Name: 전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 전체 조직에서 세포 외 소포체를 고순도로 분리하는 방법을. 뇌와 폐 종양 등 다양한 조직에서 간질 소포체의 형태학적 및 면역표현형 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 박사 리처드 Nowakowski와 플로리다 주립 대학 실험실 동물의 리소스를 제공 하 고 정중 하 게이 프로토콜을 개발 하는 데 사용 하는 동물에 대 한 배려 감사 합니다. 우리는 다운스트림 소포 특성 뿐만 아니라 FSU 생물 과학 이미징 리소스 시설 사용 질량 분석 작업과 쌰 Liu, 박사 Rakesh 싱, 그리고 지원에 대 한 플로리다 주립 대학 변환 과학 연구소 감사 이 연구에서 전송 전자 현미경의 사용. 마지막으로, 우리는이 방법의 개발에 사용 되는 종양 견본의 기부에 대 한 박사 Mandip Sachdeva (플로리다 A & M 대학) 감사 합니다. 이 연구는 플로리다 학과의 건강에 드와 델 무어 Alzheimer의 질병 연구 프로그램에서 D.G.M. 및 J.M.O (6AZ11)와 보너스 번호 아래 국립 보건원의 국립 암 연구소 수 여 교부 금에 의해 지원 되었다 R01CA204621 D.G.M.에 게 수 여

전체 두뇌에서 기관 동물 사용 및 관리 위원회 (IACUC) 플로리다 주립 대학교의 승인을 획득 했다. 12 마우스 두뇌의 총 (각 연령 집단에서 두뇌를 3: 2, 4, 6, 및 8 개월) C57BL/6 J에서 배경 앞에서 설명한16EV 추출에 사용 되었다. 폐 종양 표본은 프로 리 다 농업과 기계적인 대학 IACUC의 승인 아래 박사 Mandip Sachdeva에 의해 아낌없이 기부 했다. 폐 종양은 인간의 선 암 세포 선 immunodeficient Balb/c 뉴/뉴 누드 쥐에서 성장 하는 H1975에서에서 파생 되었다. 2 대표적인 종양 복제에서 데이터는이 연구에는 강조 표시 됩니다.
참고: 기 격리 및 정화 방법의 개요 개요는 그림 1에 제공 됩니다.
1. 조직 분리 및 차등 원심 분리
<ol><li>약 0.4-1.0 당 최대 절전 모드-전자 매체에서의 분리 버퍼 (papain 10 mg, 5.5 m m L-시스테인, 67 µ M 2-mercaptoethanol, 1.1 mM EDTA) 10 mL를 준비 조직의 g. Note EV 농축 및 정화에 사용 되는 모든 솔루션 초순 필터링 된 물에 희석 한다.</li>
	<li>전체 신선 또는 냉동 조직 50 mL 원뿔 튜브에 분리 버퍼에 추가 하 고 품 어 따뜻한 물에 20 분 조직에 대 한 37 ° C에서 목욕 수 있습니다 잘라 부 화 하기 전에 작은 조각으로 필요한 경우.</li>
	<li>부 화, 따라 분리 버퍼를 포함 하는 조직에 최종 1 배 농도 대 한 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제를 추가 합니다.</li>
	<li>느슨한 맞는 Dounce 균질 화기로는 조직 포함 된 솔루션을 부 어 하 고 부드럽게 샘플 당 약 30 느린 스트로크를 사용 하 여 조직의 해리. 획 수 조직 일관성에 따라 조정할 수 있다.</li>
	<li>50 mL 원뿔 튜브 및 작은 세포와 나머지 섬유 또는 응집 조직 파편을 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기를 버퍼에 해리 전송 조직.</li>
	<li>깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 및 작은 큰 세포질 파편 삭제 하 4 ° C에서 10 분 2000 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 전송 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 및 원치 않는 큰 소포 또는 작은 apoptotic 몸 펠 렛을 4 ° C에서 40 분 10000 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 다시 전송 합니다. 참고: 원하는 경우 더 큰 소포의 추가 연구에 대 한이 펠 릿을 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>0.45 μ m 필터를 통해 깨끗 한 12 mL ultracentrifugation 관으로는 상쾌한을 가만히 따르다. 참고: 밀도가 거리 조직 샘플 쉽게 필터링 되지 않을 수 있습니다. 이러한 샘플 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 다음 0.45 μ m 필터를 통해 필터링 하기 전에 순차적으로 작은 바늘 (18g, 20g, 22 G) 통해 전달 될 수 있습니다.</li>
	<li>Ultracentrifuge 작은 EVs를 펠 렛을 4 ° C에서 2 시간에 대 한 100000 x g 에서 샘플.</li>
	<li>가만히 따르다는 상쾌한 고 5-10 분, 관의 측에 잔여 액체를 제거 하려면 자주 도청 거꾸로 ultracentrifugation 튜브를 둡니다. 또한 aspirating 진공 피 펫을 사용 하 여 잔여 액체를 발음 수 있습니다.</li>
	<li>다시 0.25 M 자당 버퍼 (10 mM Tris, pH 7.4)의 1.5 ml EV 펠 릿을 일시 중단 합니다. 그것은이 단계에서 펠 릿의 전체 다시 정지를 보장 해야 합니다. 이렇게 하려면 솔루션에 EVs vortexing 전에 parafilm 튜브 커버. 바위 ultracentrifuge 관 최종 소용돌이 혼합 하기 전에 실 온에서 15-20 분.</li>
	<li>짧게 원심 관 튜브의 바닥에 액체 정지 복구 속도 이상의 1000 x g 에.</li>
	<li>다음, 그라데이션 정화 단계를 수행 하십시오 또는 필요한 경우, 저장 EV 정지 4 ° C에서 하룻밤.</li>
</ol>2. 밀도 그라데이션 정화
<ol><li>30 %iodixanol 포함 하는 최종 솔루션을 만드는 EVs를 들어 1.5 mL 자당/Tris 버퍼에 60 %iodixanol (재고 솔루션 물에서)의 1.5 mL를 추가 합니다. 최대 플라스틱 그리고 여러 번 솔루션을 철저 하 게 혼합. 높은 iodixanol 농도 아주 점성으로 피 펫 팁, 솔루션 손실 되지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>EVs는 5.5 mL ultracentrifugation 튜브의 하단에 포함 된 30 %iodixanol 버퍼 솔루션을 전송 합니다.</li>
	<li>적어도 1.5 mL 초순 물 60 %iodixanol 재고 솔루션에서 샘플 당 20%와 10 %iodixanol 솔루션의 준비.</li>
	<li>1.3 mL 20 %iodixanol 및 신중 하 게 18 G 바늘 주사기를 사용 하 여 그라디언트 레이어 위에 레이어를 측정 합니다. 혼합 밀도 인터페이스 레이어를 방지 하려면 바로 위에 초승달 모양 ultracentrifugation 튜브의 내부와 접촉 하 여 바늘의 경사를 유지 하 고 dropwise 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>위와 같은 기법을 사용 하 여 20 %iodixanol 레이어 위에 10 %iodixanol 솔루션의 1.2 mL 레이어.</li>
	<li>신중 하 게 균형 및로 터 양동이 4 ° c.에 50 분 268,000 x g 에서 스윙 양동이 터 원심 분리기 ultracentrifugation 튜브 로드 최저 밀도 층의 혼란을 피하기 위해 허용 하는 원심 분리기의 가속 및 감속 속도 설정 합니다.</li>
	<li>밀도 기울기의 분수 1-10에 해당 하는 각 샘플에 대 한 10 1.5 mL microcentrifuge 튜브 라벨. 분수 1 먼저 제거 될, 분수 10 마지막 제거 바닥 분수는 최상위 부분으로 지정 됩니다.</li>
	<li>그라데이션 ultracentrifugation 완료 되 면로 터 양동이에서 튜브를 제거 하 고 안정적인 홀더에 부드럽게. 소포의 보이는 밴드는 종종 관심의 일부에서 볼 수 있습니다. 해당 튜브에 그라디언트 위쪽에서 490 µ L의 10 직렬 분수를 플라스틱. 적은 양의 단백질 오염 가능성이 있는 튜브의 하단에 남아 있는 유체 있을 것입니다. 이 샘플, 또는 원하는 경우 분수 11로 유지 될 수 있습니다.</li>
	<li>굴절 계를 사용 하 여 분수의 굴절율을 측정 합니다. 이 또한 샘플 보전이 필요한 경우 동시에 실행 제어 그라데이션으로 수행할 수 있습니다. 굴절 계 표면에 iodixanol를 포함 하는 각 분수의 20-30 µ L 플라스틱 고 굴절율 알려진된 iodixanol 밀도를 비교 하 여 밀도 추정. Note는 분수에에서 저장할 수 있습니다 하룻밤 iodixanol 포함 된 솔루션 다음 ultracentrifugation 세척 단계를 진행 하기 전에 필요한 경우.</li>
	<li>깨끗 한 12 mL ultracentrifugation 관에 각 분수를 전송 합니다. 위아래로 천천히 pipetting으로 튜브를 혼합 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 137 m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 2mm KH2포4, pH 7.4 m) x 1의 5 mL를 추가 합니다. 참고: PBS는 샘플에 추가 입자 무료 살 균 PBS 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 소금 강 수를 피하기 위해 실내 온도에 저장 하 여 보장 되어야 합니다.</li>
	<li>상단에 1 x PBS의 추가 6 mL을 추가 하 고 다시 신중 하 게 혼합.</li>
	<li>Ultracentrifuge 다시 작은 소포를 펠 렛을 4 ° C에서 2 시간에 대 한 100000 x g 에 튜브. 상쾌한 가만히 따르다 하 고 세포의 단백질 분석 (3 단계)에 대 한 소포 또는 형태 론 적 분석 (5 단계)에 대 한 EVs의 다시 정지 하기 전에 건조 튜브를 누릅니다.</li>
</ol>3. 세포와 EV 단백질의 Immunoblot 확인
참고: Morphologic 특성 또는 생물 학적 활동에 대 한 전체 소포의 보존을 원하는 경우 연구자 5 단계로 바로 진행할 수 있습니다. 초기 실험, 또는 질량 분석 분석 하기 전에 복구 하는 모든 분수 immunoblot EV 단백질 분수를 확인 하 여 분석 합니다.
<ol><li>단백질 분석에 대 한 EVs를 lyse, ultracentrifuge 튜브 펠 릿 EV protease 억제제의 추가 함께 강한 세포의 용 해 버퍼 (5 %SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris HCl pH 6.8, 2.5 %2-mercaptoethanol, 8 M 요소)의 40 µ L을 추가 합니다. 참고: 경우 비 감소 상태는 단백질의 항 체 검출, 초순 2-mercaptoethanol 강한 세포의 용 해 버퍼에 대 한 대체 합니다.</li>
	<li>완전 한 다시-펠 릿의 펜션과 버퍼에 EVs의 세포는 ultracentrifugation 이상의 parafilm를 배치 하 여 보장 튜브, vortexing 적극적으로, 다음 마지막 소용돌이 전에 실 온에서 20 분 동안 락.</li>
	<li>짧게 30-60 s 전체 샘플 볼륨을 복구를 위한 1000 x g 에서 원심. 추가 처리까지 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를-20 ° C ~-80 ° C에 게 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>순화 lysates immunoblot 분석에 대 한 준비, 1 x의 최종 농도 대 한 샘플을 5 x Laemmli 샘플 버퍼 (10 %SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol 블루, 0.5 M DTT, 50% 글리세롤, 5 %2-mercaptoethanol)을 추가 합니다. 참고: 비 감소 조건 바란다면 바꿉니다 DTT와 2-mercaptoethanol 초순.</li>
	<li>경우 전체 조직 homogenate 컨트롤은 원하는 lyse는 우 레 아-들어에 강한 조직 세포의 용 해 버퍼 protease 억제제와 위에 상세한, 다음 10 분 남은 기질, 전체 셀 삭제에 대 한 10000 x g 에서 원심 또는 그대로 세포질 파편입니다. 1 x의 최종 농도 대 한 조직 homogenate를 5 x Laemmli 견본 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>EV 또는 조직 homogenate 샘플 5-10 분 동안 95 ° C에 포함 된 샘플 버퍼를 끓인 다음 동일한 볼륨 로드 (0.1-0.3의 상응에서 시작 조직 물자의 g; 순화 EV 단백질의 1-2 µ g) 10 %SDS-PAGE 젤으로 분수 1-10의. 조직 homogenate의 동등한 질량을 로드 합니다. 샘플의 큰 볼륨 덜 민감한 항 체에 의해 감지에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 및 서쪽 오 점 분석 이전 상세한21 순화 lysates의 EV 단백질을 확인 하 고 분수에 상대 EV 풍부 비교로 진행 합니다. 참고: EV 단백질은 일관 된 분수에 reproducibly 입증 되었습니다, 일단 최종 ultracentrifugation 세척 단계 2.12에 설명 된 관심의 그라데이션 분수 제한 수 있습니다.</li>
</ol>4. EV 단백질 정량화
<ol><li>EV 단백질의 중요 한 부 량 추가 분석을 위해 원하는 경우 세제 및 요소 호환 형광 기반 분석 결과 사용 하 여 ( 재료의 표참조). Note 일부 형광 기반 분석 Laemmli 샘플 버퍼, 선호 하는 경우이 버퍼에서 (에서 단계 2.12) EV 펠 릿의 직접 세포의 용 해를 촉진에 bromophenol 블루와 호환 됩니다.</li>
	<li>상기 형광 기반 단백질 정량화 키트를 사용 하는 경우 샘플 또는에 표준의 자리 1 µ L 적어도 제공된 필터 종이에 복제 그리고 단백질 정량화 제조업체의 지침에 따라 계속.</li>
</ol>5입니다. EV 형태의 특성
<ol><li>최종 원심 분리 단계 2.12에서 세척 후 전체 소포를 검사, 철저 하 게 다시 일시 중단 EV 펠 릿 1 입자 무료 x PBS에. 4 ° C에서 처리까지 1 주 보다는 더 이상 저장소 EVs freeze-thaw 주기를 피하기 위해 참고: 지속적으로 관심의 분수 형태소 분석을 제한 하려면 immunoblot 분석에 의해 농축된 EV 단백질을 포함 하는 분수 확인 이전에 유리 하다.</li>
	<li>나노 입자 농도 이전 상세한22로 준비, 소포의 크기를 결정 하기 위해 전체 EV 샘플 분석 추적을 수행 합니다.</li>
	<li>EV 형태 특성화 고 크기 측정의 소포, 전자 현미경 필요한 경우 합니다. EM 격자 소포 정지 단계 5.123, 다음에서 준비 될 수 있다 또는 또는 블록 준비24 단계 2.12 따라 펠 릿에서 처리할 수 있습니다.</li>
</ol>6.에서-정화와 트립 신 소화를 위한 젤 질량 분석 분석
<ol><li>질량 분석에 의해 EV proteomes의 특성을 원하는 경우 분리 하 여 단백질 정화 프리 카스트 polyacrylamide 젤에 EVs를 포함 하는 분수의 동등한 질량 (단백질의 적어도 10 µ g)을 로드 합니다. 프리 카스트 젤 제조 업체 제공 샘플으로 소개 되 고 단백질 (예를 들어, 각 질) 오염 가능성의 수준을 줄이기 위해 선호 됩니다.</li>
	<li>단백질 정화의 polyacrylamide 젤으로 0.5 인치 이상 샘플을 실행 다음 수정 하 고 세부 사항25에 앞에서 설명한 Coomassie 염료와 얼룩.</li>
	<li>잘라 레인 1 m m3 큐브 이전 상세한19,26으로 트립 신 소화에 대 한.</li>
	<li>세부16에 지정 된 매개 변수에 따라 질량 분석에 의해 분리 분석 및 이후 분석에 대 한 LC-MS/MS 계기를 소화 펩 티 드 샘플의 5 µ L를 로드 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

많은 과학적인 관심사 작은 EVs 종양 microenvironment 뿐만 아니라 장기 개발, 성숙, 및 기능을 재생 하는 역할에 관하여 생성 되었다. 전반적으로,이 연구 전체 뇌 또는 종양 표본에서 그대로 EVs의 추출에 대 한 최적화 된 워크플로 제공합니다. 여기 단순히 폐 종양에서 파생 된 EVs에이 기술의 적용 시연,이 방법은 쉽게 수 추가의 작은 분 비 소포 ex vivo 특성에 대 한 기회를 제공, 다른 단단한 조직에 대 한 작업에 대 한 적응 광범위 한 생물 의학 관심입니다. 이 연구의 범위를 넘어 발생 하는 조직 식의 EV 콘텐츠의 미래 비교가 됩니다 생체 조직과 질병으로 고립 된 소포의 유틸리티를 설정 하는 것이 중요.
이전 우리 연구소에 의해 발표 된 연구에서 명확 하 게 침전 그라디언트 풍부한 작은 소포의 정화에 대 한 부양 기반 밀도 기울기의 이점을 설명 합니다. 본질적으로, 부 력 기반 분리의 분수를 통해 오염 마이그레이션 방지 하 여 소포의 정화를 향상 ...

작은 세포 외 소포 (EVs) endosomal에서 파생 된 exosomes 등의 광범위 한 생물은 작은 막 창 고 microvesicles. 작은 EVs는 이기종 인구의 50-250 nm 막 도약 소포 포함 하는 생물학적으로 활성 단백질, 지질, 그리고 공동으로 다양 한 질병 과정에에서 중요 한 역할을 믿고 핵 산의 구성 됩니다. 특히 신경 프리온 질환, 전염 성 프로세스, 면역 이나 염증, 및 종양 성장 및 전이1,2,3 에이 소포를 연루는 연구 발전 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 빠르게 성장 하는 생물 의학 연구 질병 병 인에서 EVs의 중요성으로 재현 하 고 엄격한 격리와 이러한 vesicles의 정화에 대 한 방법을 개발에 병렬 관심을 생성 했다.
EV 특성에서 역사적이 고 현재 도전 못하는 작은 EV 모집단을 완전히 분리 되었습니다. 이 문제는 주로 통치 별개 소포 속 다른 분자 메커니즘의 우리의 제한 된 이해 예정 이다. 크기, 밀도, 그리고 생물 학적 화물 더 부분 모집단 사이 오버랩이 구분 convolutes. 이 과제의 일부 또한 널리 다른 농축 기술, 실험실, 걸쳐 격리 vesicles의 다운스트림 분석에 불일치를 제공 하 고 범주별 EV 인구를 밝히는 글로벌 노력을 훼손 사용 되었습니다.
그것은 대부분 EV 특성화의 플라스마, 소변을 포함 한 동물이 나 인간의 체액에서 소포를 분리 하는 기법을 설명 하는 더 최근의 vivo에서 연구 표면에 뜨는, 세포 배양의 생체 외에서 컬렉션에서 수행 되었습니다 협조할 그리고 타 액. EVs는 순환에 대량에서 존재, 그것은 또한 이러한 vesicles 셀 통신 이벤트에서 중요 한 역할을 하 고 세포 조직의 interstitium에 인식. 암의 맥락에서 중간 EVs는 특히 암 세포 시드 및 전이성 성장14,15종양 microenvironment 변조에 중요 한 있을 수 있습니다. 따라서, 개발 및 단단한 조직 표본에서 소포를 추출 하는 기술의 최적화 값이입니다. 이러한 방법은 직접 연구 기관-수단을 제공할 것입니다 또는 종양에서 파생 된 EVs 작은 biopsies을 부분 또는 전체 기관 절제술을 포함 하 여 임상 표본에서 수확.
이 연구와 우리의 실험실16출판 이전 보고서 우리는 EV 농축 방법론에서 여러 주요 현재 문제를 해결 하고자: 1) 격리 하 고 현재 수준에 EVs를 정화 재현 기술을 설명 하 필드 확인 허용 작은 EV 모집단 endosomal에서 파생 된 exosomes;에 고도로 농축을 시도 2) 그리고 3) 더 특성을 위해 단단한 조직 표본에서 이러한 vesicles의 추출에 대 한 프로토콜을 제공 하.
최근, Kowal 및 동료 상대적으로 소규모 iodixanol 밀도 그라디언트 분리 및 정화 EV 모집단 비교 자당 밀도 기울기17보다 큰 효능을 설명 합니다. 매우 인용된 연구 수지상 세포 유래 EVs에 상대적으로 가벼운 밀도 분수, 1.1 g/mL의 조밀도와 일치 했다 endosomal 단백질이에 exosomes의 높은 비율로 가장 일관 된 것으로 농축 분수입니다. 저자에 따르면이 "진실한" exosomal 단백질 종양 민감성 유전자 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4, 그리고 여러 annexin 단백질17포함. 우리는 나중에 성공 조직 분리 페레즈 곤잘레스 외18 및 전체 두뇌 파생 EVs16을 후속 차등 원심 분리 프로토콜에서 설명 하는 방법에이 기술을 적응. 우리는 또한 우리의 실험실19설명한 기공을 단백질의 다운스트림 양적 및 비교 질량 분석에 대 한 순차적 프로토콜을 결합 하 여 EV proteomes 특성화에이 방법의 유틸리티를 설명 했다. 이 작품은 EVs 두뇌20담당에서 농축 된 힐 연구소에서 그을 평행 시켰다.
이 연구에서 우리이 기술에 대해 자세히 설명 하 고 최근 우리의 실험실에서 고체 폐 종양에서 EVs의 격리에 게시 하는 프로토콜의 응용 프로그램을 확장. 우리의 지식을 하려면이 ex vivo 종양 표본에서 EVs를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 설명 하기 위해 첫 번째 연구 이다. 새로운 진단 바이오 마커 및 tumorigenesis에서 그들의 역할 EVs에 광범위 한 관심을 감안할 때,이 방법은 가능성이 증명 과학 연구원의 성장 수에 중요 한. 임상의 관점에서 중간 EVs 더 평가 제한 됩니다 표본에서 특히 훌륭한 진단 가치를 항구 수 있습니다. 우리의 희망은 여기에 설명 된 방법 신선 또는 냉동 동물 또는 인간 수술 표본, 밝히기 위해서 질병 병 인에 중요 한 역할이 작은 미래의 일에 대 한 방법을 포장에서 EVs를 수확 하는 재현 기법에 대 한 기초를 제공할 것입니다. 소포를 재생할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 & 마이크로; m 필터</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>12 mL 초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>5.5 mL 초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>anti-Alix 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7129</td><td></td></tr><tr><td>anti-Calnexin 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD63 항체</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr>, <tr><td>CD81 항체</td>, <td>Santa Cruz</td>, <td>sc-9158</td><td></td></tr>, <tr><td>Flotillin 2, 항체</td><td>, Santa Cruz</td>, <td>sc-25507</td><td></td></tr>, <tr><td>HSC70 항체</td>, <td>Santa Cruz</td>, <td>sc-7298</td><td></td></tr>, <tr><td>Syntenin-1 항체</td>, <td>Santa Cruz</td>, <td>sc-100336</td><td></td></tr>, <tr><td>TSG101 항체</td>, <td>Santa Cruz</td>, <td>sc-7964</td><td></td></tr>, <tr><td>EZQ 단백질 수량화 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-6-30 로터&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5820715006</td><td></td></tr><tr><td>FEI CM120 전자 현미경</td><td>TSS 현미경</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td><td>Genetex</td><td>27171</td><td></td></tr><tr><td>HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HALT protease inhibitor (100x solution)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-XP 벤치탑 초원심분리기&nbsp;</td><td>벡크만쿨터</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>옵티마 XE-100 초원심분리기</td><td>벡크만쿨터</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>옵티프렙</td><td>시그마</td><td>D1556</td><td>60% 요오딕산올 멸균수 용액</td></tr><tr><td>Q Exactive HF 질량분석기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 염소 IgG</td><td>Genetex</td><td>26741</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 마우스 IgG</td><td>Genetex</td><td>26728</td><td></td></tr><tr><td>Refracto 30PX (굴절계)</td><td>Mettler Toledo</td><td>51324650</td><td></td></tr><tr><td>S-4-104 로터</td><td>Eppendorf</td><td>5820759003</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop 5804R centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 조직에서 세포 외 vesicles의 추출

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

순환 및 중간 작은 막 도약 extracellular 소포 (EVs) 새로운 진단 이나 예 후 바이오 마커 분석, 개발을 위한 유망한 목표를 대표 하 고 가능성이 역할의 광범위 한 스펙트럼의 진행에 중요 한 선수 질병입니다. 현재 연구는 여러 세포에서 분 비 소포 특성에 집중 하 고 하기 위해서는 더 나은 조직 종류 조건 neurodegeneration, 염증, 암 등의 병 인에서 EVs의 역할을 이해. 그러나, 세계적으로 일관 되 고 재현 가능한 기술을 분리 하 고 소포를 정화 진행에 남아 있습니다. 또한, ex vivo 단단한 조직에서 EVs의 추출 방법 부족 하 게 설명 합니다. 여기, 우리는 추가 특성에 대 한 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 신선 또는 냉동 조직에서 관심의 작은 EVs를 추출 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 여러 다운스트림 분석, 전자 현미경 검사 법 및 소포의 immunophenotypic 특성 EV 단백질의 양이 많은 질량 분석을 포함 하 여이 방법의 적응성을 설명 합니다.

조직 분리, 차등 원심 분리 및 소포의 그라데이션 정화의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그라데이션 정화 EVs의 형태 론 적과 immunophenotypic 확인은 그림 2에 강조 표시 됩니다. 재현할 수 밀도의 10-30 %iodixanol 그라데이션 ultracentrifugation 다음 다이어그램 표시 됩니다, 분수 2 (빛 EVs) 및 분수 5 (밀도 EVs), 위쪽으로 마이그레이션 두 가지 기 인구와 조직의 종류에 따라. 그라데이션 분수의 대표 immunoblots 전시 효율적인 분리와 분수 5 작은 종양에서 파생 된 EVs의 정화. 메모의 풍부한 빛 EVs (분수 2) 이전 뇌 조직에서 수확에 비해 밀도 EVs에 등장 하는 폐 종양 표본은 다시 여기 강조. EVs의 글로벌 조직 분석으로 등장, 독특한 조직에 의해 생산 EVs의 뚜렷한 밀도 결정 ...

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

이 프로토콜은 다운스트림 전 생체 분석용 전체 조직 표본에서 작은 세포 외 소포를 추출하고 격리하기 위한 엄격하고 재현 가능한 기술을 제공합니다. 현재 달성 가능한 가장 높은 수준의 순도 를 통해,이 방법은 종양을 포함한 다양한 조직 표본으로 분비된 간질 소포의 직접적인 형태, 면역 페노티픽 및 깊은 특성화를 용이하게합니다. 여기에서, 우리는 두뇌와 폐 종양 견본에서 조직 전기의 격리를 보여줍니다.그러나, 이 기술은 다양한, 양성, 또는 그밖 종양 견본을 이용한 연구 결과에또한 적용될 수 있습니다. 시작하려면, 조직의 모든 0.4 ~ 1.0 그램에 대한 최대 절전 모드 -E 배지에서 해리 버퍼의 10 밀리리터를 준비합니다. 50 밀리리터 튜브의 완충제에 전체 신선하거나 냉동 된 조직을 추가하고 20 분 동안 섭씨 37도에서 따뜻한 수조에 배양하십시오.그 후, 해리 버퍼에서 최종 1배 농도에 대한 프로테아제 및 인산 억제제를 추가한다. 티슈로 용액을 느슨한 핏 다운균제로 붓습니다. 시료당 약 30개의 느린 스트로크를 사용하여 조직을 부드럽게 해리시합니다.그런 다음 해리된 조직 및 완충액을 50밀리리터 원판 튜브로 이송합니다. 500x g의 원심분리기와 5분간 섭씨 4도에서 세포와 나머지 섬유 또는 응집력 있는 조직 단편을 펠릿합니다. 상체를 깨끗한 50 밀리리터 원전 튜브로 옮기고 원심분리기를 2, 000x g, 섭씨 4도에서 10분 동안 펠릿과 큰 셀룰러 파편을 폐기합니다.이 상체를 깨끗한 50 밀리리터 원전 튜브로 옮기고 원심분리기를 10, 000x g, 섭씨 40도에서 40분간 전달하여 원치 않는 큰 소포 나 작은 세포 사멸 체를 펠렛합니다. 0.45 마이크로미터 필터를 통해 깨끗한 12 밀리리터 초원심 분리 튜브에 초신수를 증정한다. 다음으로, 초원심분리기 샘플을 100, 000x g및 섭씨 4도에서 2시간 동안, 작은 전기 를 펠릿합니다.상체를 데수제하고 5~10분 동안 반전된 초원심분리관을 두드리고, 튜브 측면에 잔류액체를 제거합니다. 이어서, EV 펠릿을 0.25 의 1.5 밀리리터에서 0.25 어금니 자당 버퍼로 재연한다. 파라필름으로 튜브를 덮은 다음 EV를 용액으로 소용돌이시다.실온에서 10~15분 동안 초원심분리기 튜브를 흔들어 보냅니다. 그리고 다시 한 번 소용돌이. 튜브 의 바닥에 액체 현탁액을 복구하기 위해 1, 000x g 미만의 속도로 튜브를 간략하게 원심 분리합니다.필요한 경우, 하룻밤 4섭씨에 서스펜션을 보관하십시오. 먼저, 전기자동차를 함유한 자당 트리스 버퍼의 1.5 밀리리터에 60%의 iodixanol의 1.5 밀리리터를 추가하여 30%iodixanol을 포함하는 최종 솔루션을 만듭니다. 용액을 완전히 혼합하기 위해 여러 번 파이펫을 위아래로 합니다.이 솔루션을 5.5 밀리리터 초원심분리 튜브의 바닥으로 옮긴다. 다음으로 60%의 iodixanol 스톡을 초순수 수분과 혼합하여 20%와 10%의 iodixanol 용액의 최소 1.5밀리리터를 준비합니다. 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하여 20%의 iodixanol 용액의 1.3 밀리리터를 측정하고 바닥 그라데이션 위에 조심스럽게 레이어링합니다.바늘의 벨이 관 내부와 접촉하여 반월상 연골 바로 위에 있고 밀도 인터페이스에서 층을 혼합하지 않도록 현명하게 해결책을 추가하십시오. 이어서, 동일한 기술을 사용하여 20%층 위에 10%의 iodixanol 용액의 1.2 밀리리터를 층. 극심분리튜브를 로터 버킷에 신중하게 균형있게 조정합니다.스윙 버킷 로터의 가속 및 감속 속도를 최소 속도로 설정하고 원심분리기는 268, 000x g, 섭씨 4도에서 50분 동안 설정합니다. 시료가 원심분리되는 동안, 밀도 그라데이션의 1-10분획에 해당하는 각 샘플에 대해 10 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 라벨을 부착하십시오. 원심분리가 완료되면 로터 버킷에서 튜브를 부드럽게 제거하고 안정된 홀더에 넣습니다.파이펫 10 해당 튜브로 그라데이션의 상단에서 490 마이크로 리터의 직렬 분수. 굴절계를 사용하여 분수의 굴절률을 측정합니다. 그런 다음 각 분획을 깨끗한 12 밀리리터 초원심분리 튜브로 옮긴다.각 튜브에 1x PBS의 5밀리리터를 넣고 천천히 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 튜브 상단에 1x PBS의 6 밀리리터를 추가하고 조심스럽게 다시 섞습니다. 초원심분리기튜브는 100, 000x g, 섭씨 4도에서 작은 소포를 다시 펠릿합니다.상체를 데칭하고 단백질 분석을 위해 소포를 용해하거나 변성 분석을 위해 전기를 다시 중단하기 전에 튜브를 건조하게 누릅니다. 단백질 분석을 위해 EV를 lyse하려면 EV 펠릿에 프로테아제 억제제가 함유된 강력한 용해 완충제 40마이크로리터를 추가합니다. 각 튜브 위에 파라필름을 놓고 소용돌이를 적극적으로 배치합니다.다음으로, 실내 온도와 소용돌이에서 20 분 동안 튜브를 다시 흔들어. 샘플을 1, 000x g에서 30~60초 동안 간략하게 원심분리하여 전체 샘플 부피를 회수합니다. 각 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 추가 처리를 위해 준비될 때까지 섭씨 20~80도 사이의 온도에 보관하십시오.면역블롯 분석을 위해 정제된 용액을 준비하려면 5x Laemmli 샘플 버퍼를 샘플에 추가하여 최종 농도를 1배 나늘게 합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 5~10분간 끓입니다. 그런 다음 10% SDS 페이지 젤에 1-10의 동일한 분획을 로드합니다.동일한 양의 조직 동종을 로드합니다. 전기 전도 및 서양 얼룩 분석을 수행하여 정제 된 용해에서 EV 단백질을 확인하고 상대 적인 EV 풍부를 분수로 비교합니다. 이 연구에서는 세포 외 소포를 추출하고 전체 조직에서 정제됩니다.10~30%의 극심분리에 이어, 광전기자동차의 인구가 2분까지 이동하는 것을 볼 수 있으며, 조밀한 전기자동차의 집단은 조직 유형에 따라 최대 5개로 이동하는 것을 볼 수 있다. 그라데이션 분획의 대표적인 면역블롯은 작은 종양 유래 EV의 효율적인 분리 및 정제를 5분5로 나타낸다. 특히, 폐 종양 표본은 이전에 전체 뇌 조직에서 수확 한 빛 전기에 비해 조밀 한 전기 에 풍부 나타납니다.분획을 함유하는 우세한 소포에서 조직 유래 소포의 대표적인 나노 입자 추적 분석 및 전자 현미경 검사는 전체 소포의 농축 및 보존을 입증한다. 작은 EV의 알려진 크기와 구조와 일치합니다. 간질 전기 는 새로운 진단 또는 예후 바이오 마커 분석의 개발을위한 유망한 목표를 나타냅니다.이 기술은 연구원에게 다운스트림 유틸리티용 소포의 추출 및 정제를 위한 도구를 제공합니다. 전체 또는 lysed 조직 전기 의 추출 에 따라, 프로 테오믹을 포함 하 여 소포의 광범위 한 특성화, 유 전체, 그리고 lipidomic 분석 수행 될 수 있습니다. 또한 샘플은 더 많은 표적 접근 에 사용될 수 있습니다.조직 견본에서 직접 분리된 소포는 종양 창세기를 포함하여 질병 기계장치에 추가 통찰력을 제공할 수 있고, 미래에 중요한 진단 또는 예후 공구를 제공할 수 있습니다.

extraction-of-extracellular-vesicles-from-whole-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 신선 조직 또는 냉동 조직에서 세포 외 소포를 추출하는 기술에 대해 설명합니다. 분리된 세포외 소포체는 질병 발병기전에서 중요한 역할을 밝히기 위한 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Extracellular Vesicle Extraction: 차등 원심분리를 사용하여 전체 조직 표본에서 세포외 소포를 분리하는 기술

이 동영상은 특성화 연구에 적합한 세포외 소포체의 하위 집단을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리 기반 정제 방법을 보여줍니다.

Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

이것은 간에서 조직 세포 외 소포 (EV)를 격리하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 콜라게나아제 관류와 관련된 2단계 과정을 설명하고 간 조직 EV를 분리하기 위한 차동 초원심분리를 설명합니다.

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.

간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

여기에서는 콜라겐분해효소 I형과 초원심분리를 통한 소화를 조합하여 생쥐 비장 유래 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

배우세요 전체 조직에서 세포 외 소포체를 고순도로 분리하는 방법을. 뇌와 폐 종양 등 다양한 조직에서 간질 소포체의 형태학적 및 면역표현형 분석을 가능하게 합니다.

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

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