Name: 분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 배우세요 분리된 감자 잎을 이용한 Manduca sexta 곤충 먹이 공격에 대한 식물 유전자 발현 분석 방법을. 이 기법은 전사인자 동원체 발현을 측정하여 곤충-식물 상호작용 연구의 재현성을 높입니다.

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저자는 이 연구에 사용된 곤충을 제공하고 애벌레 준비에 있는 그들의 전문지식에 대한 밥 패러와 알렉시스 공원에 감사하고 싶습니다. 원고의 비판적 검토에 대한 마이클 블랙번과 Saikat 고쉬에 추가 감사.
이 출판물의 상품명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천 또는 보증을 의미하지 않습니다.
USDA는 평등한 기회 제공자 이자 고용주입니다.

참고: 다음 프로토콜은 한 사람이 설정하고 관찰하고 샘플을 수집할 수 있도록 설계되었습니다. 생물학적 복제를 증가시키기 위해 동일한 설정의 다중 실행이 결합될 수 있다. 실험의 추가 반복은 유전자 발현에 가능한 일주 영향을 제거하기 위해 하루 중 동시에 설정되어야합니다. 이 프로토콜은 5개의 개별 수확 시간 지점에 대해 3개의 '감염된' 잎을 생성하도록 설계되었습니다. 각 시점마다 일치하는 컨트롤 잎은 총 30개의 샘플을 만듭니다. 실험은 다양한 잎 크기 및 애벌레 단계로 수행 될 수 있지만 잎 크기, 애벌레 단계 및 감염 시간은 절차 전반에 걸쳐 일관되게하는 것이 좋습니다.
1. 감자 식물의 준비
참고 : 멸균 기술을 필요로하는 모든 단계는 조직 배양 후드18,19에서수행해야합니다.
<ol><li>베플랜트 소스에서 케네벡 식물을 준비합니다.<ol>
<li>전파 매체를 준비합니다.<ol>
<li>비타민 파우더를 함유한 무라시게와 스쿠그(MS) 4.43 g, 자당 20g, 한천 대체물 2g을 스핀바가 있는 2L 플라스크에 역삼투(RO) 정제수 1L에 넣습니다. 플라스크를 저어접시에 옮기고 섞는다. 계속 저어면서 NaOH를 사용하여 pH를 5.8로 조정합니다. 참고: 한천은 오토클레이브가 될 때까지 녹지 않습니다.</li>
			<li>20 분 (121 °C, 101.3 kPa)에 대한 액체 주기에 방부제 / 살균제 및 오토 클레이브 1 mL을 추가하십시오. 사이클이 끝난 직후 오토클레이브에서 배지를 제거하고 50°C로 식힙니다. 멸균 및 냉각된 전파 배지의 100 mL를 멸균 배양 용기(예를 들어, 마젠타 또는 플랜트콘)로 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용하여 이송한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이식 재료를 준비합니다.<ol>
<li>케네벡 종자 감자로 배식물 소스를 얻고 탭 H2O. 새싹을 제거하고 멸균 메스로 2cm 조각으로 잘라 서 토양의 모든 흔적을 제거합니다.</li>
			<li>새싹 조각을 70% 에탄올에 15s로 담그고 1:1 표백제(1부 RO-water: 1부분 농축 살균/상업용 등급 표백제)에 13분간 담가 소독합니다. 멸균 H 2O로 5회 헹구어 내보소서</li>
			<li>멸균 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 전파 배지를 가진 멸균 조직 배양 용기에 이식 물질을 전달한다. 혈관을 식물 조직 배양 챔버로 옮기고 2\u20123 주 동안 또는 24 °C, 16 h 빛 (140 μmol·m-2·1)/8 h 어두운 광기간에 식물이 형성될 때까지 성장한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>절제 된 조직 배양 감자 식물을 준비하십시오.<ol>
<li>절절 전달 매체를 준비합니다. 참고: 이것은 당일 에 사용될 수 있거나 미리 만들어질 수 있는 10개의 조직 배양 혈관을 만들고 절점 전달될 때까지 4°C에서 저장될 수 있다.<ol>
<li>36.43 g의 영양한 한천 믹스를 스핀 바가 있는 2L 플라스크에 RO 정제수 1L에 넣습니다. 플라스크를 저어접시에 옮기고 섞는다. 계속 저어면서 KOH를 사용하여 pH를 5.8로 조정합니다. 참고: 한천은 오토클레이브가 될 때까지 녹지 않습니다.</li>
			<li>20 분 동안 액체 사이클에 오토 클레이브 (121 °C, 101.3 kPa). 사이클이 끝난 직후 오토클레이브에서 배지를 제거하고 50°C로 식힙니다. 멸균 냉각 된 절달 전달 배지의 100 mL를 멸균 배양 용기 (재료 표참조)로 옮기고 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>절개를 준비합니다.<ol>
<li>베임 재료에서 자란 케네벡 식물을 구하십시오 (단계 1.1.2에서 생산). 플랜트렛에는 적어도 3~4개의 노드(분기 점)가 있어야 합니다. 멸균 가위 나 메스를 사용하여 잎을 제거합니다. 주 줄기에 가까운 가지를 자르고 약 2mm의 가지 조직을 남깁니다.</li>
			<li>각 분기점 또는 노드 에서 약 2mm 를 절단하여 절점 절개를 제거합니다. 절점 전달 배지(단계 1.2.1.2에서 제조)를 포함하는 멸균 조직 배양 용기에 절인 절단을 이전 용기(분기 포인팅 위쪽)와 동일한 방향으로 배열한다.</li>
			<li>식물 조직 배양 챔버에 절제 된 절단혈관을 옮기고 24 °C, 16 h 빛 (140 μmol ·m-1)/8 h 어두운 광주기에서 2\u20123 주 동안 성장한다. 참고 : 각 절제는 새로운 식물로 성장할 것입니다. 각 선박의 절단 수는 잎 크기를 결정합니다. 선박당 이송되는 절단 횟수가 줄어들면 잎이 커집니다. 선박 당 3 개의 식물은 2 \u20123 주에 15mm x 20mm 잎을 가질 것입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>(선택 사항) 토양 재배 케네벡 감자 식물을 준비합니다. 참고 : 더 큰 잎을 생산하기 위해, 절점 전파 감자 식물은 토양으로 전송 될 수있다.<ol>
<li>모든 뿌리 조직이 한천에서 방출 될 때까지 배지에서 식물을 부드럽게 당겨 서 토양에 절절 전달 배지에서 재배 감자 식물을 전송합니다.</li>
		<li>뿌리에서 1 절 바로 위의 토양으로 옮기고 이식 주위의 토양을 가볍게 포장합니다. 뿌리 시스템과 토양 접촉을 보장하기 위해 부드럽게 물.</li>
		<li>16 h 빛 (140 μmol·m-2·s -1)/8 h 어두운 광주기 및 25/20 °C 낮/밤 온도와 성장 챔버에 놓습니다. 참고 : 식물은 상단 두 개의 완전히 확장 된 잎이 분석에 적합한 크기에 도달하면 준비됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>(선택 사항) 덩이줄기에서 자란 감자 식물을 준비합니다. 참고: 덩이줄기에서 자란 감자 식물은 더 크고 견고하며 식물에서 유충을 사육하거나 밤새 애벌레 먹이를 원하는 경우 유용할 수 있습니다.<ol>
<li>10 mL 펠릿 느린 방출 비료로 보충 된 토양 혼합을 포함하는 냄비에 10 깊은 감자 덩이줄기 6을 놓습니다.</li>
		<li>16 h 빛 (140 μmol·m-2·s -1)/8 h 어두운 광주기 및 25/20 °C 낮/밤 온도와 성장 챔버에 놓습니다. 식물은 덩이줄기 심기로부터 약 30\u201240 일 준비가되어 있습니다. 참고: 꽃이 피우기 시작한 식물은 사용하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 먹이를위한 곤충의 준비
<ol><li>M. sexta의원하는 애벌레 단계를 가져옵니다. 참고 : 이 연구를위한 애벌레는 5 th instar20을 통해 인공 식단에서 사육되었으며 사내 곤충에서 경험이 풍부한 개인에 의해 준비되었습니다. 유충은 또한 식물 조직에 부분적으로 또는 완전히 사육될 수 있습니다. 애벌레는 몰트 직전에 먹지 않으며 몰트 직후에 먹을 가능성이 가장 높으므로 적절한 준비는 21이 중요합니다.</li>
	<li>애벌레 크기에 따라 적절한 격납 용기(예를 들어, 6-, 12-, 24웰 조직 배양 접시)로 유충을 옮긴다. 접시에 잘 당 하나의 애벌레가 있어야합니다. 참고: 애벌레는 식량 원천없이 영토 또는 식인풍 행동을 표시 할 수 있으며 함께 보관하면 부상을 입을 수 있습니다.</li>
	<li>(선택 사항) 이 애벌레 먹이를 향상시킬 수 있습니다이 로 최대 2 시간 동안 굶주린 애벌레. 참고 : 애벌레는이 시간 동안 성장 챔버에 저장된 봉쇄 용기에 있어야합니다.</li>
</ol>3. 감염 실험을 위한 구성 요소 설정
참고: 그림1의 회로도 요약을 참조하십시오.
<ol><li>각 수확 시간 점에 대한 배치 템플릿을 만듭니다. 참고: 각 수확 시간대5개의 트레이를 설정하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 샘플을 체계적으로 정리하고 배열을 변경하지 않고도 요리를 세트로 보다 효율적으로 이동할 수 있습니다. 손상 비율 계산을 수행하는 경우 감염 전후 이미지를 동일한 초점 거리에서 캡처해야 하므로 필수적입니다.<ol>
<li>적당한 크기의 페트리 접시 6개를 들고 백지와 줄을 설 수 있는 튼튼한 트레이 5개를 구한다. 참고 : 페트리 접시의 크기는 먹이 분석에 대해 선택한 잎 크기를 기반으로합니다. 잎은 측면을 건드리지 않고 접시에 쉽게 맞아야합니다. 예를 들어, 60mm x 15mm 접시는 길이 또는 너비가 최대 50mm인 잎에 적합합니다.</li>
		<li>각 트레이의 용지에 적당히 크기의 페트리 접시를 사용하여 6개의 원을 추적합니다. 한 세트의 원을 '제어' A, B 및 C로 표시하고 다른 '감염된' A, B 및 C에 레이블을 지정합니다. 또한 각 배치 템플릿에 적절한 수확 시간을 지정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(선택 사항) '감염 전'과 '감염 후' 이미지 캡처를 위해 카메라를 설정합니다.<ol>
<li>배치 템플릿의 모든 Petri 접시의 이미지 캡처를 위해 적절한 초점 거리에서 스탠드에 카메라를 고정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수확 시간 점 튜브에 레이블을 지정합니다.<ol>
<li>배치 템플릿의 각 원에 해당하는 30, 1.7 mL 미세 원심분리튜브 세트를 라벨을 붙입니다. 튜브에 라벨을 부착하여 섭동(제어/감염), 식물 복제 문자(A, B 또는 C) 및 수확 시간(감염 후 시간 후 시간(분 수)을 적절히 식별합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.1.1단계에서 선택한 페트리 요리를 준비한다.<ol>
<li>3.1.1단계에서 30개의 페트리 접시 각각에 멸균 필터 페이퍼 디스크를 놓습니다. 디스크를 적시기 위해 멸균 수를 추가하십시오. 접시에 물을 과도하게 마시지 마십시오. 각 배치 템플릿의 6개의 원 각각에 각 접시를 놓습니다.</li>
		<li>각 배치 템플릿 옆에 감자 식물 3개 배치합니다. 식물이 모두 같은 연령과 상대적인 크기인지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 감염 수행
참고: 한 번에 하나의 수확 시간/배치 템플릿이 설정됩니다.
<ol><li>멸균 가위로 각 식물에서 크기가 일치하는 잎 두 개를 제거하고 제어 페트리 접시에 잎 한 개와 각 식물 (A, B 및 C)에 감염된 페트리 접시에 하나씩 놓습니다. 이 프로세스를 가능한 한 빨리 수행하십시오.</li>
	<li>(선택 사항) 배치 템플릿을 카메라 스탠드로 전송하여 '감염 전' 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>가능한 한 빨리 부드러운 터치 포셉을 사용하여 감염된 각 접시에 애벌레를 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 드시면 됩니다. 원하는 '감염' 시간에 대한 타이머를 설정합니다. 참고 : 애벌레가 잎 조직을 소비하는 기간은 '감염 시간'입니다. 이것은 실제 침략의 시작 의 앞에 몇몇 시험 잎/애벌레를 사용하여 경험적으로 결정될 수 있는 무언가입니다. 선택한 '감염 시간'은 감염된 모든 잎에 대해 일관성이 있어야합니다. 참고 : 애벌레는 부드러운 터치 집게에 의해주의처리되어야한다. 2~4번째 인스타는 경적 이나 중간 부에 의해 부드럽게 파악 될 수 있습니다.</li>
	<li>모든 애벌레가 먹고 있는지 확인하기 위해 먹이를 관찰. 유충은 먹이 행동에 따라 추가 / 제거해야합니다. 페트리 접시에 뚜껑을 최대한 두십시오. 참고: 잎당 여러 유충을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>감염 시간이 끝나면 잎에서 애벌레를 제거하십시오. 수확 시간에 대한 타이머를 시작합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 배치 템플릿을 카메라 스탠드로 전송하여 '침입 후' 이미지를 캡처합니다. 참고: 배치 템플릿의 6개 잎은 모두 특정 수확 시간에 수확됩니다.</li>
</ol>5. 잎 수확
<ol><li>각 잎을 각 수확 시점의 끝에 해당 표지 된 튜브로 옮기고 튜브를 액체 N2에 떨어 뜨려 즉시 동결합니다. 수확된 식물 조직을 RNA가 분리될 때까지 -80°C에서 보관한다.</li>
	<li>각 수확 시간 점에 대해 4\u20125.1 단계를 반복합니다.</li>
</ol>6. 유전자 발현 분석을 위한 잎 조직 처리
<ol><li>냉동 잎 조직을 마이크로 페슬로 분말로 갈아.</li>
	<li>앞서 설명한 바와 같이 유전자 발현을 위한 총 RNA 및 공정을분리하는 22.</li>
</ol>7. (선택 사항) 잎 손상 추정
<ol><li>리프 손상의 퍼센트를 시각적으로 추정하거나 감염 전후 이미지에서 잎 면적을 계산합니다.</li>
	<li>소프트웨어 도구(예: Phenophyte)를 사용하여 리프 영역을 측정합니다(예: Phenophyte)23.</li>
	<li>잎 면적 측정에서 손상 비율을 % 피해 = [(잎 영역 이전 – 잎 영역 이후)/잎 영역 이전] x 100.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

기존의 전체 식물 약초 방법론의 사용은이 특정 연구의 목표를 달성하기 위해 불필요합니다 (즉, 감염에 대한 반응을위한 후보 유전자세트를 스크리브). 분리 된 잎 정제의 명백한 장점은 허브 분석 을 수행하는 데 걸리는 시간을 단축하는 것입니다. 클립 케이지가있는 전체 식물의 다루기 힘든 특성이 제거되고 2 주 어린 식물이 잎을 수확하는 데 사용할 수 있기 때문에 더 빨리 수행됩니다. 또한 수유 시 훨씬 더 작은 설치 공간과 적은 성장 챔버 공간이 필요합니다. 이러한 리소스가 제한될 때 모두 중요합니다.
이 분석의 한계, 즉 분리는 방어 유전자 발현이 분석될 때 발생합니다. 분리 자체는 상처 반응을 일으키고 따라서 분리가 방어 유전자 발현의 기저 수준에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것이 중요합니다. 모의 허브를 포함 한 연구에서, 잘 알려진 방어 유전자 프로테아제 억제제 II의 성적 증명서 수준(PIN2)때문에 가능성이 분리 감자 잎의 제어 잎에서 예기치 않게 높았...

초초는 식물이 공격을 식별하고 생존을위한 적절한 반응을 탑재 할 수있는 일련의 분자 이벤트를 움직입니다. 식물은 곤충을 먹어도 두 가지 기본 단서를 받습니다. 하나는 조직에 물리적 인 손상에서 다른 하나는 곤충 특정 물질에서. 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)은 애벌레 입부분에 의해 생성된 손상에 반응하여 방출되고 호르몬 자스몬산 및 방어 유전자의 전사증가를 초래하는 잘 정의된 상처 반응을 유발한다1. 가장 잘 알려진 DAMPs 중 하나는 체계인이며, 잎이 상처입은 후 더 큰 프로젠틴단백질의 절단에 의해 형성되는 폴리펩티드는 2,3. 자스몬산 상처 반응은 애벌레 타액, 장 내 분당 (역류제) 및 대변 (frass)에서 유래 될 수있는 허브 관련 분자 패턴 (HAMPs)에 의해 더욱 변조된다. 곤충은 이러한 물질을 사용하여 방어 반응을 향상시거나 회피합니다5. 전사 인자는 다운스트림 방어 유전자 6,7,8의조절을 통해 방어 반응에서 호르몬 신호로부터 메시지를 전달한다.
실험실 설정에 사용되는 일부 식물 - 곤충 상호 작용 연구는 곤충에 의해 공급의 자연적인 방법을 근사하는 것을 목표로, 시뮬레이션 유형입니다. 모의 초본은 일반적으로 곤충 마우스 부품의 특정 메커니즘을 모방하는 다양한 도구를 사용하여 식물 조직에 인공 손상을 만들어 Damps의 방출을 유발하고 방어 유전자의 생산을 유발합니다. 경구 분비물 또는 역류제와 같은 다른 곤충 특이적 성분은종종 HAMPs 9,10,11에서기여를 복제하기 위해 첨가된다. 특정 크기와 유형의 상처를 생성하고 정확한 양의 HAMPs를 적용하면 이러한 유형의 연구에 대한 한 가지 장점이 있으며 보다 재현 가능한 결과를 제공할 수 있습니다. 식물 조직에 손상을 달성 하는 자연 초원 연구, 필드 획득 또는 실험실 사육 곤충의 응용 프로그램에 의해 달성 되는, 상처 크기와 HAMP 금액 곤충 행동에 의해 제어 되 고 에 가변성을 추가 하기 때문에 종종 더 도전 데이터. 자연 대 시뮬레이션 방법과 그 장점과 단점은 문헌12,13,14에서잘 논의된다.
전사 인자와 같은 초기 신호 이벤트를 연구하려면 잎의 일정 비율이 비교적 짧은 시간 내에 소비되어야하므로 유충은 분석을 위해 잎이 얼어 붙을 때까지 즉시 츄를 시작하고 소비를 유지해야합니다. M. sexta는 애벌레 단계의 많은 동안 여러 solanaceous 식물에 탐욕스러운 피더, 시간의 상대적으로 짧은 금액에 최대 피해를 부여에 이상적 만들기15. 이는 곤충이 잎표면(16,17)에접촉한 직후식물반응이 거의즉시 발생하기 때문에 조기 시그널링 이벤트를 연구할 때 편리하다. 일반적으로 사용되는 클립 케이지 의 봉쇄 방법은 여러 케이지가 애벌레의 제거 또는 추가를 허용하기 위해 실험 전반에 걸쳐 지속적인 조정을 필요로하기 때문에 서투른 증명한다. 잎은 또한 동시에 여러 곤충 먹이를 지원하기에 충분히 크고 강한해야합니다. 감자 식물의 이러한 유형은 먹이를 관찰하기 위해 많은 양의 공간이 필요합니다. 애벌레는 종종 잎 표면의 밑면으로 옮겨지며 먹이 관찰을 매우 어렵게 만듭니다. 이러한 실험을 수행 하기 위해 전체 식물을 사용 하 여 명확 하 게 성가신.
현재 연구는 전체 식물보다는 페트리 접시에 고립 된 분리 된 잎을 사용하여 허브를 연구하는 전체 식물 접근 방식을 간소화하고 단순화합니다. 본 연구에서 프로토콜의 적용은 M. sexta 애벌레에 의한 초식성 손상 후 감자 잎에서 초기에 유도된 C2H2 전사 인자의 군의 관찰에 제한된다.

<table><tbody><tr><td>한천 대체</td>품 <td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>G3251</td><td>제품은 Gelzan</td></tr><tr><td>밀폐 용기(6,12 또는 24웰 접시)</td><td>입니다. Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td><td>많은 다른 회사들이 이 제품을 판매</td></tr><tr><td>하고 있습니다. Manduca Eggs&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>143880</td><td>30-50개의 달걀</td></tr><tr><td>만두카 달걀&nbsp;</td><td>Great Lakes Hornworm</td><td>NA</td><td>50, 100, 250 또는 500 알</td></tr><tr><td>manduca 애벌레</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>특정 애벌레 요청 instar</td><td></td></tr><tr><td>manduca 애벌레</td> 오<td>대호 호른 벌레</td><td>특정 애벌레 요청 instar 요청</td><td>모든 instar</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 1.7 ml&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R22</td><td>이들은 액체 N2에서 테스트되었으며</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M519</td><td>번식 배지</td></tr><tr><td>영양 한천 믹스</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M5825</td><td>제품은 Murashige & 비타민, 자당, 그리고 Gelzan 종이 필터 디스크가 함유된 Skoog Basal Medium</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>09-805A</td><td>Whatman 서클-페트리 접시</td></tr><tr><td>페트리 접시에 맞게 구매, 60X15mm 또는 100X15mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB0875713A 또는 FB0875712</td> 잎 크기의 감자 덩이줄기<td>에 적합한 크기를 구입</td></tr>하십시오<tr><td>&nbsp;</td><td>B 사이즈 (유기농이 아님)</td><td>는</td> <td>메인 파머 (Maine Farmer)를 제안합니다. s 교환</td></tr><tr><td>냄비, 10"&nbsp;</td><td>그리핀 온실 용품, Inc.</td><td>41PT1000CN2</td><td></td></tr><tr><td>방부제/살생물제</td><td>Plant Cell Technology</td><td>NA</td><td>제품은 PPM(Plant Preservative Mixture)</td></tr> <tr><td>종자 감자 이식 소스용</td><td>모든</td><td>B 크기(유기농이 아님)</td><td>를 제안합니다. s 교환</td></tr><tr><td>서방성 비료 (14-14-14)</td> <td>모든</td><td>NA</td><td>Osmocote는</td></tr><tr><td>소프트 터치 집게</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>토양 믹스</td><td>그리핀 온실 용품, Inc.</td>의 인기 브랜드 이름입니다.<td>65-51121</td><td>제품은 Sunshine LC1 혼합</td></tr><tr><td>멸균 배양 용기입니다&nbsp;</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>C2100</td><td>마젠타형 용기, PTL-100</td></tr><tr><td>멸균 배양 용기&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>ICN2672206</td><td>제품은 MP Biomedicals Plantcon입니다</td></tr></tbody></table>.

분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

곤충 초본의 유전자 발현 연구의 다영양 성질은 많은 수의 생물학적 복제본을 요구하며, 더 간단하고 능률적인 허브 프로토콜에 대한 필요성을 만듭니다. 츄잉 곤충의 교란은 일반적으로 전체 식물 시스템에서 연구된다. 이 전체 유기체 전략이 대중적이지만, 유사한 관찰이 단일 분리 된 잎에서 복제 될 수 있다면 필요하지 않습니다. 가정은 신호 변환에 필요한 기본 요소가 리프 자체 내에 존재한다는 것입니다. 신호 전달에 있는 초기 사건의 경우에, 세포는 섭동으로부터 신호를 수신하고 유전자 발현을 위해 분석되는 이웃 세포에 그 신호를 전송하기 만 하면 됩니다.
제안 된 방법은 단순히 분리의 타이밍을 변경합니다. 전체 식물 실험에서, 애벌레는 결국 식물에서 분리 되고 유전자 발현을 위해 분석되는 단 하나 잎에 수감됩니다. 절제의 순서가 반전되면, 전체 식물 연구에서 마지막에서, 분리 된 연구에서 첫 번째로, 공급 실험이 단순화됩니다.
솔라눔 튜트로섬 var. 케네벡은 간단한 조직 배양 배지에서 절달 전달에 의해 전파되고 원하는 경우 추가 성장을 위해 토양으로 옮겨질 수 있다. 잎은 모 공장에서 절제되어 페트리 접시로 옮겨져 먹이 분석이 M. sexta의애벌레 단계로 수행됩니다. 손상된 잎 조직은 신호 환전에서 비교적 초기 사건의 발현을 위해 분석된다. 유전자 발현 분석은 감염 특이적 Cys2-His2(C2H2) 전사 인자를 확인하, 초기 반응 연구에서 분리된 잎을 사용하는 성공을 확인하였다. 이 방법은 전체 식물 감염보다 수행하기 쉽고 적은 공간을 사용합니다.

리프 소비는 프로토콜의 성공을 정의합니다. 건강하고 정확하게 준비된 유충은 잎 표면에 배치 한 직후에 먹이를 시작해야하며 수유는 감염 시간 내내 상당히 일관된 방식으로 계속되어야합니다. 비디오1에서, 상단의 애벌레는 배치 직후에 먹기 시작하고 먹이를 주는 동안 일관된 속도를 유지한다. 이것은 감염 후에 초기 유전자 발현 사건을 계산하는 경우에 특히 중요합니다. 하단의 유충은 잎 물질을 소비하지 않았으며 실패한 감염의 예입니다.
잎 소비 중 시각적 근사치를 모니터링하여 충분한 손상이 발생하도록 합니다. 소비된 잎 재료의 양은 감염 전후의 나뭇잎 이미지를 사용하여 손상의 백분율로 계산할 수 있습니다. 도 2는 상이한 유형의 감자 식물에 대한 M. sexta 유충의 상이...

제시 된 방법은 감자의 분리 된 잎에 만두카 sexta 애벌레의 응용 프로그램을 통해 자연 초식 동물 손상된 식물 조직을 만듭니다. 식물 조직은 곤충 허브에 대한 초기 반응에 관여하는 6개의 전사 인자 호몰로그의 발현을 위해 분석된다.

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

이 프로토콜은 곤충 약초보에 반응하여 식물 유전자 발현을 측정하기 위한 간소화된 접근법을 사용합니다. 페트리 접시에서 분리된 분리된 잎을 사용하여, 곤충은 상대적으로 짧은 기간 동안 감염이 재발할 수 있는 유전자 발현 데이터에 기여하는 동안 쉽게 적용하고 모니터링할 수 있다. 이 프로토콜은 많은 식물/곤충 상호 작용에 적응될 수 있다.전체 플랜트 시스템의 기준 관측이 고려되는 경우. 곤충 먹이의 예측할 수없는 특성은 어려울 수 있습니다. 따라서 제대로 준비된 애벌레와 건강한 식물을 신뢰할 수 있는 공급은 성공의 가장 좋은 기회를 제공합니다.건강한 식물과 곤충이 어떻게 나타나고 행동해야 하는지 시각화하는 것은 특히 연구 분야의 새로운 연구자에게 최적의 결과를 달성하는 데 도움이 됩니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 과일과 채소 실험실의 유전자 개선에 있는 분자 생물학자 프랜시스 페레즈가 될 것입니다. 노드 전파 조직 배양 감자 식물을 준비하려면 먼저 3 ~ 4 개의 노드가있는 절제 물질에서 재배 된 Kennebec plantlets를 얻습니다.멸균 블레이드를 사용하여 나뭇가지를 주 줄기 에 가깝게 자르고 잎 당 약 2 밀리미터의 가지 조직을 남겨 둡니다. 각 노드 위와 아래약 2밀리미터를 잘라 줄기에서 절개를 제거하고 분지와 함께 절달 전달 배지를 포함하는 멸균 조직 배양 용기에 노달 절단을 배치합니다. 그런 다음 24섭씨24도에서 2~3주 동안 식물 조직 배양실로 노달 절단을 옮기고 16시간 의 빛, 8시간 어두운 사진 기간을 옮는다.먹이를 위해 곤충을 준비하려면, M.sexta의 원하는 애벌레 단계를 얻고 애벌레의 크기에 따라 적절한 봉쇄 용기의 각 우물에 하나의 애벌레를 전송합니다. 흰색 종이줄 지어 여섯 적절하게 크기의 페트리 접시 세트를 개최 할 수있는 다섯 튼튼한 트레이를 사용하여 각 수확 시간 지점에 대한 배치 템플릿을 확인합니다. 각 트레이의 용지에 적당히 크기의 Petri 접시를 사용하여 6개의 원 세트를 추적하고 한 세트의 원 컨트롤 A, B 및 C와 감염된 A, B 및 C.에 레이블을 지정한 다음 각 배치 템플릿에 적절한 수확 시간을 표시합니다.다음으로, 배치 템플릿의 각 원에 대해 1.7 밀리리터 미세센심분리기 튜브를 라벨로 지정하여 변투, 식물 복제 편지 및 수확 시점을 적절하게 식별합니다. 모든 튜브가 라벨이 붙었을 때 멸균 필터 종이 디스크를 템플릿 당 하나의 페트리 접시에 넣고 각 접시에 과도한 액체 풀을 두지 않고 멸균물로 디스크를 적시십시오. 그런 다음 각 배치 템플릿의 각 원에 하나의 접시를 놓고 각 배치 템플릿 옆에 같은 연령과 상대 크기의 감자 식물 세 개를 놓습니다.감염을 시작하려면 멸균 가위를 사용하여 각 식물의 상위 2 가지 크기의 일치하는 잎을 제거하고 제어 페트리 접시에 잎 한 개와 각 식물의 감염 된 페트리 접시에 한 잎을 가능한 한 빨리 놓습니다. 모든 잎을 배치한 경우 소프트 터치 포셉을 사용하여 적어도 하나의 애벌레를 각 감염 된 접시에 가능한 한 빨리 옮기고 원하는 감염 시간에 대한 타이머를 설정합니다. 모든 애벌레가 먹고 있는지 확인하기 위해 먹이를 관찰하여 필요에 따라 먹이지 않는 애벌레를 대체하십시오.감염 시간의 끝에 있는 모든 잎에서 애벌레를 모두 제거하고 수확 타이머를 시작합니다. 각 수확 시점의 끝에서, 각 잎을 해당 튜브로 옮기고 즉시 튜브를 액체 질소로 떨어뜨려 RNA 가 절연될 때까지 영하 80도에서 저장하기 전에 잎 샘플을 동결한다. 건강 정확하게 준비 된 애벌레는 잎 표면에 배치 한 직후 공급을 시작해야하며, 공급은 감염 기간 동안 상당히 일관된 방식으로 계속해야합니다.이 잎의 바닥에있는 애벌레는 식물 물질을 소비하지 않았으며 감염에 실패한 예입니다. 이 잎은 2 주 된 nodal 전파 조직 배양 식물에서 분리 하 고 각 애벌레 단계에 대 한 다른 속도 및 먹이 스타일에 소비. 이러한 결과에 기초하여, 네 번째 인스타 애벌레는 더 밀접하게 식물 성장 감자 식물을 더 성숙한 토양 재배 감자 식물잎에 대한 손상을 평가하기 위해 선택되었다.이러한 유전자 발현 연구에서, M.sexta herbivory에 강력하게 반응하는 2개의 새로운 C2H2 아연 손가락 전사 인자는 감염 성 소사를 위한 분리된 잎의 사용을 지원하는 것으로 확인되었습니다. 나이와 크기일치 잎을 사용하고 균일성이 더 재현 가능한 데이터를 초래하기 때문에 각 실험에 대한 애벌레를 올바르게 무대에 올리는 것을 기억하십시오. 잎 조직은 스트레스 유도 반응성 산소 종 과 자스몬산 호르몬 유도체에 대해 분석 될 수있다.전체 전사, 프로테오메 또는 미생물군유전체 연구는 잎 조직에서도 수행될 수 있다.

detached-leaf-assays-to-simplify-gene-expression-studies-potato

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

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식물 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과자를 선별하기 위한 공동 침윤 분석법

출처: 루피안, J. S. 외 식물 조직 내 슈도모나스 시링기 유전자 발현의 단세포 분석. J. Vis. 경험 (2022).이 영상은 형광 표지 전사 인자를 사용하여 식물 추출 병원성 박테리아의 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 분석하는 방법을 시연합니다. 공초점 영상은 병원성 유전자 발현의 이질성을 드러내어 클론 박테리아 집단 내의 기능적 다양성을 강조합니다.

식물 추출 병원체에서 유전자 발현의 단세포 분석

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

발달적으로 중요한 많은 유전자는 세포 또는 조직 특이적 발현 패턴을 가지고 있습니다. 본 논문은 야생형과 비교하여 옥수수잎-칼집 경계와 lg1-R 돌연변이에서 다르게 발현되는 유전자를 확인하기 위한 LM RNA-seq 실험에 대해 설명합니다. 여기에서 논의된 실험적 고려 사항은 다른 발달 현상의 전사체 분석에 적용됩니다.

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

이 프로토콜은 생체 내 온실 조건에서 Solanum tuberosum 뿌리를 식물 기생 선충과 감염시키고 광학 현미경을 통한 뿌리 구조의 조직화학적 분석을 위해 감자 체외 형질전환 뿌리를 감염시키는 것을 설명합니다.

유도된 구조적 변화의 평가를 위한 식물 기생 선충을 사용한 감자 뿌리의 생체 내 및 체외 감염

이 프로토콜은 동일 시료 내에서 식물 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 평가하는 고처리량 접근법을 설명합니다.

고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

배우세요 분리된 감자 잎을 이용한 Manduca sexta 곤충 먹이 공격에 대한 식물 유전자 발현 분석 방법을. 이 기법은 전사인자 동원체 발현을 측정하여 곤충-식물 상호작용 연구의 재현성을 높입니다.

분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해

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