Name: 평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 호중구 세포외 함정(NET) 형성을 정량화하는 고처리량 분석법을 사용하여 면역학 및 자가면역 질환 연구를 수행하는 방법입니다. 이 기법은 공초점 현미경을 활용하여 NET 형성과 분해를 정밀하게 측정합니다.

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Eline J. Arends와 영 규 과장 켜기 없음 탱의 작품은 네덜란드 신장 재단 (17OKG04), 과학 연구 (90713460)를 위한 네덜란드 조직에서 임상 친교에 의해 지원 됩니다. 로 라 미 밴 Dam의 작품 연구 류 마티스 (FOREUM)를 위한 재단에 의해 지원 됩니다.

모든 환자와 건강 한 컨트롤 LUMC biobank에 참여 동의. 두 biobanking 연구 LUMC 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 건강 한 호 중구의 격리
<ol><li>2 개의 10 mL EDTA 코팅 관에 건강 한 기증자 로부터 말 초 혈액의 20 mL를 얻을.</li>
	<li>살 균 50 mL 튜브에 혈액 10 mL를 넣어 고 추가 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 최대 32.5 mL.</li>
	<li>
추가 셀 아래 밀도 그라데이션 (예:., Ficoll-amidotrizoaat).
	<ol>
<li>받아 밀도의 14 mL를 피펫으로 컨트롤러와 10ml 피펫으로 그라데이션</li>
		<li>50 mL 튜브의 하단에 피펫으로 장소.</li>
		<li>모 세관 효과 의해 최대에 도달할 때까지 중력 있는 피펫으로에서 흐름 밀도 그라데이션 수를 피펫으로 오프 피펫으로 컨트롤러를가지고 (1-2 mL 남아 있을 것입니다), 모터를 사용 하지 않고.</li>
		<li>피펫으로 피펫으로의 제거 하는 동안 밖으로 누출에서 밀도 그라데이션 방지 피펫으로 위에 엄지를 삽입 하 여 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>912 x g 및 가속 또는 브레이크 없이 실 온 (RT)에서 20 분 동안 튜브를 회전 합니다. 참고: 적혈구 (RBC)와 호 중구 높은 밀도 있고 50 mL 튜브의 하단에 있습니다. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 있으며 분리 밀도 그라데이션 위에 흰색 링으로. PBS 희석 플라즈마는 PBMCs에 위에 있을 것입니다. 필요한 경우 PBMCs 추가 세척 단계 PBS 가진 새로운 50 mL 튜브에 백색 반지를 전송 하 여 고립 될 수 있다.</li>
	<li>조심 스럽게 PBS 희석 플라즈마 및 마지막으로 가능한 만큼 밀도 그라디언트 레이어 제거 다음 PBMCs를 포함 하는 것은 첫째, 백색 반지 제거.</li>
	<li>
Neutrophil/적혈구 믹스에서 호 중구 분리, 차가운 멸 균 증류수로 적혈구를 lyse.
	<ol>
<li>차가운 멸 균 증류수 물 병을 10 배 집중 냉장고에서 PBS 플라스 크.</li>
		<li>이 단계에 대 한 신속 하 게 작동 합니다. 펠 릿 위에 직접 냉 멸 균 증류수의 36 개 mL를 추가 하 고 한 번 신중 하 게 섞으십시오. 20 후 10 x PBS의 4 개 mL를 추가 isotonic 솔루션 s. 한 번 신중 하 게 믹스.</li>
		<li>5 분 739 x g 와 4 ° C (Rbc의 제거)에 대 한 튜브를 회전 합니다. 호 중구는 흰색 펠 릿에 있을 것입니다.</li>
		<li>신중 하 게는 상쾌한을 삭제 합니다. 1.6.2 단계를 다시 수행 하 고 펠 릿 제대로 중단 된 ㄴ 다는 것을 확인.</li>
		<li>328 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 튜브를 회전</li>
		<li>조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 PBS의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend. 호 중구 계산 하 고 얼음에 그들을 유지. 참고: 혈액 (10 mL)의 1 튜브에서 예상된 수확량은 약 백만 15-75 호 중구.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 빨간 형광 세포 호 중구의 라벨
<ol><li>2 mL PBS의 15 mL 튜브에서에 10-20 백만 호 중구의 호 중구 정지를 확인 합니다.</li>
	<li>2 µ M 빨간색 형광 셀 링커의 4 µ L 2 mL PBS의 솔루션 ( 재료의 표참조) 다른 15 mL 튜브에. 부드럽게 호 중구 정지에 이것을 추가 하 고 신중 하 게 혼합.</li>
	<li>빨간 형광 셀 링커는 중 성구를 37 ° C에서 정확히 25 분 동안 어둠 속에서 품 어.</li>
	<li>비활성화 라벨 10% 열 포함 된 RPMI 1640 매체 비활성화 소 태아 혈 청 (FCS)을 추가 하 여 실시간에 최대 15 mL와 혼합 한 번 신중 하 게. 펠 릿을 형성 하는 경우 펠 릿 신중 하 게 resuspended 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>328 x g 및 실시간 5 분에 대 한 튜브를 회전</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 페 놀 레드 무료 RPMI 1640의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 2 %FCS 및 10% 포함 된 중간 P/S 실시간에는 호 중구 계산. 참고: 50%의 셀 손실 빨간 형광 셀 라벨 후 발생할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 호 중구 Extracellular 함정 형성의 유도
<ol><li>셀 정지 0.42 x 106 셀/mL에 페 놀 레드 RPMI 1640 중간 포함 2 %FCS 10%를 무료 하 게 P/s.</li>
	<li>검은 96-글쎄, 플랫 바닥 접시에 잘 당 90 µ L에서 37,500 neutrophils를 추가 합니다.</li>
	<li>우물에서 10%의 농도 도달 하는 3 중에서 선택한 자극 (예를 들어, 환자의 세라)의 10 µ L를 추가 합니다. 항상 3 중에 부정적인 제어 (중간)를 포함 합니다.</li>
	<li>H. 잠복기 4 h 제안에 대 한 2, 4 또는 6에서 30 분까지 원하는 시간에 대 한 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어.</li>
	<li>필요한 추가 25 µ L 5 µ M 스며들 지 않는 DNA의 염색 ( 재료의 표참조), 우물에 1 µ M의 최종 농도 도달 하는 볼륨을 계산 합니다. 만들기는 predilution 필요한 경우 RPMI 1640 중간 포함 2 %FCS 10 %P / S 5 µ M 농도를.</li>
	<li>보육 시간의 끝 전에 5 µ M 스며들 지 않는 DNA 염색 15 분의 25 µ L를 추가 합니다. 어둠 속에서 37 ° C에서 또 다른 15 분 동안 부 화를 계속 합니다.</li>
	<li>매우 신중 하 게 상쾌한 (~ 125 µ L)를 제거 하 고 필요한 경우 저장. 4 %paraformaldehyde (PFA)의 100 µ L를 추가 합니다. 어둠 속에서 유지 하 고 즉시 4 단계를 계속.</li>
</ol>4. NET 시각화 3D이 콘텐츠, 고해상도 면역 형광 검사 Confocal 현미경 검사 법으로
<ol><li>
인수 설정을 클릭 하 여 면역 형광 검사 confocal 현미경에 설정을 구성 합니다.
	<ol>
<li>구성 탭에서 클릭 합니다.</li>
		<li>목표와 카메라를 선택 합니다. Confocal 60 µ m의 작은 구멍의 수집 모드와 10 X Apo 람다 목표를 선택 합니다.</li>
		<li>접시 에 클릭을 선택 플라스틱 96 잘 접시. 방문 하 여 고정 된 수의 사이트를 선택 사이트를 선택 합니다. 커버는 잘의 45%의 총 오버랩 (0 µ m), 없이 3 행과 3 열을 입력 합니다.</li>
		<li>수집을 클릭 합니다. 초점 레이저 기반 활성화선택 하십시오. 필요한 경우 인수 Z 시리즈/시계열 을 선택 합니다.</li>
		<li>사이트 자동 초점을 클릭 하십시오.<ol>
<li>접시 바닥에 초점 을 클릭 | 바닥 두께 의해 떨어져 설정합니다. 첫 번째 잘 선택, 샘플을 찾을 수 초기 잘 인수. 사이트 자동 초점에 대 한 모든 사이트를 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>파장을 클릭 하십시오.<ol>
<li>파장의 수 2를 선택 하십시오. TL 음영 보정 상세 레벨에 대 한 2를 선택 합니다.</li>
			<li>파장 1, 텍사스 레드를 선택 합니다.<ol>
<li>자동 옵션을 선택 레이저 Z 오프셋에 대 한 게시 레이저 오프셋 1.1 µ m. 사용 Z-스택 사용자 지정 범위 200-10의.</li>
			</ol>
</li>
			<li>파장 2 FITC를 선택 합니다.<ol>
<li>자동 옵션에 대 한 선택 레이저 w1에서 Z 오프셋 0 µ m.를 사용 하 여 Z-스택 200-10의 사용자 지정 범위.</li>
				<li>인수 옵션에 대 한 Z 시리즈 및 최대 2D 프로젝션 이미지를 선택 합니다. 인수 옵션 선택 음영 보정 | .</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Z 시리즈를 선택 합니다. 단계 수를 선택: 10. 단계 크기 선택: 3 m m (전체 범위는 27 µ m를 될 것입니다).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법에는 접시를 넣어.
	<ol>
<li>실행 탭을 클릭 하십시오.<ol>
<li>플레이트 이름 및 설명을 입력 하 고 저장 위치를 선택 합니다.</li>
			<li>취득 하는 우물을 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>텍사스 레드와 FITC에 대 한 노출 시간을 선택 합니다.</li>
	<li>취득 접시 접시 당 약 1 시간을 걸릴 것입니다 인수, 시작을 클릭 하십시오.</li>
</ol>5입니다. 그물 형성 분석
<ol><li>그물 형성 분석을 과학적인 다차원 이미지 ( 재료의 표참조)의 분석에 대 한 설계 된 프로그램을 처리 하는 이미지를 사용 합니다.</li>
	<li>획득된 한 이미지 데이터를 별도 하드 드라이브를 전송.</li>
	<li>
도구를 추가 하는 색상을 선택 합니다.
	<ol>
<li>W1 선택한 데이터가 저장 된 하드 드라이브에서 폴더를 선택 합니다.</li>
		<li>W2 선택한 데이터가 저장 된 하드 드라이브에서 폴더를 선택 합니다. 참고: 텍사스 레드 이미지에 붉은 색을 추가 하려면 파일 이름에 w 1를 사용 하 여 녹색 색상 이미지를 추가 FITC w2 사용 하는 표준 매크로 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분석 매크로 선택 합니다.
	<ol>
<li>W1선택, 임계값 값 (강도 임계값)는 일반적으로 10을 선택 합니다. 원하는 픽셀 값 (크기 임계값, 예를 들어, 100)을 선택 합니다.</li>
		<li>W2선택, 임계값 값 (강도 임계값)는 일반적으로 10을 선택 합니다. 원하는 픽셀 값 (크기 임계값, 예를 들어, 500)를 선택 합니다.</li>
		<li>분석, 실행 스프레드시트 파일의 대상을 선택 하 고 나중에 로그 파일을 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스프레드시트에서 데이터를 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 분석 결과의 가장 중요 한 부분은 때문에 호 중구 단기 고정 면 죽을 각 실험에 대 한 갓 고립 된 중 성구를 사용 하는 필요. 이 건강 한 기증자를 기증자 특성 때문에 몇 가지 유사 콘텐츠를 옭 아 매기 수 때마다 필요 합니다. 이러한 변화 중 하나는 호 중구의 활성화 상태입니다. 호 중구는 이미 생체 조건 격리 전에 활성화 될 수 있습니다. 또한, 호 중구는 적혈구의 세포 중 특히 격리 단계에 걸쳐 활성화 될 수 있다, 따라서 호 중구의 경험된 처리기 호 중구의 활성화를 최소화 하는 데 필요한. 일반적으로, 호 중구의 격리 혈액 그림 후 최대한 빨리 수행 해야 하 고 실험 과도 한 자발적인 활성화를 방지 하는 일시 중지 안 한다. 둘째, 호 중구의 거친 취급은 피해 야 한다. 이와 같이, 설명된 프로토콜의 주목할 만한 장점은 호 중구 96 잘 접시에 시드는 일단 최소 pipetting 개입입니다. 중요 한 것은,은 호 중구의 활성화 상태입니다 unstimulated 상태는이 분석 결과 민감하게 그물 형성의 저급을 검색할 수 있습니다 가장 평가 된다. 분석 결과 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요소는 매체에서 FCS의 사용 이다. FCS의 비율 10%에서 그물 형성의 가능한 억제를 피하기 위해 2% 항 산화 활동19,20 또는 열 비활성화에도 불구 하 고 호 중구의 가능한 활성화 감소 되었습니다 했다. 문화 FCS 없이 또는 미디어의 사용 종류와 시도 하지는. Unstimulated 또는 매체 제어는 항상 촬영 따라 분석 결과 수행할 때 배경 신호 (예:, 의 활성화 상태는 호 중구)의 표시를. Unstimulated 샘플에 비해 각 자극에 대 한 배 증가 같은 자극을 사용 하 여 다양 한 실험을 통해 일관 된 결과 달성 하기 위해 표시 됩니다.
가능한 높은 백그라운드에 대 한 중요 한 요소가 그물 형성의 과정에 관련 있는 extracellular DNA의 얼룩은. 현재 분석 결과 15 분의 짧은 잠복기 후 즉시 extracellular DNA 얼룩을 제거 하 여 및 고정 후 직접 접시를 분석 하 여 이것을 줄이기 위해 시도 합니다. 따라서, 그것은 충분 한 속도 96 잘 접시를 잡으려고 분석 성능 고급 confocal 현미경을 사용 하 여 필수 1-2 헤 자동 내 노출 시간 및 초점의 설정 것이 좋습니다. 따라서, 현미경 설정을 각 샘플 사이 변화 하 고 전반적으로 최적의 화질을 위해 필요한 컬러 강도 임계값에 관하여 실험 수 있습니다. 후자의 영향 최종 기능 중 성구 및 그물 및 최적의 설정은 올바르게 계량을 따라서 여러 컨트롤 샘플 (예를 들어, 건강 한 컨트롤의 혈 청)을 사용 하 여 확인 한다. 캡처된 이미지의 분석 동안 픽셀 임계값 및 분석 프로그램에서 크기 임계값을 사용 하 여 NET 형성의 더 나은 선택을 허용합니다.
NET에서 파생 하는 extracellular DNA 고유 죽음 통로, NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis 또는 중요 한 그물 형성1의 비 용균성 과정 등의 결과 수 있습니다. 따라서, 현재의 분석 결과 한계 extracellular DNA에만 얼룩이 여는 아무 차별화 가능한 그물 형성 및 다른 관련 세포 죽음 통로 사이입니다. 그것은 그물 형성을 underpinning 다른 모양 사이 차별 또는 별도 immunostainings에 의해 citH3, 네브라스카, 등 특정 NET 마커의 존재를 확인 고유 죽음 통로의 선택적 억제제 중 하나를 사용 하 여 이것을 달성 하는 것 DNA와 지역화 공동. CitH3와 extracellular DNA와 네브라스카의 공동 지역화 최근이 분석 결과10에 대 한 확인 되었습니다. 이 분석 결과에서 NET 특정 마커를 방지의 장점은 완전 하 고 높은 처리량 검열의 잠재력을 최대한 객관적으로 호 중구에 의해 DNA의 입체로 이어지는 네트워크 형성의 모든 형태를 평가 하기 위해 수 있습니다. 이 프로토콜의 적용은 낮은 수준의 순 유도는 질적, 양적 차이 감지 하는 능력 과정의 종류 보다 더 중요 한 수 있습니다 자동-면역 질환에서 면역 단지에 의해 중재를 공부에 보였다 참여10,,2122. 보여주는이 소설 NET 정량화 분석 결과 다른 연구자 네트워크 형성의 다양 한 측면을 조사에 대 한 부가 가치의 될 수 있습니다. 작은 조정 분석 결과를 쉽게 구현: 조정 자극 기간, 그물 형성을 선도 하는 하나의 특정 죽음 통로에 초점을 좋아하는 순수한 마커를 사용 하 여, 다른 배율 사용 또는 다른 NET 기준의 사용 정량화 그리고 분석입니다.
끝으로, 제공 하는 프로토콜 비보 전 유도의 그물의 다른 자극에 따라 평가 대 한 네트워크 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감한 광범위 하 게 적용 가능한 분석 결과 이다.

호 중구 extracellular 함정 (그물)의 형성은 호 중구 구조, 광범위 한 항균 및 위험한 분자, 세부적인 complexed와 같은 extracellular 3 차원 (3D) 웹에 그들의 DNA를 출시 하는 과정 및 세포질 효소, 펩 티 드 그리고 단백질입니다. 이러한 면역성 및 독성 구조 트랩을 죽이 전염 성 병원 체1건강 한 개인의 타고 난 면역성이 있는 방위에서 중요 한 생리 적인 역할을 있다. 그러나, 그들은 있다 또한 입증 되었습니다 혈전 증2 고 안티 neutrophil 세포질 항 체 (ANCA)를 포함 하 여 다양 한 조직 자기 면역 질병-폐색 (AAV)3, 반성 루 푸 스 (SLE 관련 )4,5, antiphospholipid 증후군 (APS)2,6, 류 마티스 관절염 (RA), 건 선, 그리고 통풍7,,89.
그물 형성 체 외 널리는 화학 화합물 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA), 대규모 네트워크 형성을 유도 하는 공부 되었다. 그러나 가장 생리 적 자극 그물 형성10의 다량 저수준을 유도. 연구에서 예를 들어 자기 면역 질병, NET 트리거 표준화, 민감한, 높은 처리량 양적 분석 결과 감지 하 여 계량 그물 형성 필요 하다. 그물의 정량화 어려운 것을 입증 했다 고 현재 각각 그들의 자신의 이점 및 제한 사항11가지 방법으로 수행 됩니다. 일반적으로 사용 되는 방법은 supernatants12, 목표만 이며, DNA (apoptotic, 괴 사 성, 그물)의 사이 차별 하지 않습니다 따라서 그물에 대 한 매우 구체적이 DNA의 탐지 이다. 둘째, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs)의 DNA complexed NET 특정 단백질, 예를 들어 myeloperoxidase (MPO) 또는 호 중구 elastase (네브라스카), 그물을 검색 하는 보다 구체적인 접근 방식을 고와 잘 상관 관계를 증명 했다 citrullinated 히스톤-3 (CitH3) 긍정적인 그물13. 그러나, 그것은이 방법은 모든 그물 (예: MPO, NE, 및 CitH3 부정적인 그물)를 데리 러 충분히 과민 인지 알 수 없습니다. 세 번째 방법은 그물 계량 extracellular DNA와 NET 관련 분자 (네브라스카, MPO, CitH3)의 공동 지역화를 감지 하는 데 사용 되는 면역 형광 검사 현미경 검사 법입니다. 이 메서드는 일반적으로 특정 그물, 하지만 그것은 높은 처리량 방법으로 적용할 수 없습니다 관찰자 편견 때문에 중요 하지 않은. 또한,이 방법은 고려 하지 않습니다 계정 MPO-, 네-, CitH3-부정적인 그물 자주 사용된 NET 트리거14,15에 따라 존재 하는. 교류 cytometry 방법을 그물-팅 neutrophils16핵의 붓기를 나타내는 변경된 앞 으로/측면 분산형 (FSC/SSC)을 통해 그물을 검색. 이 방법은 고려 하지 않습니다 계정에 확인 되었습니다, 생명 그물 형성17등 핵의 붓기를 포함 하지 수 있는 그물 형성의 다른 형태. 마지막으로, 면역 형광 검사 confocal 현미경 시각화 하 고 extracellular DNA12,18얼룩 셀 스며들 지 않는 염료와 extracellular DNA를 직접 얼룩에 의해 그물 형성 계량 적용 되었습니다. 일반적으로, 5 ~ 10 전력 필드는 수동으로 선택 및 평가, 96 잘 접시11,17의 각의 1-5%를 커버 하. 이미지의 수동 선택은 항상 객관적, 바이어스 경향이 높은 처리량 분석에 대 한 매력. 자동화, 높은 처리량 NET 정량화 분석 결과 최근에 3D 방식으로 덮고 그물을 평가 하는 매우 중요 한 기술을 선도 함으로써 Z 쌓아 면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법을 통해 13 µ m 우물의 11%를 몇 군데 개발 되었다 10기존 방법 비해. 현재 보고서는 3D confocal 현미경 검사 법, 각의 45%의 전체 이미지 면적을 달성 하 고 Z 스택을 통해 27 µ m 커버를 사용 하 여 자동화 된, 매우 중요 한 분석 결과 통해 네트워크 형성을 계량 하는 가장 최근의 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 높은 감도, 낮은 수준에서 객관적이 고 공평한 방식으로 그물 형성의 계량에 적합.

<table><tbody><tr><td>Aqua Sterile H2O</td><td>B. Braun, Melsungen, Germany</td><td>12604052</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FCS)</td><td>Bodinco, Alkmaar, The Netherlands</td><td></td><td>고농도로 사용하면 NET 형성에 영향을 미칠 수 있습니다</td></tr><tr><td>Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% 밀도 1.077 g/mL</td><td>LUMC, Leiden, The Netherlands</td><td>97902861</td><td></td></tr><tr><td>Immunofluorescence confocal microscope</td><td>Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutralization PBS (10x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (p/s)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free RPMI 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>11835-063</td><td>Phenol red는 면역형광 신호를 방해할 수 있습니다</td></tr>. 인<tr><td>산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>B. Braun, Melsungen, Germany</td><td>174628062</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 2 &mu; M 적색 형광 세포 링커</td><td>Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>PKH는 특허받은 형광 염료이자 발견자 Paul Karl Horan의 이름을 딴 세포 라벨링 기술입니다</td></tr>. 과학적 <tr><td>다차원 이미지 분석을 위한 프로그램</td><td>ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>52400-025</td><td></td></tr><tr><td>Sytox green 5 mM 불침투성 DNA 염료</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>57020</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain 0.4%</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>17942E</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate</td><td>Falcon, NY, USA</td><td>353219</td><td></td></tr></tbody></table>

평가 하 고 호 중구 extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

호 중구 extracellular 함정 (그물)는 면역성 extracellular DNA 구조를 다양 한 트리거 시 호 중구에 의해 출시 될 수 있습니다. 그물 트랩 및 미생물을 죽이고 하는 중요 한 호스트 방어 메커니즘으로 설명 되는. 다른 한편으로, 그들은 다양 한 조직의 자가 면역 질환에 연루 되었습니다. 그물은 관련 autoantigens 안티 neutrophil 세포질 항 체 (ANCA) 등의 풀을 포함 하는 면역성 및 독성 구조-관련 된 맥 (AAV) 및 반성 루 푸 스 (SLE). 그물의 다른 형태의 자극에 따라 유도 될 수 있다. 그물의 양은 supernatants, DNA-complexed myeloperoxidase (MPO) 또는 호 중구 elastase (네브라스카), 같은 NET-분자와 citrullinated의 존재를 측정 측정에 DNA 자료를 측정을 포함 하는 다른 기술을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 형광 현미경 검사 법, 또는 그들의 특이성, 감도, 객관성, 및 수량에 관한 서로 다른 기능을가지고 있는 모든 NET 구성 요소 흐름 cytometric 검출 히스톤. 여기는 3 차원 면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 매우 민감한, 높은 처리량 방식에서 vivo 그물 형성 전 계량 하는 프로토콜이입니다. 이 프로토콜은 네트워크 형성 및 건강과 질병에서 저하에 대 한 다양 한 연구 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있습니다.

호 중구 extracellular 함정 (그물) 형성 3D 방식에서 3 µ m 거리에 각 잘 초점면에서 시작 10 Z-스택을 통해 스테인드 extracellular DNA를 측정 하 여 정량 이다. 누적 영역 (그림 1A) 분석 결과 증가의 감도 측정 하 여 격리 된 호 중구는 98.7% 1.10% 다른 격리에서 14 다른 견본에서 측정의 표준 편차 (SD)의 의미 순도. 적혈구의 평균 백분율은 1.04% ± 1.1 %SD 그리고 monocytes의 평균 백분율은 0.085% ± 0.17 %SD (데이터 표시 되지 않음). 얼룩진된 neutrophils 몇 군데의 전체 면적에 각 잘 각 잘 0.99 (95% 신뢰 구간 [CI] 0.985 0.997의 피어슨 상관 계수와 총 호 중구 수를 크게 연관 있는 초점면에만 계량은 p &lt; 0.0001) (그림 1B). 호 중구에서 그물 형성의 정량화의 대표적인 결과 자극 AAV 환자 또는 매체 (MED)의 10% 세라와 누적 스테인드 extracellular DNA 영역으로 표현 된 부정적인 컨트롤로 군데 neutrophil (그림 당 10 Z-스택 1 C). AAV 자극 호 중구 (그림 2B)에 대표 이미지 unstimulated neutrophils (그림 2A)와 그물의 스냅샷을 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig1.jpg"> 그림 1: extracellular DNA와 호 중구 수를 측정 하 여 그물 형성의 정량화. 각 잘 unstimulated neutrophils (MED)와 호 중구 (AAV) 환자 ANCA 연관 된 맥의 혈 청 10%와 자극에 대 한 (A) 지역 10 Z 스택을 통해 누적 계량 (n = 4)는 이미지 처리 프로그램 계량. 각 자극 3 중에서 테스트 되었습니다, 그리고 각 지점 평균 값을 나타냅니다. (B) 붉은 형광 이라는 세포 공간과 세포 수는 이미지 처리 프로그램에 의해 각의 초점면에 계량 했다 (R2 = 0.99, p &lt; 0.0001). (C) 그물 형성 군데 neutrophil (셀 영역) 당 누적 영역으로 표시 됩니다. 각 3 중의 평균 (SEM)의 평균 ± 표준 오차는 자극 당 플롯 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig2.jpg"> 그림 2: NET 정량화 분석 결과의 스냅샷을. 형광 이라는 neutrophils 빨간색으로 표시 되 고 얼룩진된 extracellular DNA는 녹색으로 표시 됩니다. Apo 람다 계획 목표 x 10입니다. (A) Unstimulated 호 중구입니다. (B) 호 중구 AAV 혈 청을 자극된 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

우리는 호중구 세포 외 함정, 또는 NETs를 측정하기 위하여 높은 처리량 분석기를 개발했습니다. NET는 호중구에 의해 드러나는 면역원성 DNA 구조물입니다. NETs는 미생물을 함정에 빠뜨리고 죽일 수 있으며 따라서 중요한 항전염성 메커니즘이지만 자가 면역 질환에서 병원성 역할을합니다.이 기술을 통해 NET는 3차원 면역 형광 공초점 현미경 검사법에 의해 정량화되어 NET 형성 및 저하를 연구하는 매우 민감하고 높은 처리량 방법을 생성합니다. 이 기술은 우리가 자기 면역 질병을 가진 환자의 NET 대형을 정량화할 수 있게 합니다. ANCA 관련 혈관염 또는 전신 루푸스 홍반성 환자를 위한 Ex vivo NET 형성은 이 분석으로 모니터링될 수 있었다.또한 NET 형성을 대상으로 하는 잠재적인 치료법은 시험관내에서 이 분석으로 테스트될 수 있습니다. 호중구 고립은 전에이 기술을 수행 한 적이없는 사람들을위한 투쟁이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 두 개의 10 밀리리터 EDTA 코딩 튜브에서 건강한 기증자로부터 말초 혈액의 20 밀리리터를 얻을.멸균 50 밀리리터 튜브와 PBS에 10 밀리리터의 혈액을 최종 총 32.5 밀리리터로 옮기. 10밀리리터 파이펫과 파이펫 컨트롤러를 사용하여 밀도 그라데이션의 14 밀리리터를 차지합니다. 파이펫을 50밀리리터 튜브 바닥에 놓습니다.그런 다음 파이펫 컨트롤러를 피펫에서 꺼내 모세관 효과에 의해 최대값에 도달할 때까지 밀도 그라데이션이 중력에 의해 흐르도록 합니다. 피펫 위에 엄지 손가락을 놓아 남은 밀도 그라데이션이 누출되는 것을 방지한 다음 튜브에서 파이펫을 제거합니다. 가속이나 브레이크없이 20 분 동안 실온에서 912 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 백색 고리를 주의 깊게 제거하고 PBS 희석 플라즈마를 따랐다. 마지막으로 밀도 그라데이션 레이어를 가능한 한 많이 제거합니다. 다음으로, 냉장고에서 차가운 멸균 증류수 한 병과 10배 농축 PBS플라스크를 냉장고에서 회수합니다.빠르게 작업하면 펠릿 위에 직접 36 밀리리터의 물을 넣고 한 번 조심스럽게 섞습니다. 시작부터 계산된 20초 후에는 10x PBS의 4밀리리터를 추가하여 동소식 솔루션을 만듭니다. 그리고 다시, 신중하게 한 번 혼합.튜브를 739배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 버리고 펠릿이 고체되지 않기 때문에 매우 조심해야하며, 이전에 설명한 것처럼 차가운 멸균 증류수와 농축 된 PBS를 추가하는 과정을 신속하게 반복하십시오. 원심분리기는 328배, 섭씨 4도에서 5분간.신중하게 상체를 제거하고 PBS의 다섯 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 호중구를 계산하고 얼음에 보관하십시오. 먼저, 15밀리리터 튜브에서 PBS 의 2밀리리터에서 약 10~2천만 마리의 호중구를 함유한 호중구 현탁액을 만듭니다.다른 15 밀리리터 튜브에서 2 개의 밀리리터 PBS와 2 마이크로 몰라 적색 형광 세포 링커의 4 개의 마이크로 리터를 혼합하십시오. 적색 형광 세포 링커 용액을 호중구 서스펜션에 부드럽게 추가하고 조심스럽게 섞습니다. 알루미늄 호일에 튜브를 감싸서 빛으로부터 혼합물을 보호하고, 37도에서 정확히 25분 동안 배양하여 적색 형광 세포 링커로 호중구에 라벨을 부착합니다.실온에서 10%의 열 비활성화 FCS를 함유한 RPMI 1640 배지를 15밀리리터의 최종 부피에 첨가하여 라벨을 비활성화하고 한 번 신중하게 혼합합니다. 이 후에 펠릿이 형성된 후에, 조심스럽게 혼합물을 다시 중단합니다. 5 분 동안 실온에서 328 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.상체를 제거하기 전에 펠릿이 형성되었는지 확인하십시오. 그 후, 실온에서 2%의 FCS를 함유한 무적RPMI 1640 배지 의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 호중구를 계산합니다.페놀 무적RPMI 1640 배지에서 밀리리터당 420, 000 세포의 밀도로 세포 현탁액을 2%FCS를 함유한다. 블랙 96웰, 플랫 하단 플레이트의 각 웰에 90 마이크로 리터에 37, 500 호중구를 추가합니다. 다음으로, 각 우물에서 10%의 농도에 도달하기 위해 삼중판에 선택한 자극의 10 마이크로리터를 추가합니다.항상 삼중리에 음수 제어를 포함합니다. 30분에서 2시간, 4시간 또는 6시간 동안 원하는 시간 동안 37도의 어둠 속에서 배양합니다. 그런 다음, 5마이크로몰라 불투과성 DNA 염료의 25 마이크로리터를 첨가하여 각 웰에 하나의 마이크로몰라의 최종 농도에 도달하는 데 필요한 불투과성 DNA 염료의 부피를 준비한다.인큐베이션 시간이 끝나기 15분 전에 각 웰에 5마이크로몰라 불투과성 DNA 염료 25마이크로리터를 추가합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 마지막 15 분 동안 인큐베이션을 계속하십시오. 이 후, 매우 신중하게 상체를 제거하고 필요한 경우 저장합니다.4%의 파라포름알데히드의 마이크로리터 100기를 추가합니다. 접시를 어둠 속에서 유지하고 즉시 다음 섹션으로 진행합니다. 설정을 구성한 후 Z 시리즈를 선택합니다.10을 단계 수로 선택합니다. 단계 크기로 3 마이크로미터를 선택합니다. 면역 형광 공초점 현미경에 플레이트를 로드합니다.실행 탭을 클릭합니다. 플레이트 이름과 설명을 입력하고 저장 위치를 선택합니다. 획득해야 하는 우물을 선택합니다.텍사스 레드 및 FITC의 노출 시간을 선택합니다. 그런 다음 획득 판을 클릭하고 획득을 시작하면 플레이트당 약 1 시간이 소요됩니다. 이 후 분석 매크로를 선택합니다.그런 다음 w1을 선택하고 임계값을 선택합니다. 다음으로 원하는 픽셀 값을 선택합니다. 그리고 마지막으로 두 번째 이미지 J 창에서 w2를 선택하고 원하는 픽셀 값으로 임계값을 선택합니다.스프레드시트 파일에 대한 대상을 선택하고 분석을 실행하고 나중에 로그 파일을 저장합니다. 여기에 제시된 고도로 민감한 광범위하게 적용 가능한 분석법으로, 다른 자극에 대한 호중구 세포 외 트랩의 전 생체 유도 평가를 위한 호중구 세포 외 트랩 형성의 반자동 정량화를 위한 것이다. NET 형성은 각 우물의 초점 평면에서 시작되는 3마이크로미터 거리로 10Z 스택을 통해 스테인드 외세포 DNA를 정량화하여 3차원 방식으로 정량화된다.누적 면적을 측정하면 분석의 감도가 증가합니다. 이미지된 스테인드 호중구의 총 면적은 각 우물의 초점 평면에서만 정량화되어 있으며, 이는 Pearson 상관계수0.99로 각각의 총 호중구 수와 크게 상관관계가 있다. 호중구에서 NET 형성의 대표적인 결과는 심상 호중구당 10Z 스택을 통해 누적 염색된 세포외 DNA 영역으로 표현된다.그런 다음 스냅샷은 순 정량화 분석기에서 가져옵니다. AAV 자극호중구에서 자극되지 않은 호중구와 NETs의 대표적인 이미지는 적색의 형광 표지 호중구와 녹색의 염색된 세포외 DNA로 여기에 표시됩니다. 호중구는 주의하여 처리되어야 하며, PKH 라벨링은 프로토콜에 따라 정확하게 수행되어야 합니다.이 분석체는 NET의 형태학, 운동 학 및 구성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 건강과 질병에 있는 NET를 공부하는 가능성을 제공하는 또 다른 방법입니다. 트라이판 블루, PKH 및 PFA는 장갑으로 처리해야하며 직접 호흡해서는 안됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

High throughput assay는 인간 호중구에서 NET 방출을 정량화할 수 있는 우수한 도구를 함께 제공합니다.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

배우세요 호중구 세포외 함정(NET) 형성을 정량화하는 고처리량 분석법을 사용하여 면역학 및 자가면역 질환 연구를 수행하는 방법입니다. 이 기법은 공초점 현미경을 활용하여 NET 형성과 분해를 정밀하게 측정합니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

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