Name: 직접 분사 Lentiviral 벡터의 하이라이트 쥐 척수에서 여러 모터 통로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 학습하세요 쥐 척수에 직접 분사한 Lentiviral 벡터를 이용한 여러 모터 통로 추적 방법입니다. 정확한 척추 표적화와 GFP 발현 확인으로 신경 회로 연구 및 유전자 치료에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 R01 R01NS103481에서 교부 금에 의해 투자 되었다 고 소아과 연구에 대 한 슈 라 이너 스 병원 SHC 84051와 SHC 86000 국방부 (SC140089)를 부여 합니다.

다음 수술 및 동물 치료 절차의 모든 동물 관리 및 사용 위원회의 사원 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 미리 수술 준비
<ol><li>가져온된 유리 바늘 바이러스 주입 3.5 nanoliter 유리 모 세관 펫 nanoliter 인젝터에 대 한 설계를 사용 하 여 수술 전에 몇 일을 위한 준비. 두 바늘 템플릿을 만들 제조업체의 지침에 따라 2 단계 바늘 끌어당기는 사람에 각 피 펫을 당겨.</li>
	<li>Microscissors 초과 유리의 약 1-2 m m 절단 하 여 바늘의 팁을 구체화 합니다. 30 ~ 40 µ m 가늠 구멍으로 바늘을 현미경 교정 슬라이드 현미경 측정 대략 조리개 크기입니다.</li>
	<li>30 °에 위치 하는 바늘 micropipette beveller 30-40 µ m 조리개와 45 ° 경사진된 각도 팁을 만드는 데 사용 합니다. 교정 슬라이드에 버 니 어 규모와 조리개 너비를 확인 합니다. 물과 에탄올 파편을 멀리 세척 하 고 정기적으로 블랙 마커는 바늘 표시를 유연한 바늘 첨부와 주사기를 사용 하 여 유리 바늘을 통해 전달 합니다.</li>
	<li>이전에 70% 에탄올으로 청소 대상된 페 트리 접시에 바늘을 놓고 자외선 아래 Biosafety 두건에서 30 분 동안 소독 합니다.</li>
	<li>HiRet lentivirus 절차 직전 냉장고에서 적당 한 볼륨을 제거 하 여 준비 합니다. 참고: 적합 한 볼륨 포함 사출에 필요한 금액 (1 µ L 당 주입 주사의 수 x) 작은 양의 여분의 볼륨 pipetting 및 로드 하는 손실에 대 한 계정에 플러스. 전송 하 고 사용에 얼음에 바이러스를 저장 합니다.</li>
	<li>버 니 어 가늠 micromanipulator에 그것을 배치 하는 micropump에 그것을 연결 해 인젝터를 준비 합니다.</li>
	<li>유리 바늘 준비, 신중 하 게 주사기와 레드 오일 등 착 색된 염료를 로드 하는 유연한 바늘으로 복. 아니 거품 바늘에 남아 확인 하십시오. 바늘, 처리할 때 무 균 기술을 사용 하 여을 팁 감동 자제 합니다.</li>
	<li>인젝터, 바늘 세탁기에 올바르게 장착 되어, 인젝터 모자에 꽉, 끝장 이다 고 철강 인젝터 바늘 확장에 유리 바늘 삽입 약 ¾ 유리 바늘의 길이. 바이러스는 이후 단계에서 바늘에 로드 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 마 취와 수술 사이트 준비
<ol><li>디지털 스케일에 동물을 무게. 필요한 마 취의 볼륨을 결정 하 고 수술 후 체중의 모니터링을 위한 수술 체중을 기록 합니다. 여성 Sprague-Dawley 쥐 약 200-250 g이이 프로토콜에 사용 되었다.</li>
	<li>쥐 isoflurane 흡입 또는 주사 마 취 제/xylazine 솔루션 중 하나를 사용 하 여 anesthetize (k / x). 여기, 케 타 민 intraperitoneally 67 mg/kg 및 6.7 mg/kg의 복용량에 xylazine에 주입 됩니다.</li>
	<li>단단히 발을 곤란 하 게 하 여 적절 한 마 취 비행기를 확인 합니다. 재귀 철수 경우 진행 하기 전에 몇 가지 추가 분을 기다립니다. 참고: 또한 수염, 눈 및 의식의 표시 호흡 속도 관찰 합니다. 수염은 꿈 틀, 눈 깜박임, 부드럽게 만질 때 또는 빠르고 얕은 호흡은, 경우 마 취 비행기 깊은 프로토콜 진행 하는 때까지 기다립니다. 또한 laminectomy 주입 수술을 통해 이러한 징후를 모니터링 합니다. 동물 마 취 얕은 평면 표시, 관리 케 타 민 전용 평등의 부스터 샷 ½에 원래 k / 복용량 x.</li>
	<li>쉐이브는 견의 열 등 한 각도를 엉덩이에서 등 쪽 midline 따라 쥐. 쉽고 더 정확 하 게 면도 긴장 된 동물의 피부를 당겨.</li>
	<li>두 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>살 균 소독 사이트 면도 영역에 적용 됩니다. 첫 번째 스크럽 모든 머리카락과 파편 5% 요오드 솔루션 및 지우기 멀리 멸 균 거 즈를 담가. 이 단방향 슬쩍 70% 에탄올에 배어 무 균 거 즈와 그렇게 따릅니다 아무 영역에 두 번 연결. 이 같은 기술을 사용 하 여 교류 요오드와 에탄올에 젖은 거 즈를 두 번 더.</li>
</ol>3. 수술 필드 및 악기 준비
<ol><li>압력가 마로 소독 외과 도구 살 균 필드를 만드는 살 균 포장 풀기으로 메스, rongeurs, 쥐 이빨 집게, 봄이 위, hemostats, 중간 지점 곡선 겸 자 및 견인 기 또는 가중치 후크를 포함 하는 세트를 준비 합니다.</li>
	<li>메 마른 외과 장갑의 패키지를 열고 메 마른 장갑 랩 테이블에 배치 합니다. 무 균 포장의 오염을 방지 하기 위해 사용 되는 도구에 대 한 추가적인 살 균 필드로 사용 합니다.</li>
	<li>살 균 필드에 #10 메스 블레이드를 놓습니다. Hemostats와 핸들에 블레이드를 보호 합니다. 위치 멸 균 식 염 수, 4.0 크롬 다 봉합 및 재료 제어는 cauterizer, 멸 균 거 즈, (근육 출혈)에 대 한 살 균 면 밀고 도포 또는 접근 가능한 장소 (뼈 물림)에 대 한 bonewax gelfoam 등 출혈.</li>
	<li>동물을 검색 하 고 메 마른 헝겊에 그것을 설정 합니다. 소변 수집 하 방광 아래 거 즈를 놓습니다. 복 부 아래 압 연된 수건으로 대상 영역을 버팀대. 사용 가능한 경우 특히 더 절차에 대 한 살 균 옷감 밑 수술 난방 패드를 놓습니다. 참고: 무 균 생존 수술 시 중요 하다입니다. 또는 개별 수술 장갑 낀된 손, 그리고 사용 구슬 균 악기 불 임이 손상 된 경우의 불 임을 유지 하기 위해 손에서 70% 에탄올 스프레이 병을 유지 합니다.</li>
</ol>4. 척추 열 노출과 laminectomy 사이트 식별
<ol><li>L1 척추를 찾으려고 피부 절 개를 마지막 갈비뼈에서 손가락을 부드럽게 눌러 만들 수는 있는 영역을 식별 합니다. 랜드마크로 이것을 사용 하 여 만들 3-4 cm 피부 절 개를 끝 #10 수술 메스 그냥 열 등 근육을 노출 하는 L1. 부드러운 확산에 의해 피부를 긴장 늦추지 잡고 누르고 단단히 메스 블레이드와 깨끗 한 절 개를 보장 하기 위해.</li>
	<li>잘라내어 집게와가 위 필요한 경우 표면 지방 확산. (대상 척추에 따라 거기 수 있습니다 또는 큰 지방 패드가 근육을 표면 수 없습니다).</li>
	<li>메스 블레이드 또는 손가락의 평면 spinous 프로세스에 대 한 느낌. 종종 중간 지역 어느 한쪽에 백색 근 막의 "V"에 의해 설명 될 것입니다. 쥐 이빨 집게, 상위 프로세스에 안전 하 게 잡아 다음 가능한 프로세스에 가까운 2 긴, 깊은 상처를 확인 하 실 수 있도록 작은 rostral 상처를 확인 하십시오. 컷의 깊은 지점에는 척추의 등 쪽 표면 메스 블레이드와 함께 느낄 수 있습니다.</li>
	<li>브래킷으로와 가시성을 개선 하기 위해 가중치 걸 제쳐두고 옆 근육을 잡아. 메스, 봄이 위 또는 그들의 머리의 모양을 결정 하 rongeurs 프로세스 주위 명확한 근육. 주: 척수 척수 조직 중지 이전 개발 뼈 보다 성장으로 척추 칼럼의 전체 길이 연장 하지 않습니다 기억 하십시오. 즉, 대상 척추 수준 다르게 명명 된 척추 아래 있을 수 있습니다.</li>
	<li>T11 및 인접 T12, T13 프로세스를 찾습니다. 참고: 올바른 척추 레벨을 대상으로 지원 쥐 척수 아틀라스와 매우 비슷한이 마우스에서 개요 이전 연구에서 찾을 수 있습니다 척추 구조6,33. T9 같은 rostral spinous 프로세스 중간 랜드마크 줄 그대로 둡니다.</li>
</ol>5. 한 laminectomy 수행
<ol><li>대상 영역 올바르게 식별 되 면 laminectomies T11 T13의 등 쪽 측면의 수행 합니다. 부드럽게 척추 척추 인 대, 뼈의 초기 물린 rongeurs 삽입 하 좋은 사이트는 공개를 확산. 정밀한 제어를 증가 하는 반 폐쇄 위치는 rongeurs 잡으십시오.</li>
	<li>rongeurs와 작은 물린 취하여 spinous 프로세스와 척추의 등 쪽 부분을 제거 합니다. 수 척수 손상 또는 경질을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 약간 풀 수 있도록 쥐 이빨 집게와 척추에서 척수 들어올린 척수 조직을 공격 하는 경향이 감소.</li>
	<li>선택을 취소 뼈 멀리는 중간에서 중간 혈관 관찰 될 수 있도록 합니다. 명확 하 게 표시 척수 조직 하 고는 무료로 파편 창 남겨 주세요.</li>
	<li>집게와 척수를 부드럽게 터치 합니다. 그들의 마 취 비행기 깊은 경우에 일부 동물 뛰어 유연 수 있습니다. Lidocaine 같은 마비 에이전트의 몇 방울 주입 절차 동안 점프 방지 하기 위해 척수에 직접 적용 됩니다.</li>
	<li>Spinous 프로세스 rostral와 laminectomy 창 꼬리에 고정 집게를 고정 하 여 척추 홀더에 동물을 확보. 움직임을 호흡의 효과 부정 하는 척추 홀더를 사용 하 여 동물의 복 부를 올립니다. 이 바늘 안정성을 증가 하 고 주입의 적절 한 깊이 보장.</li>
</ol>6. 바이러스 로딩과 인젝터 위치
<ol><li>Parafilm의 조각에 약 5 µ L를 pipetting는 팁 드롭 안에 바늘을 위치 하는 인젝터에 바이러스를 로드 합니다.</li>
	<li>20-100 nL/s의 속도에서 바이러스의 최대 4 µ L를 철회 하는 micropump를 사용 합니다.</li>
	<li>주사 바늘의 팁이 차단 되지 않습니다 보장 하기 위해 바늘에서 바이러스의 작은 금액을 출시 하는 컨트롤러를 설정 합니다. 실험실 지우기와 초과 바이러스를 닦아내십시오. 참고: 강철 바늘으로 해밀턴 주사기는 가져온된 유리 펫을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>버 니 어 눈금 표시 되도록는 micromanipulator를 놓고 바늘 척수의 중간에 위치 합니다. 참고: 중간 선 때로는 척수의 앞쪽 표면에서 실행 하는 큰 혈관에 의해 찾을 수 있습니다. 그러나,이 개별 쥐, 다를 수 있습니다 그리고 중간 대상으로 비교해보면 그대로 spinous 프로세스를 확인 해야 합니다.</li>
	<li>0.8 m m는 micromanipulator에 버 니 어 규모를 사용 하 여 옆으로 바늘을 직접.</li>
	<li>들여쓰기, 하지만 하지 puncturing, 경질까지 척수에 바늘을 낮춥니다. 그것은 1.5 m m의 깊이에 침 몰 될 때까지 경질 바늘 찔린 빠른 트위스트 동작을 사용 합니다.</li>
</ol>7. 척수에 바이러스를 주입
<ol><li>일단 바늘 장소에 프로그램 400 nL/분 확인 그 바이러스의 속도로 주입 하는 인젝터가 염료의 진행을 관찰 하 여 척수를 입력. 분명 한 누설 또는 척수 조직의 돌출 되어야 한다. 누설, 관찰 하는 경우이 때로는 200 nL/분 사출 속도 감소 시켜 해소 수 있습니다.</li>
	<li>주입이 완료 되 면, 허용 2-5 분 (에 따라 볼륨 주입) 척수에 바늘은 바이러스의 확산을 촉진 하기 위하여.</li>
	<li>천천히 바늘을 철회 하 고 주입 사이트로 이동 합니다. 각 6 개의 사이트 약 1 m m L1-L4 척추 조직의 길이 따라 간격으로 바이러스의 1 µ L를 주사. 동일한 바늘으로 제대로 작동 하 고 각 주입에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>8. 상처 폐쇄 및 수술 후 관리
<ol><li>척추 홀더에서 동물을 제거 하 고 견인 기 또는 측면 근육을 확산 하는 데 사용 하는 걸 꺼내. 닫기 전에 모든 파편의 분명히 상처 인지 확인 합니다.</li>
	<li>4.0 크롬 다 봉합 사를 사용 하 여 근육 봉합 봉합 스레드 내부 피부 자극의 가능성을 줄이기 위해 매듭에 가까이 잘라.</li>
	<li>피부 상처 9 mm 클립을 사용 하 여 닫을 주식. 있도록 최적의 치유, 스테이플링 전에 피부의 가장자리를 라인.</li>
	<li>패드와 모니터까지 반쯤 온난화 물 대류에 동물을 놓습니다.</li>
	<li>유체와 감염을 방지 하기 위해 cefazolin와 같은 항생제를 피하 메 마른 염 분의 5-10 mL를 주사. 동물 때 외래, 가정 그것의 감 금에 다시 배치 하 고 초기 진통제를 제공 합니다.  고통을 고 통과의 어떤 표시 든 지에 대 한 쥐를 모니터링 하 고 통증의 완화에 대 한 당신의 IACUC 승인 절차에 따라 치료.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

두뇌 및 척수에 있는 신경 세포의 유전자 조작 하이라이트 감각, 모터 및 자율 경로 부상27,28, 후 신경 책자의 재 성장 잠재력을 탐구 하 고 형광 추적 통해 역임 했다 29 , 30 , 31 , 32 , 33. 직접 척수에 주입 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 성 벡터의 중앙 신경 조직에이 방법을 매핑 경로 대 한 탁월한 선택을 만들고 그들의 시 냅 스 연결을 통해 신경 인구를 타겟팅 할 수 있습니다. HiRet 벡터는 특별히 보여준다 선택적인 통풍 관 신경 시 냅 스<sup class="xref...

바이러스 성 벡터는 결함 유전자, upregulate 중요 한 성장 단백질에 대 한 보상 또는 제조 마커 단백질 구조와 시 냅 스의 연결을 강조 하는 세포로 유전 물질을 발생 시킬 수 있는 중요 한 생물 학적 도구 그들의 목표입니다. 이 문서는 형광 추적 주요 모터 통로 강조 하기 위해 고효율 retrogradely 이동식 lentiviral 벡터의 쥐 척수에 직접 주입에 집중 한다.  이 방법은 매우 적절 한 뉴런의 다양 한 인구에 관심사의 단백질을 소개 axonal 재생 및 regrowth 연구 이며 또한 신경 기능 매핑 연구1,2에 대 한 침묵 하는 데 사용 되었습니다.
대부분의 척추 모터 통로의 해 부 세부 BDA 등 불 화-골드3,,45,,67 클래식 추적기와 직접 주입 연구를 통해 해명 했다 , 8. 이러한 추적기 금 간주 됩니다 하지만 손상 된 축 삭에 의해 통풍 관 등 특정 단점이 있을 수 있습니다 또는 백색 질 주사를 주변에 통과에 축 삭 사이트9,10,11 . 이 통로 연결의 잘못 된 해석으로 이어질 수 있는 고 어디 손상 되거나 절단 축 삭으로 염료 흡수 나중 분석12동안 섬유 재생에 대 한 오해 수 재생 연구에 단점이 될 수 있습니다.
그들은 신경 인구13,14,15,,1617,18에에서 안정적이 고 장기적인 식 제공 lentiviral 벡터는 유전자 치료 연구에서 인기 ,19. 그러나, 전통적으로 포장된 lentiviral 벡터 역행 전송 제한 수 및 실행할 수 있는 면역 체계가 반응을 사용 하는 경우4,,2021 vivo에서. HiRet 되 나 매우 효율적인 역행 전송 벡터 역행 전송22,23향상 하이브리드 벡터 만들려고 광견병 바이러스 당단백질으로 바이러스 성 봉투를 수정 하 여 카토 외에 의해 제작 되었습니다.
퇴행 성 추적 해당 셀의 축 삭에 의해 촬영 하 고 세포 체에 수송을 대상 신경의 시 냅 스 공간으로 벡터를 소개 합니다. HiRet의 성공적인 전송 모터 뉴런22에 근육 및 쥐 및 대주교23,24 의 두뇌에 신경 시 냅 스에서 입증 되었습니다. 이 프로토콜에서는 특별히 propriospinal 수 및 brainstem 신경 세포의 시 냅 스 터미널을 대상으로 요 추 척수에 주입을 보여 줍니다. PNs는 많은 다른 척추 경로에서 연결을 수신 하 고 따라서 척수 및 brainstem에 있는 신경 세포의 다양 한 인구를 대상으로 이용 될 수 있다. 이 연구에서 레이블이 신경 회로 innervating hindlimb 모터 기능에 관련 된 모터 신경 풀을 나타냅니다. 강력한 라벨 척수 및 brainstem, 포함 고 충실도 수지상 아 버 및 축 삭 맨끝에서 볼 수 있다. 우리 또한 경부 척수 내에서 이전 연구에서 propriospinal 및 brainstem reticulospinal 통로25를이 방법을 사용 했습니다.
이 프로토콜에는 바이러스 성 벡터는 쥐의 요 추 척수에 주입 방법을 보여 줍니다. 영화 1 에서 보듯이 절 개 마지막 갈비뼈에 있는 L1 척추 식별 대상 이다. L1-L4 척수를 통해 근육을 노출 하는 3-4 cm 절 개에 대 한 꼬리 랜드마크로 사용 됩니다. T11-T13 척추의 등 쪽 측면의 laminectomies 수행 되 고 beveled 유리 바늘 0.8 m m 중간 인하 1.5 m m에서 측면 이동은 바이러스 삽입 회색 문제에 깊은.

<table><tbody><tr><td>#10 메스 블레이드</td><td>Roboz</td><td>RS-9801-10</td><td>메스와 함께 사용합니다.</td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>마취제 IP 주사, 잠재적 마취 부스터 샷 및 항생제 주사용.</td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309604</td><td>수술 후 동물에 식염수를 주입합니다.</td></tr><tr><td>4.0 크롬 캣거트 봉합사</td><td>DemeTECH</td><td>NN374-16</td><td>닫는 동안 근육을 다시 바인딩합니다.</td></tr><tr><td>48000 마이크로피펫 베벨러</td><td>세계 정밀 기기</td><td>32416</td><td>인발유리 모세관 끝을 베벨링하여 기능성 유리 바늘을 형성하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>5% 요오드 용액</td><td>Purdue Products LP</td><td>L01020-08</td><td>수술 부위의 멸균에 사용합니다.</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>해당</td><td>없음 N/A</td><td>새로 준비된 유리 바늘, 수술 준비 중 동물 모델, 수술 중 외과 의사의 손 및 기타 모든 경미한 무균 유지의 살균을 위해.</td></tr><tr><td>마취제 (케타민 / 자일라진 용액)</td><td>Zoetis</td><td>240048</td><td>수술 중 동물을 올바른 의식 상태에 유지합니다.</td></tr><tr><td>항생제 (세파 졸린)</td> <td>West-Ward Pharmaceuticals</td><td>NPC 0143-9924-90</td><td>수술 후 감염 예방을 위해 피하 주사합니다.</td></tr><tr><td>비드 살균기</td><td>CellPoint</td><td>5-1450</td><td>수술 기구를 가열 살균합니다.</td></tr><tr><td>Bonewax</td><td>Fine Science Tools</td><td>19009-00</td><td>뼈 출혈의 경우 뼈를 밀봉합니다.</td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td>과도한 출혈을 방지하기 위해 수술 중 절단된 동맥이나 정맥을 밀봉합니다.</td></tr><tr><td>디지털 저울</td><td>Okaus</td><td>REV.005</td><td>수술 준비 중 동물의 무게를 잰다.</td></tr><tr><td>유연한 바늘 부착</td><td>세계 정밀 기기</td><td>MF34G-5</td><td>유리 바늘을 청소하고 유리 바늘에 붉은 기름을 넣습니다.</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pfizer</td><td>H68079</td><td>뼈 출혈의 경우 뼈를 밀봉합니다.</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>풀드 유리 바늘의 경우 - 나노 리터 인젝터 용으로 설계되어야합니다.</td></tr><tr><td>이발기</td><td>Oster</td><td>111038-060-000</td><td>수술 부위의 모발을 청소합니다.</td></tr><tr><td>지혈제</td><td>Roboz</td><td>RS-7231</td><td>수술에서 일반적으로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>수술에서 일반적으로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>중간 포인트 곡선 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td>수술에서 일반적으로 사용합니다.</td></tr><tr><td>버니어 스케일이 있는 마이크로 매니퓰레이터</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td>수술 중 정확한 표적화용.</td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>갓 뽑은 유리 모세관 튜브에서 유리를 절단하기 위해.</td></tr><tr><td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>N/A</td><td>기능성 유리 바늘로 당겨진 유리 모세관 튜브의 베벨링을 시각화하고 측정하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>MicroSyringe Pump Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>62403</td><td>주입 속도를 제어합니다.</td></tr><tr><td>Nanoliter 2000 펌프 헤드 인젝터</td><td>World Precision Instruments</td><td>500150</td><td>통제 된 방식으로 바이러스를로드하고 주입합니다.</td></tr><tr><td>니들 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>유리 모세관 튜브를 가열하고 분리하여 유리 바늘을 형성합니다.</td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Dechra 수의학 제품</td><td>RAC 0119</td><td>수술 중 동물의 눈을 보호합니다.</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>베미스</td><td>PM-996</td><td>나노인젝터에 바이러스를 로딩하는 데 도움을 줍니다.</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘 (25G x 5/8)</td> <td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>동물 모델을 주입 할 수 있도록 1mL 및 10mL 주사기와 함께 사용합니다.</td></tr><tr><td>쥐 이빨 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5152</td><td>가시 돌기를 잡는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>레드 오일</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>주입 중 조직에 들어가는 바이러스의 시각화를 위한 전면을 제공합니다.</td></tr><tr><td>견인기</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>수술 상처를 엽니다.</td></tr><tr><td>Rimadyl Tablets</td><td>Bio Serv</td><td>MP275-050</td><td>수술 후 통증 관리용.</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Roboz</td><td>RS-8300</td><td>수술 중 척추에서 근육을 제거합니다.</td></tr><tr><td>메스 블레이드 핸들</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>수술 중 동물 모델의 피부와 지방 패드를 잘라냅니다.</td></tr><tr><td>가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>수술에서 일반적으로 사용합니다.</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 상처 클립</td><td>CellPoint</td><td>201-1000</td><td>봉합 시 수술 상처의 피부를 묶습니다.</td></tr><tr><td>스테이플 제거 집게</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750347</td><td>스테이플을 잘못 적용한 경우 제거합니다.</td></tr><tr><td>멸균 천</td><td>Phoenix Research Products</td><td>BP-989</td><td>수술을 위한 멸균 표면을 제공합니다.</td></tr><tr><td>멸균 솜 팁 애플리케이터</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>무균 상태를 유지하면서 수술 상처의 혈액을 흡수합니다.</td></tr><tr><td>멸균 거즈</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>무균 상태를 유지하면서 수술 부위와 수술 도구를 청소합니다.</td></tr><tr><td>멸균 식염수</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>281324</td><td>혈액 정화 및 수술 후 수액 교체에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>수술 장갑</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>수술 중 멸균 영역을 유지하기 위해 외과 의사가 사용합니다.</td></tr><tr><td>수술용 발열 패드</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>수술 중 동물모델의 체온을 유지하기 위한 것입니다.</td></tr><tr><td>수술용 현미경</td><td>N/A</td><td>해당 없음</td><td>수술 상처의 시각화를 향상시킵니다.</td></tr><tr><td>외과용 스테이플러</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750546</td><td>스테이플을 적용합니다.</td></tr><tr><td>T / 펌프 열 요법 워터 펌프</td><td>Gaymar</td><td>TP500C</td><td>물 대류 온난화 패드에 따뜻한 물을 펌핑합니다.</td></tr><tr><td>물 대류 온난화 패드</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>L1K018</td><td>의식을 잃은 동물의 체온을 유지하기 위해 수술 후 회복 영역에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>가중 후크</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>수술 상처를 엽니다.</td></tr></tbody></table>

직접 분사 lentiviral 벡터의 하이라이트 쥐 척수에서 여러 모터 통로

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

신 경계에 있는 세포에 관심사의 단백질을 도입 하는 것은 대부분 분자에 대 한 액세스를 제한 하는 타고 난 생물학적 장벽 때문 도전적 이다. 척수 조직에 직접 주입 셀 시체에 대 한 액세스를 제공 하는 이러한 장벽을 무시 하거나 synapses 분자를 포함 될 수 있습니다. 이 방법으로 바이러스 성 벡터 기술 결합 유전자 치료 또는 요로 추적을 위해 신경 조직으로 대상 유전자의 도입에 대 한 수 있습니다. 여기 바이러스 고효율 역행 전송 (HiRet)에 대 한 설계는 propriospinal 수 (PNs) 척수 및 brainstem 핵 뉴런에 특정 전송 격려의 시 냅 스에서 소개 된다. PNs를 대상으로 rubrospinal 및 reticulospinal 책자 뿐만 아니라 척추 세그먼트에 걸쳐 서로 그들의 상호 모터 통로에서 받은 수많은 연결의 활용. HiRet 벡터를 사용 하 여 constitutively 활성 녹색 형광 단백질 (GFP) 쇼 고화질 세부 셀 시체, 축 삭 및 수지상 버는 흉부 PNs와 pontine reticular 형성에 reticulospinal 신경의 대표적인 추적 HiRet은 brainstem 경로 및 PNs에 잘 통합 하지만 corticospinal 지역 신경으로 나이 종속 통합을 보여줍니다. 요약 하자면, 척수 주입 바이러스 성 벡터를 사용 하 여 대상된 책자의 뉴런으로 관심사의 단백질의 도입에 대 한 적합 한 방법입니다.

성공적인 주입 및 전송 바이러스 성 벡터의 일방적인 신경 척수 및 brainstem 핵 특정의 강력한 인구의 변환 될 합니다. 그림 1 에서는 신경 세포와 axons 흉부 척수 및 brainstem에서 4 주 후 주입의 pontine reticular 형성의 틀에 박힌 라벨을 보여 줍니다. 상당한 GFP 식 주입 (그림 1A, 박스형된 지역)에 동측 측에 흉부 척수의 회색 문제에 신경 세포에서 볼 수 있다. 몇 가지 신경 contralateral 측면, 특히 정중 선 근처에 관찰 된다. 백색 질에서 GFP 식 관찰 됩니다 (그림 1A, 화살표 및 화살표), 동측 코드에서 축 삭에 특히 지역에서에서 전형적인 propriospinal 축 삭 (화살촉). 그림 1A' a, 신경 셀 시체와 모 수석에서 보여주는 전형적인 식 박스형 영역의 더 높은 확대를 보여...

이 프로토콜에서는 쥐 척수 조직으로 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 성 벡터의 주입을 보여 줍니다. 벡터는 시 냅 스에서 찍은 이며 대상 뉴런의 세포 체에 이송. 이 모델은 중요 한 척추 경로 또는 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 대상 셀의 역행 추적에 적합 합니다.

직접 분사 Lentiviral 벡터의 하이라이트 쥐 척수에서 여러 모터 통로

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

바이러스 벡터는 결함이 있는 유전자를 보상하기 위하여 세포로 유전 물질을 소개할 수 있습니다, 중요한 성장 단백질을 위로 통제하기 위하여, 또는 신경 회로를 추적할 수 있는 마커를 제조하기 위하여. 신경계에 바이러스 벡터를 도입하는 것은 타고난 생물학적 장벽으로 인해 도전적입니다. 척수 조직에 직접 주사하면 이러한 장벽을 우회하여 세포 체 또는 시냅스에 접근할 수 있습니다.L1에서 L4 척추 수준을 올바르게 타겟팅하는 것은 어려울 수 있습니다. 랜드마크를 사용하여 대상을 확인하고 이러한 세그먼트가 T11에서 T13 척추로 정렬되어 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 시술 당일 인젝터를 마이크로 펌프에 연결하고 마이크로 펌프를 더 버니어 스케일로 마이크로 조작기에 넣습니다.유연한 바늘이 있는 주사기를 사용하여 유색염료를 유리 바늘 중 하나에 조심스럽게 적재하고 유리 바늘을 인젝터에 삽입하십시오. 그런 다음 바늘이 와셔에 올바르게 시드되고 인젝터 캡이 단단히 고정되어 있고 강철 인젝터 바늘이 유리 바늘의 길이의 약 3 분의 3으로 연장되어 있는지 확인합니다. 절차를 시작하기 전에 적어도 하나의 마이크로 리터를 해동하고 냉동고 저장에서 주입 당 소량의 추가 바이러스를 해동하고 마취 된 쥐에서 발가락 핀치의 반응 부족을 확인합니다.엉덩이에서 동물의 견갑골의 열등한 각도에 엉덩이에서 등쪽 미드 라인을 따라 면도, 쉽고 정확한 면도를 위해 피부를 팽팽하게 당기고, 순차적 인 5 %요오드와 70 %에탄올 스크럽으로 노출 된 피부를 소독. 안과 연고를 양쪽 눈에 바치게 합니다. 그런 다음 동물을 멸균 천에 놓고 방광 아래에 거즈를 놓아 소변을 수집합니다.피부 절개 부위를 식별하려면 마지막 갈비뼈에서 손가락을 부드럽게 눌러 L1 척추를 찾습니다. 이 척추를 랜드마크로 사용하고 메스를 단단히 누르는 동안 부드럽게 퍼지는 피부팽이 면절을 유지하면 L1에 열등하여 L1에 열등하게 끝나는 3~4센티미터 의 수술용 블레이드를 사용하십시오. 집게와 가위를 사용하여 가시 공정을 느껴보십시오.쥐 치아 집게로 상부 공정에 단단히 잡을 수있는 공간이 있도록 작은 장밋랄 컷을 만듭니다. 그리고 가능한 한 프로세스에 가까운 두 개의 길고 깊은 컷을 합니다. 제자리에 측면 근육을 확보 한 후, 그들의 머리의 모양을 결정하기 위해 과정 주위에 근육을 취소.그런 다음 라미네절제술 부위를 식별하기 위해 가시 공정의 머리 모양을 시각화합니다. T11 및 결합 T12 및 T13 프로세스는 라미네절제술의 사이트가 될 것입니다. 대상 영역이 올바르게 확인되면 척추를 부드럽게 펴서 추간판 인대를 드러내고, rongeurs를 사용하여 척추의 척추 와 척추의 등뼈 측면에 작은 물기를 취합니다.중간선 혈관을 관찰할 수 있도록 중간라인에서 뼈를 치우고 척수 조직을 명확하게 드러내고 파편이 없는 창문을 남깁니다. 그런 다음 척추 홀더에서 동물을 확보하기 위해 라미네절제술 창에 회전 공정 로스트랄과 소달에 안정화 집게를 고정합니다. 그리고 동물의 복부를 들어 올려 호흡 운동의 효과를 부정한다.인젝터에 바이러스를 로드하려면 해동 된 스톡의 약 5 마이크로 리터를 파라필름 조각에 파이펫하고 유리 바늘을 배치하여 팁이 드롭 내부에 있도록합니다. 마이크로 펌프를 사용하여 초당 20~100나노리터의 속도로 최대 4개의 마이크로리터를 인출하고, 바늘 끝에서 소량의 바이러스를 방출하기 전에 컨트롤러를 주입하여 차단되지 않도록 한다. 실험실 닦아와 모든 초과 바이러스를 닦아 하 고 vernier 규모표시 되도록 마이크로 조작기 위치.바늘을 척수의 미드라인에 놓고, 마이크로 조작기의 버니어 스케일을 사용하여 바늘을 측면으로 0.8 밀리미터로 지시합니다. 그런 다음 바늘을 척추 화음으로 낮추고 구멍을 뚫지 않고 두라를 천공하지 않고 바늘 끝이 1.5 밀리미터 깊이로 침몰 할 때까지 바늘로 듀라를 뚫는 빠른 비틀림 동작을 사용합니다. 바늘이 제자리에 있으면 분당 400 나노 리터의 속도로 바이러스를 전달하는 인젝터를 프로그래밍하고 바이러스가 염료 전면의 진행 상황을 관찰하여 척추 화음에 들어가는지 확인합니다.주사가 끝나면 바늘이 2~5분 동안 척수에서 휴식을 취하여 바이러스의 확산을 용이하게 한 후 다음 주사 부위에 위치배치를 위해 바늘을 천천히 철회하십시오. 마지막 주사 후, 측면 근육을 확산하는 데 사용되는 장치의 제거를 허용하기 위해 척추 홀더에서 동물을 제거합니다. 그런 다음 4.0 염색체 catgut 봉합사로 근육을 닫고 9 밀리미터 의 상처 클립으로 피부를 단골합니다.성공적인 주입 후 4 주, 상당한 GFP 발현측면에 흉부 척수의 회색 물질 내에서 뉴런에서 관찰된다, 주사에 ipsilateral. 백색 물질에서, GFP 발현은 특히 전파척추 축삭에 전형적인 지역에서, ipsilateral cord에 있는 축삭에서 관찰됩니다. 회색 물질 뉴런의 더 높은 배율은 뉴런 세포 체및 수상월트에서 전형적인 신호 발현의 예를 드러낸다.뉴런에서의 GFP 발현은 또한 pontine 망상 형성 내와 같은 뇌간 핵에서 관찰될 수 있다. 성공적인 척수 주입 절차의 주요 요인은 올바른 척추 표적화이며 바이러스가 조직에 진입하고 있는지 확인하는 경우 로스트랄 척수 손상이이 절차 전에 수행되면 직접 주사를 사용하여 부상 주위의 연결을 재확립하는 뉴런을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

렌티바이러스 벡터의 직접 주입은 쥐 척수의 여러 운동 경로를 강조합니다.

출처: Smit, RD, et al. 뇌 및 척추 복합 수술을 사용하여 이중 바이러스 벡터로 신생아 쥐의 피질척수관을 표적으로 삼습니다. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 신생아 쥐의 피질 척수 뉴런에 대한 바이러스 벡터의 표적 전달을 보여줍니다. 이 프로토콜은 전행성 및 역행성 바이러스 주사를 사용하여 정확한 유전자 발현을 가능하게 하여 척수 손상 후 신경 재생 및 가소성에 대한 연구를 촉진합니다.

척수 손상을 연구하기 위해 신생아 쥐의 피질 척수 뉴런에 표적 바이러스 전달

이 비디오는 파킨슨병을 모델링하기 위해 쥐의 흑질에 바이러스 벡터를 주입하는 과정을 보여줍니다. 쥐를 준비하고, 바이러스 벡터를 흑질에 미세주입하는 단계와 회수 절차를 간략하게 설명합니다.

신경퇴행성 질환 모델링을 위한 Rat substantia nigra에 바이러스 벡터 주입

출처: Keefe, KM, et al. 렌티바이러스 벡터의 직접 주사는 쥐 척수의 여러 운동 경로를 강조합니다. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 신경 경로를 추적하기 위해 쥐 척수에 고효율 역행 수송(HiRet) 바이러스 벡터를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 바이러스는 시냅스 진입을 위한 당단백질과 형광 단백질 코딩 유전자를 가지고 있습니다. 바늘을 척수에 삽입하고 바이러스 현탁액을 제어된 속도로 투여합니다. 바늘은 바이러스 확산을 위한 충분한 시간을 허용한 후 최종적으로 빼냅니다.

역행성 신경 추적을 위한 쥐 척수에 바이러스 벡터 주입

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

이 문서는 접합체 perivitelline 공간으로 바이러스 현탁액의 다중 주사를 사용하여 쥐 배아에 있는 lentiviral transgenesis를 위한 방법론을 제공하는 것을 작정입니다. 다른 지배적 인 모피 색상과 비옥한 남성 균주와 교교 여성 쥐는 의사 임신 수양 어머니를 생성하는 데 사용됩니다.

렌티바이러스 벡터 접근법을 이용한 형질전환 쥐 생성

이 프로토콜은 전방 화학 유전 변형제를 체성 운동 피질에 주입하고 역행 수송 가능한 Cre 재조합 효소를 자궁 경부 척수에 주입하여 출생 후 5-10 일에 신생아 쥐의 세포 하위 집단에 유전자 요법을 적용하는 새로운 방법을 보여줍니다.

뇌 및 척추 결합 수술을 사용하여 이중 바이러스 벡터로 신생아 쥐의 피질척수관 표적화

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

학습하세요 쥐 척수에 직접 분사한 Lentiviral 벡터를 이용한 여러 모터 통로 추적 방법입니다. 정확한 척추 표적화와 GFP 발현 확인으로 신경 회로 연구 및 유전자 치료에 활용할 수 있습니다.

직접 분사 Lentiviral 벡터의 하이라이트 쥐 척수에서 여러 모터 통로

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