 오일</td><td>Sigma</td><td>P2144</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold Antifade mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>마운팅 매체&nbsp;</td></tr><tr><td>토끼 IgG 제어</td><td>Vector Labs</td><td>I-1000</td><td>IgG 제어</td></tr><tr><td>Rat IgG 제어</td><td>Vector Labs</td><td>I-4000</td><td>IgG 제어</td></tr><tr><td>RUNX2 항체 (토끼)</td><td>Abcam</td><td>ab192256</td><td>기본 항체</td></tr><tr>주<td>사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 ml 주사기</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>X55K-4</td><td></td></tr><tr><td>Zen 이미징 소프트웨어</td><td>z-stack 이미지 획득을 위한</td> <td>Zeiss</td><td></td> 이미징 소프트웨어</tr></tbody></table>

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

동맥 경화 남아 죽음은 전세계의 주요 원인이 고, 유망한 치료 목표를 설명 수많은 임상 연구에도 불구 하 고 소설 개입 하기 어려운 남아 있다. 이것은 가능성이 인해, 부분적으로, 설립된 질병 보다는 오히려 유전 조작 또는 아 테 롬 개발에 약물 치료의 효과 조사 하는 임상 예방 모델에 대 한 신뢰. 또한, 이러한 연구의 결과 종종 혼동 표면 병 변 분석의 사용 및 병 변 세포 인구 특성의 부족 때문에. 이러한 변환 장애물을 극복 하기 위해, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지 고 confocal 현미경 검사 법에 의해 단일 세포 수준에서 세포 구성에서 변경의 조사를 고용 하는 개입 모델에 증가 신뢰를 제안 합니다. 이 위해, 우리는 murine 개입 모델 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 접근을 포함 하 여 상 상속 치료 에이전트를 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 더하여, 단계의 동맥 경 화성 병 변 내의 세포의 phenotypic 다양성으로 인해 셀 전용, 유도할 수 있는 혈통 추적 마우스 시스템 및 어떻게이 편견된 특성에 대 한 활용할 수 있는 사용의 중요성 설명 동맥 경 화성 병 변 세포의 인구 함께, 이러한 전략 혈관 생물학 더 정확 하 게 치료 개입 모델 동맥 경 화성 질환 분석을 지원할 수 있다 하 고 잘하면 임상 시험에 성공의 높은 속도으로 번역할 것 이다.

Myh11-Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe-/- 생쥐는 높은 지방 다이어트를 먹이 되 고 전에 나이의 6의 그리고 8 주 사이 tamoxifen을 주입 했다. 높은 지방 다이어트를 먹이의 18 주에 8 쥐의 2 개 그룹 마우스 단일 클로 널 안티-일리노이-1β 항 체 또는 isotype 일치 IgG 컨트롤 8 주 (그림 1)710 mg/kg에서 매주 치료 했다. 마우스 희생 되었고 4% PFA PBS 솔루션 끼얹는다. Brachiocephalic 동맥 해 부, 처리 되었고 (그림 2 및 그림 3) 위에서 설명한 대로 구분.
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우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

우리의 프로토콜은 조사관이 면역 형광 얼룩에 의해 유사한 집단의 phenotypic 특성화를 수행하기위한 표준화 된 실험 파이프 라인을 구현하는 데 도움이됩니다. 이 기술을 통해 연구자들은 복잡한 질병 조직의 유사한 구성을 엄격하게 분석하고 관심있는 세포 유형의 표현형에 대한 질적 및 정량적 분석을 수행 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 시드니 마한 (Sidney Mahan)이 될 것입니다.브라치오셉할릭 동맥 수확을 위해 동물을 준비하려면 복막을 흉골까지 자르고 복부 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그리고 흉부를 통해 중간 액실라인에서 두 개의 상처를 내어 심장과 폐를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 다이어프램을 잘라 심장을 부분적으로 노출시합니다.마우스를 교화하기 위해, 유혈액의 압력이 혈관 형태의 일관된 증혈 및 유지를 허용하기 위해 평균 뮤린 혈압과 동일하도록 중력 풍부 시스템을 설치한다. 그런 다음 실온 PBS 5밀리리터, 4%의 실온 파라포름알데히드10밀리리터, 실온 PBS 5개 추가 밀리리터를 가진 동물을 교묘하게 한다. 23 또는 25 게이지 나비 바늘을 중력 주입 시스템에 연결하고 바늘을 통해 PBS를 실행하여 바늘을 튜브에서 배출한 후 바늘을 왼쪽 심실로 삽입합니다.바늘을 제자리에 고정한 후 홍채 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움에서 2센티미터 미만의 절개를 합니다. 관심 있는 조직을 신선한 4% 파라포름알데히드로 수확하십시오. brachiocephalic 동맥을 노출하려면 가위를 사용하여 주루엄을 통해 흉골의 중간선을 절개하고 집게를 사용하여 흉곽의 양쪽을 당겨 가슴 구멍을 완전히 엽니다.다음으로, 동물을 해부 현미경으로 부분적으로 가리게 하고, 미세핀셋을 사용하여 근육, 결합 조직 및 지방을 당기고 오른쪽 경동맥, brachiocephalic 동맥, 서브클라비아 양분 및 대동맥 아치가 주변 결합 조직 및 지방을 청소하고 격리할 때까지 사용합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 양분 아래 의 오른쪽 경동맥을 잡고 집게 위에 초기 절단을합니다. 그럼에도 불구하고 경동맥을 들고 서브클라비아 동맥을 두 번째 로 자르고 브라치오페할릭 동맥 양쪽의 대동맥 아치를 통해 마지막 두 컷을 만듭니다.그런 다음, 관심있는 다른 혈관 조직을 수집하고 실온에서 하룻밤 동안 4 %의 para포름 알데히드 용액에 brachiocephalic 동맥 및 기타 조직을 배치합니다. brachiocephalic 동맥의 면역 형광 염색을 위해, 대동맥 아치가 단면되고 brachiocephalic 동맥이 보이는 빛 현미경 검사법에 의해 확인될 때까지 파라핀 임베디드 조직 견본을 통해 10 마이크로미터 단면을 얻기 위하여 마이크로토메를 이용하십시오. 조직이 마이크로톤 블레이드에 완전히 수직이 될 때까지 블록의 방향을 조정하고 유리 슬라이드 당 brachiocephalic 동맥의 3 개의 연속 10 마이크로 미터 두께 의 섹션을 얻을 때까지, 서브 클라비아양에 도달 할 때까지.모든 섹션이 수집되면 화학 후드 아래에서 2개의 5분 자일렌 몰입으로 조직 샘플을 수화하고, 5분 침수 에탄올 시리즈와 2개의 5분 디온화 수질 침수이 발생합니다. 다음으로, 표준 프로토콜에 따라 항원 검색 용액의 슬라이드를 인큐베이션한 다음 전자레인지에서 20분 동안 가열합니다. 실온에서 1시간 동안 식힌 후 소수성 펜을 사용하여 각 조직 섹션을 둘러싸십시오.그리고 실온에서 1 시간 동안 차단 버퍼로 비특이적 바인딩을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 관심의 1 차적인 항체 칵테일, 또는 isotype 일치 된 IgG 대조 항체와 4 섭씨에서 하룻밤 조직 샘플을 레이블. 다음 날 아침, PBS에서 세척시간 당 5분 동안 세 번 슬라이드를 세척한 다음, 적절한 형광에 1시간 배양을 유도하여 핵 시각화를 위한 이차 항체 칵테일과 DAPI를 결합합니다.그런 다음 형광 현미경 검사법에 적합한 마운팅 배지를 사용하여 슬라이드에 커버립을 장착하십시오. 표지된 조직 섹션의 공초점 현미경 이미징의 경우, IgG 제어 및 1차 항체로 얼룩진 섹션을 사용하여 검출기의 감도, 레이저 전력 및 각 개별 채널에 대한 오프셋을 설정합니다. 그런 다음 z 스택 수집을 위해 상하 위치를 설정하고 이미지할 스택의 두께와 수를 결정합니다.모든 이미지를 획득하면 ImageJ에서 이미지를 열고 채널 도구 패널을 열고 다른 스테닝 채널을 식별할 수 있습니다. 색상 채널을 병합합니다. 모든 채널은 동일한 이미지에서 표시되어야 합니다.채널 도구 패널 내에서 개별 컬러 채널을 켜고 끄고 계산 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 멀티 포인트 도구를 선택합니다. 계산 아이콘을 두 번 클릭하여 점 도구 패널을 열고 셀을 계산하는 데 사용되는 항목의 유형과 크기를 선택합니다. 모든 것을 표시하고 채널 도구 패널에서만 DAPI 채널을 켭니다.그런 다음, 카운터 채널 0을 선택하고 태그할 개별 핵을 클릭하여 z 스택을 스크롤하여 관심 영역 내에 스테인드된 모든 핵을 계산합니다. 정량화된 단일 셀 이벤트의 수는 포인트 도구 패널에 아래에 표시됩니다. 모든 핵이 태그되었을 때, 다른 염색 채널을 켜고 DAPI와 항체 염색 사이에 공동화가 있는 세포를 태그하기 위해 카운터 채널 하나를 선택한다.세포질 염색의 경우 핵의 전체 깊이에 걸쳐 핵을 둘러싼 염색을 가진 세포를 선택하고 필요에 따라 여러 z 스택을 확인하십시오. 결과는 그 때 DAPI 양성 세포의 총 수에 세포의 수로, 또는 관심 영역 내의 영역당 세포의 수로 표현될 수 있다. 표현성 마커를 표적으로 하는 항체를 통한 면역형 염색은, 입증된 바와 같이, 단일 세포 계수에 대한 관심 영역의 묘사를 위해 획득될 수 있는 각 개별 마커 염색 및 차등 간섭 대조의 심상을 허용합니다.단일 세포 계수는 다른 평활근 세포 유래 집단의 풍부를 결정하기 위해 ImageJ를 사용하여 수행 될 수있다. 예를 들어, 이들 대표적인 단면의 섬유질 캡 영역에서의 단일 세포 계수 분석은 항 IL-1 베타 항체로 처리된 마우스 와 마우스 사이의 섬유캡 영역의 세포 구성에 현저한 차이를 나타내며 IG 대조군으로 처리되었다. 실제로, IL-1 베타의 억제는 YFP 양성 평활근 세포의 감소와 연관되었다, 및 galectin-3 양성 세포의 증가.또한, YFP 양성 평활근 대동맥 알파 액틴 양성 평활근 세포의 수가 감소하는 것을 관찰하였다. 평활근 세포 유래 YFP 양성 갈렉틴-3 양성 대식세포의 상대적 수는 두 brachiocephalic 동맥 위치에서 크게 증가했습니다. 특히, IL-1 베타의 억제는 병변 내의 골조온드로겐 세포의 전체 수에 영향을 미치지 못하거나, 또는 연무근육 세포 유래 또는 대식세포 유래 연골 세포의 비율에 영향을 미치지 않았다.이 프로토콜은 조직 수집, 처리 및 단면화뿐만 아니라 단일 세포 계수와 같은 주요 단계를 표준화하여 죽상 경화성 병변 분석에서 엄격성과 재현성을 향상시키도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 대동맥 및 대동맥 뿌리를 포함하는 죽상 경화성 병변을 제시하는 경향이 추가 혈관 침대를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

quantitative-analysis-cellular-composition-advanced-atherosclerotic

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

심혈관 질환의 동물 모델에서 동맥 병변의 생체 외 분석은 고전적으로 조직학 및 면역 조직 화학 기술에 의존합니다. 이는 3차원 병변에서 2차원 측정을 제공합니다. 이 원고는 광학 투영 단층촬영을 사용하여 3차원의 정량적 분석을 위한 동맥 병변의 발생에 대해 설명합니다.

생성 및 마우스의 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여

조직화학적 및 면역조직화학적 분석과 결합된 대동맥동 및 상행 대동맥의 정밀 절단을 사용하여 마우스 모델에서 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하는 절차를 설명합니다.

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혈관 석회화는 인간의 심혈관 질환을 예측하는 중요한 인자이자 기여자입니다. 이 프로토콜은 근적외선 형광 이미징을 사용하여 배양된 1차 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하고 동물 대동맥의 석회화 및 대식세포 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다.

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

이 연구는 마우스에 있는 가속된 죽상 경화증의 유도를 위한 침략적인 절차를 기술합니다. 전기 또는 극저온 유도 된 상해를 사용하는 다른 방법에 비해, 기계적 으로 인한 상해는 재변 치료 후 restenosis의 인간의 상태를 모방하고 관련된 분자 메커니즘의 연구에 이상적입니다.

마우스에서 가속 죽상 경화증의 유도: "와이어 부상" 모델

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

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죽상 동맥 경화증의 뮤린 모형은 분자 수준에 병원성 통로를 조사하기 위하여 유용한 공구입니다, 그러나 병변 발달의 표준화한 정량화가 요구됩니다. 이 프로토콜은 대동맥 근, 대동맥 아치 및 brachiocephalic 동맥을 포함하여 주요 동맥 혈관에 있는 병변 크기를 결정하기 위하여 최적화된 방법을 기술합니다.

마우스에서 동맥 경화증의 정량화

이 프로토콜은 마우스에서 죽상경화성 부담을 분석하기 위한 단계별 절차를 제공한다. 연구자는이 프로토콜을 사용하여 다른 동물에서 죽상 경화성 병변의 풍부도, 위치 및 크기를 비교할 수 있습니다.

동맥류 고지혈증 마우스 모델에서 오일 레드 O-염색된 전체 대동맥 병변의 이미징 및 분석

이 프로토콜은 죽상경화증의 메커니즘과 진행에 대한 보다 심층적인 연구를 용이하게 하기 위해 죽상경화성 플라크의 정량적 분석을 위한 포괄적인 방법론을 제공합니다.

Isolation and Analysis of Aortic Arch and Root Lesions in an Atherosclerotic Mouse Model(죽상경화성 마우스 모델에서 대동맥궁 및 뿌리 병변의 분리 및 분석)

학습하세요 쥐의 고급 동맥 경화성 병변에서 면역형광 염색을 이용한 세포 성분 정량 분석 방법을. 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스 모델을 사용하여 복잡한 질병 조직의 세포 역학을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

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