Name: Intravital 시간 경과 영상에 대 한 애기 를 장착 하는 다양 한 방법을 나뭇잎합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana 잎의 형광 생체 시간 경과 영상법을 통해 식물 면역 반응 중 유전자 활성의 시공간적 역학을 관찰하는 방법을. 이 기술은 토양에서 자란 완전한 식물 잎에서 프로모터 활성을 수일간 포착하여 면역 반응의 시간적 조절 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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이 작품은 일본 과학 기술 기관에 의해 지원 되었다 [S.B., N.N.에 ERATOJPMJER1502에 PRESTO117665] (연구비 연구 활동 시작 [S.B.에 22880008] 및 젊은 과학자 (B) [대 한 과학의 승진에 대 한 일본 사회에 의해 23780040 S.B.])입니다. 우리가 우수한 기술 지원, pBGYN 벡터를 제공 하는 Pst_a2 , 긴장과 T. Demura를 제공 하기 위한 제이 파커에 대 한 A. 자키, Y. 스즈키, Y. Sugisawa, E. Betsuyaku 감사 합니다.

참고: 그것은 수 면을 방지 하기 위해 중요 한 살아있는 잎의 움직임 동안 시간 경과 영상 샘플. 잎에 기계적 스트레스를 최소화 하기 위해 나뭇잎의 부드러운 고정은 필요 합니다. 만 적절 하 게 준비 된 잎 샘플 생산 시간 경과 이미지 다양 한 이미지 분석에 적합. P r 1 유전자 발기인 (pPR1 YFP NLS 식물)와 슈 도모 나 스 syringae pv의 통제 YFP NLS 융합을 표현 하는 유전자 변형 애기 식물을 사용 하는 프로토콜. 토마토 DC3000 (avrRpt2) 스트레인 (Pst_a2) 예를 들어 아래 설명.
1입니다. 식물 병원 체의 준비
<ol><li>플라스틱 셀 플러그 트레이 (자료 테이블) 압력가 토양을 채우십시오.</li>
	<li>셀 (그림 1A) 당 하나의 유전자 변형 애기 씨를 뿌린.</li>
	<li>23 ° C에서 유지 성장 방에 트레이 전송 하 고 2-3 주 연속 하얀 빛 아래 식물을 성장.</li>
	<li>2 일 전에 병원 체 접종, 슈 도모 나 스 syringae pv 행진. 토마토 DC3000 avrRpt2 NYG 매체 (5 g/L 펩, 3g/L 효 모 추출 물, 20 mL/L 글리세롤, 한 천 15 g/L 세균, pH 7.0) 포함 100 mg/L 리 팜 피신과 50 mg/L 대에 글리세롤 재고에서 (Pst_a2)를 변형 및 48 h 28 ° C에서 품 어.</li>
	<li>플라스틱 팁을 사용 하 여 매체의 표면에 나타나는 세균성 세포 수확 10 m m MgCl2를 포함 하는 플라스틱 튜브에 그들을 전송 하 고, resuspend. 600에 해결책의 광학 밀도 (OD) 측정 nm (OD600). 108 콜로 니 형성 단위 (CFU) 세균성 세포의 최종 셀 농도 조정 / mL, 일반적으로 해당 세600 하 = 0.211.</li>
</ol>2. 병원 균 접종
<ol><li>신중 하 게 식물을 손상 하지 않고 2-3-주-오래 된 공장을 포함 하는 셀 플러그를 잘라. 빈 셀 플러그 트레이의 셀 설정 (2 x 2 셀은 충분 한) (그림 1B) 좋은 균형을 유지 하기 위해.</li>
	<li>접종에 대 한 가시 건강 한 잎을 선택 합니다. 일반적으로, 3, 4, 5 잎을 (#3, #4, #5, 그림 1C에 각각,) 식물의 바닥에서 쉽게 처리할 수 있습니다. 사용 하 여 더 나은 재현성에 대 한 실험의 세트에 동일한 위치에 나뭇잎. 장기적인 시간 경과 영상에 대 한 접종 하기 전에 공장을 보유 하는 토양 물.</li>
	<li>필요한 경우, pPR1, 같은 스트레스 반응 발기인 분석의 경우 식물은 자연스럽 게 스트레스 안 되도록 검사 YFP 신호의 부재를 확인 하는 병원 체 접종 전에 형광 stereomicroscope 아래 나뭇잎. 제외는 실험에서 보여주는 YFP 신호를 떠난다.</li>
	<li>병원 체와 직접 접촉을 피하기 위해 침투 전에 일회용 라텍스 장갑을 착용 한다. 신중 하 게 세균 현 탁 액을 잎의 abaxial 측면 침투 1 mL needleless 플라스틱 주사기를 사용 하 여 (108 CFU/mL)11 (그림 1D). 잎의 절반에 작은 부분의 접종 pPR1 활동의 좋은 시각화 수 있습니다. 침투 지역 나머지 잎에 비해 색상에서 어두운 녹색으로 표시 됩니다. 하지 어떤 기계에 손상을 잎 침투 동안에 매우 주의 해야 합니다. 참고: 있는지 확인 모든 세포 공간 침투 지역에 완전히 병원 체 서 스 펜 션; (수직) 실현 그렇지 않으면, PCD 도메인 형광 stereomicroscope에서 시각화 하기 어려울 것 이다. 이 침투 지역에 어두운 녹화의 완성에 의해 간단 하 게 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>부드러운 종이 수건으로 침투 잎의 침투 섹션을 둘러싼 지역에서 세균성 정지의 과잉 흡수.</li>
</ol>3. 장착 접종된 잎
<ol><li>접종, 직후 침투 잎은 유리 슬라이드 중심에는 외과 테이프 (테이블의 재료)를 사용 하 여 플라스틱 쟁반에 유리 슬라이드를 수정 합니다. 접종된 리프 블레이드는 유리 슬라이드 (그림 2A) 내에서 완전히 장착 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>이중 레이어 플라스틱 테이프를 준비 (0.2 m m 두꺼운 테이프의 경우 재료의 표참조) 두 가지로 잘라 조각 (그림 2B, 조각 1과 2) 침투 잎의 잎 자루에 따라 공간에 맞게. 이 두 조각, 그림 2B, 그림 2A양방향 화살표의 길이에 맞게 양방향 화살표 표시의 길이 정렬 합니다. 참고: 두 개의 조각의 각 코너에 밖으로 절단 하는 데 도움이 리프 블레이드 손상을 방지 (그림 2B, 화살촉; 단계 아래 3.4 참조). 비슷한 두께와 플라스틱 테이프의 어떤 종류는 잎 자루에는 다리를 만들기 위해 적당 하다. 플라스틱 테이프의 강성은 아래 설명 된 절차 중 쉬운 취급을 위해 중요 하다.</li>
	<li>고급 핀셋의 쌍을 사용 하 여, 리프 블레이드 (그림 2C)의 각 조각 잘라 모서리 정렬 되도록 테이프 조각 1과 2는 잎 자루의 양쪽에 스틱. 테이프 조각 잎 자루 또는 리프 블레이드를 만지지 마십시오 있는지 확인 합니다. 참고: 이러한 두 계층 플라스틱 테이프 조각의 기지에서 리프 블레이드 스페이서 역할 및 설치 하는 동안에 잎 자루 물리적 스트레스를 방지.</li>
	<li>그림 2B 양방향 화살표의 크기에 맞게 테이프 조각 1과 잎 자루 ( 를 통해 다리를 형성 하는 2의 위에 막대기를 준비 하는 이중 레이어 플라스틱 테이프 (그림 2B, 조각 3)의 추가적인 조각 그림 2D, E). 그림 2D, E에화살표와 함께 표시 하는 위치에 테이프 조각 사이 직접 잎 자루와 잎 잎을 잡으려고 하지 매우 주의 해야 합니다.</li>
	<li>리프 블레이드는 유리 슬라이드에 아주 부드럽게 고정 되도록 부드럽게 리프 블레이드 팁 위에 유리 슬라이드에 외과 테이프 (그림 2F, 4 조각)의 작은 조각 막대기. 만 직접 유리 슬라이드 (그림 2F, 빨간 점선으로 표시 하는 지역), 감동 하는 외과 테이프의 일부를 단단히 눌러 하지 다른 부분 잎을 overlying.</li>
	<li>부드럽게 외과 테이프 (그림 2G, 조각 5)의 다른 작은 조각을 잎 자루의 테두리에 스틱과 잎 자루는 매우 부드럽게 고정 유리 슬라이드와 플라스틱 테이프 조각 있도록 플라스틱 테이프 조각 (1, 2, 및 3). 만 직접 유리 슬라이드를 플라스틱 테이프 조각 (그림 2G, 빨간 점선으로 표시 하는 지역), 유리 슬라이드를 만지고 외과 테이프의 부분을 단단히 연결 하지 다른 부분에서 잎 자루를 overlying.</li>
	<li>200 µ L 피 펫 팁 (그림 2H)를 사용 하 여 현미경의 시야에 이동에서 이웃 잎을 방지 합니다. 부드럽게 침투 잎에서 이웃 나뭇잎을 토양에 피 펫 팁을 삽입 합니다. 수 팁 가능한 루트 손상을 방지 하기 위해 토양에 너무 깊이 삽입 하지 않도록 주의 하십시오. 참고: 준비 된 식물은 이제 형광 stereomicroscope 이미징에 대 한 준비.</li>
</ol>4. 미세한 시간 경과 관찰
<ol><li>형광 stereomicroscope를 켭니다. 참고: 여기, 12 비트 모드에서 디지털 카메라를 사용 하는 매우 중요 한 1.4 메가 픽셀 흑백으로 장착 된 자동된 stereomicroscope (자료 테이블). 현미경 시간 경과 영상 동안 23 ° C에서 실내 온도 유지 하기 위해 적절 한 환기와 에어컨 장치를 장착 하는 어두운 방에서 또는 어두운 캐비닛에 배치 되어야 합니다.</li>
	<li>이미징에 대 한 stereomicroscope의 대물 렌즈 아래 위의 공간에 식물을 설정 합니다.</li>
	<li>시간 경과 영상에 대 한 매개 변수 설정 ( 표 1의 예 참조). 있는지 확인 하십시오 빛의 노출에 대 한 프로그램 단계 빛 식물 면역12에 큰 영향을가지고 있기 때문에 시간 경과 이미징의 간격 기간 동안.<ol>
<li>(여기 500-520 nm; 방출 540-580 nm) 기존의 YFP 필터를 사용 하 여 YFP 신호를 시각화.</li>
		<li>(여기 540-580 nm, 방출 610 nm 긴 패스) PCD 도메인 YFP 긍정적인 셀 레이어9 (그림 3 에 의해 둘러싸인 어두운 영역 (autofluorescence)으로 표시 되도록 엽록소 autofluorescence를 시각화 하기 위해 텍사스 레드 (TXR) 필터 사용 A)입니다.</li>
		<li>기존의 피 밝은 필드 설치를 사용 하 여 추가 빛 노출 단계. 참고: 실험, 전에 피 밝은 광원의 전력을 측정 하 고 자신의 식물 성장 조건의 수준으로 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시간 경과 화상 진 찰 프로그램을 실행 합니다. 몇 일 동안 장기 관찰에 대 한 가벼운 노출 단계 동안에 식물 적절 하 게, 예를 들어 급수 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>이미지 수집 후 데이터 집합에서 (채널 3-8 테이블 1에 해당 하는) 간격에 빛의 노출에 대 한 사용 되는 추가 채널을 생략 합니다. 피지9등 다른 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 관심 영역 (ROI) 분석 등 다양 한 방법으로 데이터를 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Tsuda, K., Somssich, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+networks+in+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Transcriptional networks in plant immunity.</a> New Phytologist. 206 (3), 932-947 (2015).</li>
<li>Mine, A., Sato, M., Tsuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+understanding+of+plant-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems understanding of plant-microbe interactions.</a> Frontiers in Plant Science. 5, (2014).</li>
<li>Murray, S. L., Thomson, C., Chini, A., Read, N. D., Loake, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel%2C+defense-related+Arabidopsis+mutant%2C+cir1%2C+isolated+by+luciferase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel, defense-related Arabidopsis mutant, cir1, isolated by luciferase imaging.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 15 (6), 557-566 (2002).</li>
<li>Spoel, S. H., Johnson, J. S., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tradeoffs+between+plant+defenses+against+pathogens+with+different+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (47), 18842-18847 (2007).</li>
<li>Asai, S., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cells+under+siege%3A+plant+immune+system+versus+pathogen+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cells under siege: plant immune system versus pathogen effectors.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 1-8 (2015).</li>
<li>Schmelzer, E., Kruger-Lebus, S., Hahlbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+Spatial+Patterns+of+Gene+Expression+around+Sites+of+Attempted+Fungal+Infection+in+Parsley+Leaves%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression around Sites of Attempted Fungal Infection in Parsley Leaves.</a> The Plant Cell. 1 (10), 993-1001 (1989).</li>
<li>Ohshima, M., Itoh, H., Matsuoka, M., Murakami, T., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+stress-induced+or+salicylic+acid-induced+expression+of+the+pathogenesis-related+1a+protein+gene+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of stress-induced or salicylic acid-induced expression of the pathogenesis-related 1a protein gene in transgenic tobacco.</a> The Plant Cell. 2 (2), 95-106 (1990).</li>
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<li>Betsuyaku, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+Acid+and+Jasmonic+Acid+Pathways+are+Activated+in+Spatially+Different+Domains+Around+the+Infection+Site+During+Effector-Triggered+Immunity+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Salicylic Acid and Jasmonic Acid Pathways are Activated in Spatially Different Domains Around the Infection Site During Effector-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana.</a> Plant & Cell Physiology. 59 (1), 8-16 (2018).</li>
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<li>Zeier, J., Pink, B., Mueller, M. J., Berger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+conditions+influence+specific+defence+responses+in+incompatible+plant-pathogen+interactions%3A+uncoupling+systemic+resistance+from+salicylic+acid+and+PR-1+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation.</a> Planta. 219 (4), 673-683 (2004).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes & Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리 애기 잎 자동된 형광 stereomicroscope를 사용 하 여 장기 관찰에 대 한 관심의 발기인의 통제 형광 성 취재 원 유전자를 표현 하는 생활을 탑재 하는 간단한 방법을 보고 합니다. 루트 조직;에서 형광 기자의 시간 경과 영상 자주 수행 그러나, 몇 가지 유사한 연구 잎 조직에서 실시 되었습니다. 잎은 뿌리는 종종 매장 하 고 탄탄 한 천 매체에 고정 공간에서 자유롭게 움직일 수 있기 때문에 가장 높습니다.
이 보고서에서 우리는 Pst_a2에 의해 유도 된 ETI 중 pPR1 활동의 spatiotemporal 역학에 집중 했다. 위에서 자세히 설명 하는 잎의 부드러운 고정 뿐 명확 하 게 발기인 활성화 및 PCD와 같은 휴대 전화 이벤트의 spatiotemporal 역학을 시각화 하는 것이 중요입니다. PPR1 활동 및 PCD 셀 사이의 구별이 날카로운 침투 지역에 세포 공간의 모든 완전히 병원 체 서 스 펜 션으로 가득 확인 (단계 2.4 참조). 이 때 중요 한 때문에 이러한 현미경 표본 동일한 세로 위치에 따라 모든 감지 신호 캡처 넓은 필드 형광 스테레오 현미경을 사용 하 여. 위 또는 아래 셀 PCD 도메인에 살아남은 세포에서 엽록소 autofluorescence 쉽게 아무 autofluorescence를 전시 하는 죽은 세포를 마스크 합니다. 이것은 또한 YFP 신호에 대 한 사실입니다.
시간 경과 영상에 대 한 조건을 신중 하 게 다른 실험 조건 하에서 몇몇 예비 실험을 통해 설립 될 필요가 있다. 시간 경과 영상에 대 한 매개 변수는 현미경 시스템, 유전자 변형 식물, 균. 등 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다. 이러한 매개 변수를 얻으려면, 우리는 먼저 7 hpi, pPR1의 초기 활성화와 거의 일치 한다에 침투 잎 YFP 신호 강도 대 한 다양 한 노출 시간 분석. 5 s 노출이이 연구에 사용 된 stereomicroscope와 YFP 신호 캡처에 대 한 적절 한 결정 했다. 유사한 테스트 엽록소 autofluorescence 이미징에 대 한 수행 했습니다. 3 분 간격 사이의 빛에는 시료의 노출 시간 경과 이미징 프로그램으로 최대 노출 시간으로 보통 밝은 필드 이미징으로 짜여졌다. 우리의 시스템 (자료 테이블)를 사용 하 여 2.5 분 YFP, TXR, 및 밝은 필드 이미징 있다 수 있었습니다. 이 제약 조건은 3 분 간격을 선택에 대 한 기본 이유 이었다. 다음으로, 우리는이 시간 경과 상태 공장 샘플에 명백한 손상 발생 하 고 pPR1 (그림 3B, C)의 소성 가벼운 스트레스 관련 활성화를 유도 하지 않았다 확인 했다. 이것이 연구에 사용 된 프로그램의 개발을 했다. 따라서, 형광 영상의 3 분 간격으로 Pst_a2동안 pPR1 역학을 캡처에 대 한 충분 한 간주 되었다-ETI9중재.
발기인 기자 구문, NLS, 융합 형광 기자와 특히 이용 되었습니다 많은 그룹 및 연구 기관;에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 우리는 과연 그 외 여러분 에 의해 구문 사용 13. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 경우 사용할 수 있습니다 잎 조직 검사 모든 식물 생물학 연구에 적절 한 유전자 변형 식물 사용할 수 있습니다. 우리의 간단 하 고 쉬운 프로토콜에서 발생 하는 모든 생물학 사건의 spatiotemporal 역학을 분석 하 고 싶어 하는 연구자에 대 한 좋은 기회 나뭇잎, 면역 반응 등을 제공 합니다. 그것은 그럴듯한 테이프 조각을 사용 하 여 우리의 메서드는 표본에 약간의 물리적 스트레스를 유도입니다. 그러나,이 문제는 (그림 3C) 실험에서 모의 치료 등 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 포함 하 여 제어할 수 있습니다. 실험 조건을 더 수정 하 고 다른 조건 하에서 이러한 컨트롤을 분석 하 여 최적화 될 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 이미징 기기 및 기술의 급속 한 발전 생물학 이벤트의 복잡 한 spatiotemporal 측면에서 연구자의 관심을 자극 했다. 어떤 이미징 분석에 적절 한 장착 및 표본의 고정 가장 중요 한 문제 들이다. 장착 생활 애기 단풍이 연구 개발의 간단 하 고 다양 한 방법은 적용 하 고 다양 한 이미징 실험에 대 한 최적화 된 수 있습니다.

식물 면역 반응을 포함 한 동적 transcriptional 프로그래밍 여러 전사에 의해 규제 phytohormones1뿐만 아니라 요인. Transcriptome 데이터의 축적은 식물 면역 시스템에 정보를 수집 하기 위한 기회를 제공 합니다: 예를 들어 네트워크 구조 신호 폭포2. 그러나, 식물의 공간과 일시적인 역동성의 우리의 지식을 제한3,,45여전히 남아 있다.
이전 학문에서는, 방어 관련 유전자 발현의 spatiotemporal 규정은 되어 주로 분석 제자리 교 잡 및 β-glucuronidase (거 스) 기자 분석 결과6,,78을 사용 하 여. 이러한 메서드를 현장에서의 다양 한 유전자의 transcriptional 활성화 시각화를 사용. 그러나,이 절차의 표본, 화학 기정을 요구 하 고 따라서 모든 시간적인 정보 손실 될. 생물 학적 이벤트, 면역, 시간이 지남에 진행 상황 등. 기자로 서 luciferase 사용 하 여 관심3의 발기인의 일시적인 역동성의 캡처 수 있게 되었습니다. 그러나, luciferase 기반 분석 결과 비싼 기판 및 고감도 검출기 필요합니다. 간단한 절차를 사용 하 여 식물 면역 응답의 spatiotemporal 측면에 대 한 우리의 이해를 높이기 위해 유전자 변형 애기 thaliana 생성 노란 형광 성 단백질 (YFP)를 표현 하는 식물 유전자 융합 하는 핵 지 방화 신호 (NLS YFP) Pathogenesis-Related 1 (PR1)9, 방어 관련 마커 유전자의 발기인의 통제. 우리 프로그램 된 세포 죽음 (PCD), 종종 이펙터 트리거 면역 (ETI), 특정 병원 체 감염9 에 의해 유도 된 식물의 형태 발생의 과정을 잡으려고 엽록소 autofluorescence, 살아있는 세포의 표식 사용 , 10.와 같은 개체를 자유롭게 이동에 형광 신호 강도의 시간적 역학 모니터링 애기 잎 생활, 복잡 한 이미지 프로세싱 소프트웨어 자체 내장 또는 사용 가능한 상업적으로 필요 합니다. 또는 이동에서 견본을 방지 하는 것은 문제를 해결 하는 간단한 방법입니다. 여기, 우리는 장착 된 자동된 형광 stereomicroscope 아래 장기 관찰에 대 한 유전자 변형 애기 식물의 잎을 생활에 대 한 다양 하 고 간단한 방법을 개발. 메서드를 몇 일 동안 토양 재배 그대로 공장 내에서 역학 나뭇잎 발기인을 캡처할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Protease Peptone No. 3</td><td>BD biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>BD biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>BM2 토양</td><td>Berger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17017-35</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Wako</td><td>113-00343</td><td></td></tr><tr><td>Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI 및 Leica EL6000 (Las X 소프트웨어 조절)</td> <td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Yellow 형광 단백질 (YFP) 및 Texas Red (TXR) 필터 설치</td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slide Glass (크기: 76 mm &times; 26 mm, 두께: 1.0&ndash; 1.2 mm)</td><td>MATSUNAMI</td><td>S1112</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Surgical Tape (1.25 cm &times; 9 m)</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>바늘 없는 1 ml 플라스틱 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 셀 플러그 트레이 (셀 크기: 44 mm&nbsp; &times; 44mm &times; 44 mm)</td><td>Tanaka sangyo, Japan</td><td>htray-bk72</td><td>비슷한 크기의 셀이 있는 Any&nbsp; 트레이는</td></tr><tr><td>Rifampicin을 사용할 수 있습니다.</td><td>NACALAI Tesque</td><td>30259-81</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 테이프 (0.2 mm 두께&시간; 19 mm 너비&시간; 10 m 길이)</td><td>Yamato</td><td>No0200-19-1</td><td>비슷한 두께의 어떤 플라스틱/비닐 테이프도 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

intravital 시간 경과 영상에 대 한 애기 를 장착 하는 다양 한 방법을 나뭇잎합니다

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

식물 면역 반응 게놈 넓은 transcriptional 재프로그래밍과 관련 된 감염의 사이트에 시작 됩니다. 따라서, 공간에 그리고 일시적으로 면역 반응 통제 된다. 통제는 자동된 형광 현미경과 함께에서 면역 관련 발기인의 형광 유전자를 사용 하 여 식물의 spatiotemporal 규정을 이해 하는 간단한 방법입니다. 다양 한 다양 한 intravital 형광 이미징 실험에 사용 된 루트 조직, 대조적으로 발생 하는 공 수 미생물 감염의 배열을 잎 조직에 대 한 몇 가지 형광 라이브 이미징 예제 존재 한다. 따라서, 우리는 시간의 연장된 기간 동안 라이브 셀 이미징에 대 한 애기 thaliana 식물의 잎을 거치 하는 간단한 방법을 개발 했다. 우리는, Pathogenesis-Related 1 (방어 관련 마커 유전자의 발기인의 통제 핵 지 방화 신호 (NLS)에 노란 형광 성 단백질 (YFP) genefused을 표현 하는 유전자 변형 애기 식물 사용 P r 1)입니다. 우리 슈 도모 나 스 syringae pv와 유전자 변형 잎에 침투. 토마토 DC3000 (avrRpt2) (Pst_a2)를 변형 하 고 수행 하는 자동된 형광 stereomicroscope를 사용 하 여 40 h의 총 YFP 신호의 vivo에서 시간 경과 영상. 이 방법은 식물 면역 반응에 대 한 연구 뿐만 아니라 다양 한 발달 이벤트 및 잎 조직에서 발생 하는 환경 응답의 분석에 활용할 수 있습니다.

여기, 우리가 Pst_a2사용-예를 들어 시간 경과 영상에 대 한 ETI를 유도. 일련의 이미지를 그림 3B에 몇 가지 표시 됩니다, 그리고 시간 경과 영화 (보충 영화 1)9시간 경과 데이터 획득 했다. Pst_a2중 pPR1 YFP NLS를 사용 하 여 성공적인 실험에서-유도 ETI, pPR1 의 과도 활성화 관찰 되었다, YFP foci, PCD 도메인 (그림 3B) 주변 세포의 여러 계층에서 표현에서 분명 9. 보통 PCD 도메인을 둘러싼 셀에 pPR1 의 활성화 약 5 시간 게시물 접종 (hpi), 약 12 hpi에 봉우리에서 시작 하 고 지속 40 hpi (그림 3B)9. 이미지는 피 형광 시스템을 사용 하 여 인수 했다, 이후 여기 얻은 YFP 신호 표 피 뿐만 아니라 위 mesophyll 셀을 포함 하 여 여러 adaxial 세포 층에서 생성 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59147/59147fig1.jpg"> 그림 1 : 세균성 병원 체에의 침투에 대 한 사용 되는 방법에 애기 thaliana 잎. (A) 2-에 3 주 된 애기 식물 셀 플러그 트레이에 성장 했다. (B) 1 셀 연결 포함 된 접종 및 관측에 사용할 선택한 식물은 그만 균형을 유지 하기 위해 빈 셀 플러그 트레이에 배치 합니다. (C) 3, 4, 5 잎을 (#3, #4, #5, 각각) 이미지 분석에 적합. 병원 체 서 스 펜 션의 (D) 침투 needleless 주사 통을 사용 하 여 선택한 잎으로 나머지 잎 보다는 더 어두운 녹색 색상에 따라 침투 영역을 인식할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59147/59147fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59147/59147fig2.jpg"> 그림 2 : 침투는 장착에 사용 되는 방법 애기 시간 경과 영상에 대 한 잎. (A) 접종된 잎 아래에 고정 유리 슬라이드와 애기 식물의 사진. 침투 잎 유리 슬라이드 중앙에 배치 했다. 양방향 화살표는 플라스틱 테이프 간격의 길이 나타냅니다. (B) 플라스틱 테이프 스페이서와 브리지의 준비. 더블-레이어 플라스틱 테이프 2로 절단 했다 다리를 준비 하는 스페이서에 대 한 조각 (1 및 2) 및 다른 조각 (3, 빨간 점선으로 표시) 렸. 양방향 화살표의 길이 (A) 양방향 화살표의 길이 거의 동일 합니다. 1과 2, 화살표, 표시의 네 모퉁이 중 하나 절단 했다. 이중 레이어 플라스틱 테이프 (1과 2로 번호가 지정) (C) 두 조각 잎 자루는 잎 자루와 잎 블레이드와 직접 접촉 하지 않고 정밀한 핀셋의 쌍을 사용 하 여 따라 슬라이드 유리에 붙여 신중 하 게 했다. (D) 이중 층 플라스틱 테이프 (번호 3), (B)에서 준비 된의 추가적인 조각 테이프 1와 2 사이 잎 자루를 잡으려고 하지 하면서 두 기저 스페이서 (1 및 2), 잎 자루에는 다리를에 배치 했다 위치는 화살표와 함께 표시. (E) 사진 녹화 잎 자루를 보여주는. 화살표와 함께 표시 하는 위치에서 플라스틱 테이프 조각 사이 직접 식물 조직 잡으려고 하지 중요 하다. 외과 테이프 (번호 4)의 (F) A 작은 조각은 부드럽게 리프 블레이드 팁 주위 유리 슬라이드에 붙여 되었다. 빨간색 파선에 의해 제시 된 영역만 유리 슬라이드에 단단히 눌러 졌다. 외과 테이프 (번호 5)의 (G) 다른 작은 조각은 부드럽게 잎 자루 및 플라스틱 테이프 조각 테두리에 붙여 되었다. 빨간색 파선에 의해 제시 된 영역만 부드럽게 슬라이드 유리 및 플라스틱 테이프 조각에는 잎 자루를 해결 하기 위한 눌렀습니다. (H) 2 일회용 피 펫 팁은 stereomicroscope의 시야에 이동에서 이웃 잎을 방지 하기 위해 사용 되었다. 피 펫 팁은 적절 한 위치에 토양에 직접 삽입 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59147/59147fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59147/59147fig3.jpg"> 그림 3 : 대표를 사용 하 여 결과 애기 메서드를 장착 하는 잎. (A) 유전자 변형 애기 잎 (pPR1 YFP NLS 공장)의 형광 stereomicroscopic 이미지. 잎의 일부 Pst_a2 와 침투 했다 (108 CFU/mL) abaxial 표면에 그리고 이미지 22 시간 게시물 접종 (hpi)에서 체포 되었다. PPR1 발기인 활성화 되었다 핵 YFP 필터를 사용 하 여 검색 하 고 프로그램 된 세포 죽음 (PCD) 텍사스 레드 (TXR) 필터를 사용 하 여 엽록소 autofluorescence의 손실에 따라 감지 되었습니다. 눈금 막대 = 2.5 m m. (B) 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 얻은 800 이미지의 컬렉션에서 선택 된 몇 시간 경과 이미지. 이러한 데이터 40 hpi에 대 한 pPR1 활동의 spatiotemporal 역학의 비보에 개요를 제공합니다. 병합 된 이미지 YFP와 TXR 이미지의 표시 됩니다. 눈금 막대 = 2.5 m m. (C) 유전자 변형 리프 (pPR1 YFP NLS 공장)의 모의 침투. 모의 침투, 10 m m MgCl2 시간 경과 영상 다음 잎의 abaxial 쪽으로 침투 했다. 모의 치료 소성 pPR1 활동을 발생 하지 않았다 고 엽록소 autofluorescence 13 hpi에서 방해 하지 않았다. 화살표는 모의 침투의 위치를 나타냅니다. 눈금 막대 2.5 m m. = 이 이미지는 이전 연구9에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59147/59147fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59147/59147table1.jpg"> 표 1: 이 연구에 사용 된 시간 경과 이미징 프로그램.
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/59147/59147movie1.jpg"> 보충 영화 1: spatiotemporal 역학을 보여주는 시간 경과 영화 pPR1 활성화는 유전자 변형에 애기 잎에 의해 유도 된 다음 이펙터 트리거 면역 (ETI) Pst_a2 접종. Pst_a2 와 pPR1 YFP NLS 구성 들고 유전자 변형 잎의 abaxial 쪽의 부분 침투 했다 (108 CFU/mL). 이미지는 3 분 간격으로 40 h의 총 인수 했다. 표시 된 타임 스탬프 형식 dd:hh:mm:ss.sss에 있다. 이 영화는 이전 연구9에서 수정 되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59147/Movie.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

우리는 시간의 연장된 기간 동안 형광 라이브 이미징 애기 thaliana 잎을 수행 하기 위한 간단 하 고 다재 다능 한 방법 보고. 우리는 식물 면역 반응의 spatiotemporal 이해에 대 한 예를 들어 면역 관련 발기인의 통제 형광 성 취재 원 유전자를 표현 하는 유전자 변형 애기 식물을 사용 합니다.

Intravital 시간 경과 영상에 대 한 애기 를 장착 하는 다양 한 방법을 나뭇잎합니다

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

이 방법은 그대로 애기장잎에 면역과 같은 동적 생물학적 사건 동안 관심 있는 유전자의 현면적 조절에 응답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 며칠 동안 그대로 재배된 식물 잎에서 발기인 활동의 현면역학을 포착할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 플라스틱 셀 플러그 트레이에 자동 채광 토양을 채웁니다.각 세포에 1개의 형질전환 아라비도시스 씨앗을 뿌리는다. 트레이를 섭씨 23도유지의 성장실로 옮기고 2~3주 동안 연속백색광 조건에서 식물을 성장시면 된다. 병원균 접종 이틀 전에, 글리세롤 스톡에서 avrRpt2를 운반하는 병원균을 리터당 100 밀리그램, 가나마이신을 리터당 50밀리그램으로 함유한 NYG 배지로 줄입니다.48시간 동안 섭씨 28도에서 배양하십시오. 플라스틱 팁을 사용하여 매체 표면에 나타나는 세균 세포를 수확하십시오. 박테리아를 10 밀리몰라 마그네슘 염화 마그네슘이 함유된 플라스틱 튜브로 옮기고 다시 중단합니다.그런 다음 600 나노미터에서 용액의 광학 밀도를 측정합니다. 세균 세포의 최종 농도를 밀리리터당 1억 개의 콜로니 형성 단위로 조정하여 일반적으로 0.2의 OD600에 해당한다. 첫째, 2~3주 된 식물이 들어 있는 셀 플러그를 조심스럽게 잘라 식물을 손상시키지 않도록 하십시오.빈 셀 플러그 트레이에 셀을 설정하여 균형을 유지합니다. 접종을 위해 눈에 띄게 건강한 잎을 선택합니다. 일반적으로, 식물의 바닥에서 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 잎은 처리하기 쉽습니다.장기 경과 이미징을 위해 접종 전에 식물을 들고 있는 토양에 물을 주면 됩니다. 선택적으로, 스트레스 반응성 프로모터를 분석할 때 병원균 접종 전에 형광 스테레오현미경의 하뭇잎을 검사하여 YFP 신호의 부재를 확인한다. 다음으로, 침투 하는 동안 병원체와 직접 접촉을 피하기 위해 일회용 라텍스 장갑에 넣어.1 밀리리터 바늘없는 플라스틱 주사기를 사용하여 잎의 축축측에 세균 현탁액에 조심스럽게 침투합니다. 리프의 절반에 작은 부분의 접종은 PR1 프로모터 활성의 좋은 시각화를 가능하게한다. 부드러운 종이 타월을 사용하여 침투 된 잎의 침투 영역을 둘러싼 영역에서 과도한 세균 현탁액을 흡수하십시오.접종 직후 수술 용 테이프를 사용하여 유리 슬라이드를 플라스틱 트레이에 고정하여 침투 된 잎이 유리 슬라이드의 중앙에 위치하도록합니다. 접종된 잎 블레이드가 유리 슬라이드 내에 완전히 장착되어 있는지 확인합니다. 2층 플라스틱 테이프를 두 조각으로 자르고 침투한 잎의 잎을 따라 공간에 맞고 각 조각에서 모서리를 잘라냅니다.고급 핀셋을 사용하여 각 조각의 컷 모서리가 잎 블레이드의 베이스와 정렬되도록 petiole의 양쪽에 테이프 조각을 붙이면 테이프 조각이 petiole 또는 잎 블레이드에 닿지 않도록하십시오. 다음으로 텍스트 프로토콜 의 두 그림에 설명된 대로 이중 레이어 플라스틱 테이프를 추가로 준비합니다. 이전에 부착된 조각 위에 이 테이프 조각을 붙이면 쁘띠 조각 사이에 페티올 이나 잎 블레이드를 직접 잡지 않도록 주의하십시오.그런 다음 작은 수술 용 테이프를 잎 블레이드 끝 위의 유리 슬라이드에 부드럽게 붙이기 때문에 슬라이드에 매우 부드럽게 고정됩니다. 유리 슬라이드를 직접 만지는 테이프 의 부분에만 단단히 누릅니다. 다른 작은 수술용 테이프를 페티올과 플라스틱 테이프 조각의 테두리에 부드럽게 배치하여 페티올이 유리 슬라이드와 플라스틱 테이프 조각 모두에 매우 부드럽게 고정되어 유리 슬라이드 또는 플라스틱 테이프 조각을 직접 만지는 수술 용 테이프의 부분을 단단히 부착하십시오.200 마이크로리터 파이펫 팁을 토양에 부드럽게 삽입하여 인접한 잎을 침투한 잎에서 부드럽게 잡아냅니다. 먼저 형광 스테레오 현미경을 켭니다. 이미징을 위한 스테레오현미경의 객관적인 렌즈 아래 공간에 식물을 설정합니다.시간 경과 이미징에 대한 매개 변수를 설정합니다. 기존의 YFP 필터를 사용하여 YFP 신호를 시각화합니다. 텍사스 레드 필터를 사용하여 엽록소 자동 형광을 시각화하여 PCD 도메인이 YFP 양성 세포 층으로 둘러싸인 어두운 영역으로 볼 수 있습니다.다음으로 기존의 에피 브라이트 필드 설정을 사용하여 추가 광 노출 단계를 수행하여 빛이 식물 면역에 큰 영향을 미치기 때문에 시간 경과 이미징의 간격 기간 동안 광 노출단계를 프로그래밍해야 합니다. 시간 경과 이미징 프로그램을 실행합니다. 며칠 동안 장기 관찰을 위해 식물에 적절하게 물을 주는 것이 좋습니다.이미지 수집 후 데이터 집합의 간격으로 광 노출에 사용되는 추가 채널을 생략합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 영역 분석과 같은 다양한 방법으로 데이터를 분석합니다. 이 연구에서는, 유난한 시간 경과 화상 진찰을 위한 아라비도시스 잎의 장착을 위한 다목적 방법이 입증됩니다.avrRpt2 유도 ETI를 이용한 타임랩스 이미지 데이터의 대표적인 예는 일련의 이미지와 타임랩스 영화로 얻어진다. avrRpt2 유도 ETI 동안 pPR1-YPF-NLS를 사용하는 성공적인 실험에서 PR1 프로모터의 일시적인 활성화가 관찰되며, 이는 YFP에서 부터 PCD 도메인을 둘러싼 여러 층의 세포와 분명하게 드러난다. PCD 도메인을 둘러싼 세포에서 PR1 프로모터의 활성화는 일반적으로 약 5 시간 후 접종에서 시작, 약에서 피크 12 접종 후 접종 시간 및 최대 지속 40 시간 접종 후 접종.이 절차를 시도할 때는 텍스트에 설명된 대로 시간 경과 조건을 신중하게 설정해야 합니다. 이 절차에 따라 프로모터 활성은 분석 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 그리고 질적으로 분석할 수 있습니다. 이 분석은 우리가 근기 성 식물의 살아있는 잎에서 발생하는 생물학적 사건에서 유전자 발현의 현면역학을 탐구하는 데 도움이됩니다.

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