Name: 준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 배우세요 마우스 소뇌 오가노타이픽 슬라이스 배양을 이용한 수초 형성 및 면역염색 기법. 이 방법은 중추신경계 수초화 및 재수초화 메커니즘을 연구하며 조직 구조를 보존하여 실시간 이미징과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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우리에 대 한 귀중 한 의견 원고 박사 숀 프리먼, 닥터 나탈리 솔-Foulon와 박사 토마스 루 감사합니다. 이 작품 INSERM, ICM, ARSEP 교부 금 R13123DD, ANR R17127DD (광고)에 FRM 친목, SPF20110421435 (광고)에 의해 투자 되었다 (몬태나)를 FDT20170437332. 우리는 icm CELIS 셀 문화 시설 감사합니다. 양의 이미징 플랫폼입니다.

동물을 포함 하는 모든 작업 준수 기관 정책 및 지침 UPMC, INSERM 프랑스 및 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC에 의해 설립.
1. 준비 문화 매체와 문화의 삽입 (실습 시간 ≈ 10-15 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
<ol><li>50%로 구성 된 문화 매체의 40 mL를 준비 공학은, 25% 행 크의 균형 소금 솔루션 (1x), 25% 열 비활성화 말 혈 청, 2mm 글루타민 파생, 100 IU/mL 페니실린-스와 4.5 mg/mL D-포도 당 보충. PH 7.4에 조정 합니다.</li>
	<li>필터-소독 매체 50 mL 플라스틱 주사기에 적응 0.22 μ m 필터를 통해. 참고: 적어도 일주일에 4 ° C에서 문화 매체를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>6 강아지의 표준 쓰레기, 대 한 두 개의 살 균 6 잘 플레이트를 사용 합니다. 각 접시에 대 한 커버를 제거 하 고 잘 당 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>장소 문화 삽입 각 개별 잘 소독 집게와 플라스틱 가장자리를 눌러. 접시에 다시 커버를 넣어. 참고: 한 강아지 (6-8)에서 수집한 소 뇌 조각 두 막 (멤브레인 삽입 당 3-4 소 뇌 조각)에 파견 될 수 있다.</li>
</ol>2. 절 개 매체의 준비 (손을 ≈ 시간 5 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
<ol><li>절 개 매체, Gey의 균형 소금 솔루션 4.5 mg/mL D-포도 당 및 1 x 페니실린-스 (100 IU/mL 각)와 보완으로 구성 된 100 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>필터-0.22 μ m 필터 장치를 통해 매체를 소독. 참고: 적어도 한 달에 4 ° C에서 해 부 매체를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>60 mm 셀 문화 요리에 차가운 해 부 중간의 5 mL를 추가 합니다. 각 강아지 해 부 수에 대 한 60 m m 세포 문화 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>사용까지 얼음에 해 부 요리를 유지.</li>
</ol>3. 해 부 재료의 준비 (체험 시간 ≈ 15 분)
<ol><li>100% 에탄올과 벤치를 청소.</li>
	<li>모든 해 부 도구, 면도날과 조직 헬기의 플라스틱 플랫폼 100% 에탄올으로 소독.</li>
	<li>조직 헬기에 면도날과 플라스틱 플랫폼을 해결 하 고 300 µ m 절단 두께 조정.</li>
	<li>해 부를 시작 하기 전에 모든 에탄올 증발 했다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
</ol>4. CerebellumDissection 및 섹션 준비 (체험 시간 ≈ 동물 당 15-20 분)
<ol><li>쌍 안 현미경 얼음 처럼 차가운 해 부 매체를 포함 하는 60 m m 세포 문화 요리 중 하나 고 상단 플레이트를 제거 합니다.</li>
	<li>(신중 하 게 동물의 눈을 만지고 피) 70% 에탄올과 머리 모피를 면봉 하 고 승인 된 절차에 따라 큰 날카로운가 위를 사용 하 여 동물을 목을 벨. 참고: 소 뇌 조각 특정 섹스 또는 스트레인 바이어스 없이 P9-P10 쥐에서 생성 됩니다.</li>
	<li>작은 위를 사용 하 여 목에서 시작 하 고 마우스 총구에 올라가고 머리의 중간에 따라 피부를 잘라.</li>
	<li>하는 머리를 잡고 고 두개골, 머리, 아래 ventrally 피부를 다시 접어 고 하나의 손가락 사이 피부 두 겹을 꼬집어.</li>
	<li>부드럽게 구멍 매그넘으로 작은 위를 삽입 하 고 하나는 측면 쪽으로 절 개 옆 머리 두개골 주위 잘라 하 여 두개골을 잘라. 절단, 뇌 조직의 손상을 방지 하면서 최대한가 위의 팁을 병렬과 두개골에 가까운 유지.</li>
	<li>벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여 두개골의 등 쪽 부분을 검색 합니다. 두개골의 등 쪽 부분을 신중 하 게 해제 하는 동안 접착 meninges (반투명 관개 막 주변 뇌 조직)를 잘라 작은 위 뇌 조직 손상을 방지 하는 데 필요한 경우.</li>
	<li>조심 스럽게 소개 괜 찮 아 요-스트레이트 집게 (또는 또는 주걱을 사용 하 여) 복 부 두개골과 두뇌 사이 두뇌 밖으로 뒤집기 부드럽고 시와 삼차 신경 작은 위로 잘라.</li>
	<li>바로 접시 위에 거꾸로 머리를 선회 하 여 차가운 해 부 매체를 포함 하는 60 m m 셀 문화 접시에 중력으로 뇌 고 필요 하다 면 작은 위로 마지막 유착을 풀어.</li>
	<li>연구원, 직면 등 쪽과 복 부 측 접시의 바닥에 누워 뇌를 찾으시는 미세 집게를 사용 하 여.</li>
	<li>손상 받을 수 있는 쌍 안 현미경 하 개 측면에 뇌를 무력화 하 고 hindbrain, 만지지 마십시오 벌금-스트레이트 집게를 사용 합니다. (앞-및 midbrain, 그림 1Aa에 회로도 참조), 뇌의 나머지에서는 hindbrain 분리 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여. hindbrain의 나머지에서 소 뇌를 분리, 미세 집게 잘라 사용 아래 소 뇌 소 뇌 peduncles (회로도 참조 그림 1Aa').</li>
	<li>일단 소 뇌 격리, 신중 하 게 찢 어 멀리 meninges 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여 (에 회로도 참조 그림 1Aa').
</li>
	<li>고급 곡선된 겸 자와 소 뇌를 부드럽게 잡고를 지 면 위로 헬기 면도날을 수직 플라스틱 플랫폼에 ( 그림 1Bb회로도 참조).</li>
	<li>어떤 과잉 발음 1 mL에 적응 하는 메 마른 얇은 끝 피 펫 팁을 사용 하 여 소 뇌 주위 절 개 매체의 플라스틱 ( 그림 1Bb회로도 참조).</li>
	<li>뻗어, 단면 ( 1Bb 그림에 회로도 참조) 동안 최적의 화살 조각 플랫폼에 한 번 배치는 소 뇌 낳는 평면, 하지만 확인 합니다.</li>
	<li>소 뇌의 300 μ m 두께 화살 섹션 조직 다지기와 슬라이스 (회로도 참조 그림 1Bb'). 힘과 칼 날의 속도 사이트에 최적화 될 필요가 있다.</li>
	<li>부드럽게 썰어 소 뇌에 해 부 매체의 한 방울을 추가 합니다. 넓은 구멍 피 펫 팁 1 mL 피 펫에 배치를 사용 하 여 천천히 썰어 소 뇌를 발음 하 고 차가운 해 부 매체 포함 된 60 mm 셀 문화 접시에 다시 전송 (에 회로도 참조 그림 1Bb ').</li>
	<li>각 소 뇌 슬라이스 사이 100% 에탄올과 조직 헬기의 플라스틱 플랫폼을 청소. 플랫폼에 다음 뇌를 배치 하기 전에 증발 하는 에탄올을 하자.</li>
	<li>두 파인 직선 겸 자 (또는 양자 택일로 티타늄 바늘) 개별 분할 영역을 분리 하는 vermis에서 6-8 조각 선택를 사용 하 여 ( 그림 1Cc 에 회로도 참조 하 고 1Cc').</li>
	<li>6 잘 플레이트 문화 삽입 하 고 일부 절 개 매체, 1 mL 피 펫에 적응 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 함께 한 문화 삽입에 최대 4 선택 된 분할 영역 전송 (에 회로도 참조 그림 1Cc').</li>
	<li>배치 문화 삽입 밀어 하 여 올바른 위치에 그들을 부드럽게 당겨 절 개 매체 또는 집게를 사용 하 여, 그들이 서로 접촉을 피하고 중간 조각 (에 회로도 참조 그림 1Cc').</li>
	<li>얇은 끝 피 펫 팁을 사용 하 여 조각 주위 절 개 매체의 어떤 과잉을 제거 합니다. 슬라이스는 멤브레인에 평평 하다 확인 (회로도 참조 그림 1Cc').</li>
	<li>멤브레인에 슬라이스를 추가 하는 데 직후 인큐베이터에 6-잘 접시를 놓습니다.</li>
</ol>5. 조각 문화와 Demyelination (실습 시간 ≈ 15-20 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
<ol><li>조각 준비 후 3 일 마다 미리 예 열 하 고 버퍼링 된 신선한 문화 매체의 당 1 mL와 문화 매체를 교체 합니다.</li>
	<li>Demyelination에 대 한 모든 문화 매체 아래 문화 6 일 체 외 (DIV) 후 삽입을 제거 하 고 0.5 mg/mL LPC를 포함 하는 미리 데워 진된 신선한 문화 매체의 잘 당 1 mL와 함께 그것을 대체 합니다. 15-17 h 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 미리 데워 진된 문화 매체의 1 mL를 포함 하는 25 mm 페 트리 접시에 그들을 배치 하 여 삽입을 세척. 참고: 삽입 매체 접촉 해야 하지만 그것에 의해 커버 되지 않을.</li>
	<li>즉시 신선한 미리 데워 진된 문화 매체를 포함 하는 새로운 6 잘 플레이트에 문화 삽입 전송.</li>
	<li>조각 고정 될 때까지 2-3 일 마다 미리 데워 진된 신선한 문화 매체의 1 mL와 문화 매체를 교체 합니다.</li>
</ol>6. Immunohistochemistry (실습 시간 ≈ 1시 30분-2 h)
참고: 6.1 단계를 실시 합니다. 6.3 to. 연기 후드. 박람회 paraformaldehyde (PFA)을 방지 하 고 적절 한 조작 및 보호를 위한 제품 안전 데이터 시트를 참조.
<ol><li>각 문화 리프트를 사용 하 여 집게 플라스틱 가장자리를 눌러 삽입 하 고 각 우물에서 막 삽입 아래 문화 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>4%의 2 개 mL를 추가 하 여 30 분 동안 소 뇌 조각 해결 PFA 막 삽입에 PBS pH 7.4 x 1에서. 참고: 고정 시간 지점의 myelination 공부의 단계에 따라: 4 DIV myelination, 완전히 myelinated 조각에 7 DIV의 발병에 해당. LPC 치료의 경우 9 DIV demyelination, remyelination의 발병에 11 DIV와 완전히 remyelinated 조각에 14 DIV의 절정에 해당합니다.</li>
	<li>3 시간 10 분 동안 2 mL 1 x PBS 가진 조각으로 삽입을 세척.</li>
	<li>25 x 30 x 확대를 부드럽게 메스 또는 브러시를 사용 하 여 그들을 밀어 하 여 쌍 안 현미경 막 삽입에서 슬라이스를 구분 합니다. 또는, 막에서 그들을 분리 하는 동안 슬라이스를 손상의 위험을 방지 하려면 여전히 연결 된 조각으로 막 잘라 메스를 사용 합니다.</li>
	<li>브러시를 사용 하 여 1 x PBS를 포함 하는 4-잘 접시의 우물에 떠 있는 분할 영역을 전송 합니다.</li>
	<li>각 우물에서 PBS를 발음 하 고 15 ~ 20 분 동안-20 ° C에 미리 냉각된 100% 에탄올에 슬라이스를 품 어. 이 단계는 myelinated 섬유에 항 체 침투를 촉진 한다.</li>
	<li>100% 에탄올을 발음 하 고 한 번 짧게 1 PBS, x 다음 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 두 번 세척.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 PBS, 5 %NGS, 실 온에서 0.3% 비 이온 세제 일반적인 항 체 고정 사이트를 차단 하려면 x 1을 포함 하는 솔루션으로 30 ~ 45 분에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>차단 솔루션 발음 아니 세척이 필요 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 솔루션을 차단에 희석 주 항 체와 하룻밤 슬라이스를 품 어 소 뇌 organotypic 조각에 myelin를 시각화 하려면 MBP (닭, 1/150 또는 마우스 IGg2b, Smi99, 1/200) 또는 PLP (쥐, hybridoma, 1/5 ~ 1/10) 항 체. 참고: 동일한 조각에 둘 이상의 항의 식을 나타내기 위해 더블-또는 트리플 얼룩이 절차 수행 (예를 들어 그림 1 참조). 부 화를 동시에 수행 하기 위해 다른 종에서 생산 되는 주요 항 체 확인 합니다. 그런 다음 다른 fluorophores에 결합 된 그들의 해당 보조 항 체를 사용 하 여 ( 테이블의 자료 를 참조 꾸벅꾸벅 졸 기 및 paranodal 마커18 항 체).</li>
	<li>두 번째 날, 워시 슬라이스 3 번 10 분의 1 x PBS에.</li>
	<li>실 온에서 어둠 속에서 (1/500 희석) 솔루션을 차단에 희석 보조 항 체와 3 h에 품 어. 참고: 여기 설명 하는 것 보다 다른 항 체를 사용 하는 경우 항 체 희석 및 보육 시간 최적화 필요 수 있습니다.</li>
	<li>어둠 속에서 10 분의 1 x PBS에 슬라이스 세 번을 씻어.</li>
	<li>쌍 안 현미경, 유리 슬라이드에 분할 영역을 탑재 합니다. 슬라이드에 1 x PBS의 100 µ L를 놓고 슬라이스를 브러시를 사용 하 여 PBS에 전송 합니다. 필요한 경우 슬라이스를 펼쳐 슬라이드에 그들을 평평 하 게. PBS의 어떤 과잉을 제거 합니다. 경우에 immunolabeling 막에 아직도 붙어 조각 하 여 수행 됩니다, 유리 슬라이드에 막 coverslip 직면 조각으로 탑재 합니다.</li>
	<li>유리 coverslip에 직접 장착 매체의 한 방울을 배치 하 고 부드럽게 커버 조각. 어둠 속에서 4 ° C에서 몇 달 동안 탑재 된 슬라이드를 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains%3A+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Houndmills+Basingstoke+England%22%5BJournal%5D)">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li>
<li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li>
<li>Fünfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li>
<li>Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+myelination%3A+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li>
<li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity%3A+activity-dependent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li>
<li>Nave, K. -A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+the+nervous+system%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li>
<li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li>
<li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+An+Official+Journal+of+the+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li>
<li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li>
<li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nodes+of+Ranvier%3A+Molecular+Assembly+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495(2015).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li>
<li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores%2C+and+causes+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Medina-Rodríguez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules%3A+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage%3A+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li>
<li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304(2014).</li>
<li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologia.+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li>
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작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.

여기, 우리는 전을 생성 하는 프로토콜 세부 vivo 모델 마우스 소 뇌 organotypic 슬라이스 문화에 해당 게시 방법15,,1619 및 후속 myelin 이전에서 적응 이러한 준비의 immunostaining입니다. 이 전략 모두 건강 하 고 병 적인 상태에는 고해상도와 수 초 구성 요소를 시각화 하는 가능성을 제공 합니다.
10 일 된 쥐에서 가져온 소 뇌 organotypic 조각 문화는 가장 해 부 재현 하 수 분자 및 세포 메커니즘 myelination 및 remyelination 프로세스 기본 조사를 확고 실험 모델 및 생체 조건 뿐만 아니라 잘 정의 된 세포질 건축 뿐만 아니라 성숙 타임 라인17의 보존을 포함 하 여 해당 조직의 기능 기능. 또한, 소...

신경 세포는 그것의 환경 및 생성 및 다른 세포에 전기 자극의 전파를 보장 하는 축 삭에서 입력을 받는 somato 수지상 구획을 구성 하는 매우 편광된 세포 이다. 빠른 전파와 정보의 적시 납품은 신경 시스템의 적절 한 작동에 대 한 필수적입니다. 척추 동물, 그것은 myelination axonal 전도 속도1증가 수에 의해 촉진 된다. Myelin 압축된 계층 myelinating 명과 의해 생성 된 플라즈마 멤브레인의 중앙 신경 조직 (CNS)에 즉 oligodendrocytes 및 Schwann 세포는 말 초 신 경계 (PNS)에 의해 형성 된 특수 구조 이다. CNS 그리고 PNS에서 둘 다, axoglial 상호 작용 드라이브 전문된 axonal 도메인의 형성: 노드의 Ranvier와 그들의 주변 도메인, paranodes, 및 juxtaparanodes2. 수 초, 또는 internodes, 전압 개폐 나트륨 채널 (Nav)에서 풍성 하 게 하는 작은 unmyelinated 도메인에 해당 하는 노드의 Ranvier와 대체 절연 axonal 세그먼트. 높은 농도 및 노드의 Ranvier에서 나v 채널의 급속 한 활성화 활동 전위 그리고 myelin 칼 집의 단 열 속성 함께 재생을 허용, 보장의 효율적이 고 빠른 saltatory 유도 따라3축 삭 신경 충 동입니다.
신경 임펄스의 전도 속도 가속에 그것의 역할, myelinating 명과 장기 무결성을 보존 하 고 그것의 생존4,5에 참여, 축 삭에 대사 지원을 합니다. 또한, 그것은 취소 되고있다에서 최근 몇 년 동안 그 myelin는 인생, 따라서 아마도 참가 규정 및 다양 한 신 경계 기능의가 소성을 통해 동적으로 변조. 배포, 숫자, 길이, 및 축 삭을 따라 myelin 덮개의 두께 따라서 다양 한 네트워크6,,78세밀 하 게 조정 하는 소설 방법을 나타낼 수 있습니다. 따라서, myelin의 진화 인수 감각, 모터 및 인지 기능에 대 한 핵심 프로세스 이며 축 삭과 명과 사이 상호 작용의 섭 동은 점점는 발달에 기여로 간주 또는 신경 인수 질병9.
지질 (70%)의 높은 비율의 특정 기능 myelin 구성 특징 되었습니다. 단백질 (30%)에 비해 달리 다른 세포 막10. 그러나, myelin 지질, 달리 myelin 단백질의 대부분은 myelin, myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 2', 3'-주기적인 뉴클레오티드 3'-포스 (CNP), myelin 연합 당단백질 (MAG)를 포함 하 여 관련 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG), PMP-22 그리고 P010. Myelin 얼룩 다양 한 조직학 방법 존재 Luxol 빠른 블루11등의 지질 구성, 수단 블랙 B12, 베이커의 산 hematin 방법13로 실버14얼룩에 따라. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방식을 적절 한 대비와 해상도 개별 섬유를 시각화를 위한 항상 허용 하지 않습니다. 수 초를 감지 하는 양자 택일 접근 immunohistochemistry myelin 단백질에 대 한 감독을 통해 이다. 다양 한 항 체는 높은 특이성으로 myelin 특정 항 원을 대상 고 myelinated 구조를 검출 하기 위하여 정기적으로 사용할 수 있습니다. 항 체 항 원 상호 작용은 1 차 항 체에 대 한 감독 및 적절 한 형광 현미경 검사 법으로 시각 fluorophore 결합 이차 항 체를 사용 하 여 추가 공개 수 있습니다. 여기, 우리는 토론 프로토콜 얼룩 myelin에 ex vivo 소 뇌 조각, 신경 조직 아키텍처의 좋은 보존 수 있는 모델을 설명 합니다. 또한, 조직 및 Purkinje 세포 (소 뇌의 유일한 myelinated 신경)의 크기 그들 electrophysiological 연구 클래식 모델 만들고 그들은 마찬가지로 고정 또는 라이브 이미징 연구를 수행 하기 위해 이상적입니다.
소 뇌 조각 Purkinje 세포 myelination, 비보 (6-7 일 생체 외에서, DIV)15전 1 주일에 의해 주로 달성 하는 과정의 초기 증상에 해당 하는 시간, P9-P10 생쥐에서 생성 됩니다. 또한,이 모델은 적응 demyelinating 질환 다 발성 경화 증 (MS) 등을 조사 하는 광범위 한 demyelination 또는 사용 하는 myelinotoxic 복합 lysophosphatidylcholine (lysolecithin, LPC), 소 뇌 조각에 유도 될 수 있다 어떤은 자발적인 remyelination16,17옵니다. 내 인 성 remyelination 문화 매체에서 LPC 제거 후 2 일에서 그리고 거의 주 게시물 치료 완료.
이 프로토콜의 완성 등 소 뇌 조각 문화 준비 demyelination의 피크에 도달 하는 2 일 뒤 완전히 myelinated 슬라이스를 주, 그들의 전체에 대 한 다른 주에 대 한 반나절 approximatively 3 주 소요 remyelination입니다. 또한, immunohistochemistry 2 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 6 쥐 새끼의 표준 쓰레기에 적응 그리고 계획 된 실험에 사용 되는 동물의 수에 적응 시킬 필요가 있다.

<table><tbody><tr><td>BME 배지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Hank' ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 말 세럼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; 스트렙토마이신(10.000 IU/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Gey' s 균형 잡힌 소금 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스 용액(45%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>리소포스파티딜콜린(LPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올(100% 에탄올)</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.330</td><td>-20°C에서 냉각; C</td></tr><tr><td>트리톤&reg; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>500622</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>EuroMEDEX</td><td>ET330-A</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체 (Polyclonal, Chicken)</td><td>Merck Millipore</td><td>06-896</td><td>Dilution 1/300</td></tr><tr><td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) 항체 (Polyclonal, Chicken)</td><td>Merck Millipore</td><td>AB9348</td><td>Dilution 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) 항체 (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1019</td><td>Dilution 1/200</td></tr><tr><td>Anti-PLP 항체 (Rat, Hybridoma)</td><td>K. Ikenaka 박사의 선물; 일본 오카사키,</td> 희<td>석 1/5 to 1/10</td>Anti-Sodium Channel, Pan 항체 (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)Sigma Aldrich S8809 Dilution 1/150 Anti-Caspr 항체 (Polyclonal, Rabbit)Abcam ab34151 Dilution 1/500 Goat Secondary 항체 conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 ThermoFisher Scientific Dilution 1/500 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>조직 다지기</td><td>McIlwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>대형 가위</td><td>FST</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>소형 가위</td><td>FS</td><td>T 91500-09</td><td></td></tr><tr><td>미세 직선 집게</td><td>FS T</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>곡선 - 미세 집게</td><td>F.S.T</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 (60mm 및 100mm)</td> <td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-, 6-웰 배양 플레이트</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>밀리 세포 배양 인서트 (0,4 &micro; m, 직경 30mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td></td><td></td><td>37°C; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>미세 엔드 피펫 팁</td><td>Dutscher</td><td>134000CL</td><td></td></tr><tr><td>광형 피펫 팁</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079G</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>20 또는 50 mL</td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>0.22 &micro; m</td></tr><tr><td>메스</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>RS 프랑스</td><td></td><td>76 mm x 26 mm x 1.1 mm</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>RS 프랑스</td><td></td><td>22 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Kimtech Sciences 조직 와이퍼</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

준비 및 immunostaining myelinating organotypic 소 뇌 조각 문화

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

신 경계에서 수 초 이며 glial myelinating에 의해 생성 된 복잡 한 막 구조 세포, 어떤 ensheathes 축 삭 빠른 전기 전도 용이 하 게. Myelin 변경 어디 기능적인 적자와 관련 된 다양 한 신경 질환에 표시 되었습니다. 여기, 우리는 전직에 대 한 자세한 설명을 제공 vivo 모델 마우스 organotypic 소 뇌 조각, 여러 주 및 추가 표시 myelin를 시각화를 위한 문화에서 유지 될 수 있는 구성 된.

Organotypic 소 뇌 조각 PLP GFP 유전자 변형 마우스 (그림 2B), 뿐만 아니라 Purkinje 세포 얼룩 함께 P9-P10 C57black6 야생-타입 (WT) (그림 2A)에서 얻은 대표 myelin immunostainings의 예. 소 뇌 조각 백색 질에서 미는 folia의 주변으로 조각의 영역 트랙과 myelination Purkinje 세포의 주로 6 ~ 7 후 달성 팀 7 DIV에서 전체 demyelination의 유도 LPC 치료 (그림 2Ci-ii)를 통해 가능 하다. 다음 demyelination, 슬라이스 자발적으로 remyelinate는 완전히 remyelinated demyelination (그림 2Ciii...

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

이 방법은 세포 및 tissular 수준에서 myelination 및 재마일레네이션의 기본 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 기본 문화와 생체 내 접근 방식 사이의 교차로에 있습니다. 조직 아키텍처를 보존하는 주요 이점을 가진 빠르고 접근 가능한 모델입니다.절차를 시연하는 것은 멜리나 테티노트, 박사 후 연구원과 레미 론자노, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 시작하려면 작은 가위를 포라멘 매그넘에 부드럽게 삽입하고 측면을 향해 측면 절개를 한 다음 머리 두개골 주위를 모두 잘라 두개골을 잘라 두개골을 잘라냅니다. 두개골의 등대 부분을 회수하려면 미세하고 직선적인 집게를 사용하여 두개골의 등대 부분을 조심스럽게 들어 올립니다.그런 다음 복부 두개골과 뇌 사이의 집게를 조심스럽게 소개합니다. 부드럽게 뇌를 뒤집어 작은 가위로 시차 및 삼차 신경을 잘라냅니다. 다음으로, 두개골의 머리 또는 등쪽 부분을 얼음 차가운 해부 배지를 함유한 60mm 세포 배양 접시 바로 위에 거꾸로 돌려 뇌가 중력에 의해 떨어질 수 있도록 돕습니다.미세 한 집게를 사용 하 여, 등쪽 측면을 향하고 복 근 면 누워 뇌를 지향. 쌍안경 현미경의 밑에, 선뇌 측에 두뇌를 고정하기 위하여 미세하고 직선 적인 집게를 이용하십시오. 그런 다음 뒷뇌를 뇌의 나머지 부분과 분리합니다.소뇌 아래소뇌를 잘라 서 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 분리. 소뇌가 고립되면, 조심스럽게 수막을 찢어 잘, 직선 집게를 사용합니다. 미세하고 구부러진 집게로 소뇌를 부드럽게 잡고 등쪽을 플라스틱 플랫폼에 올려 헬기 면도날과 수직으로 놓습니다.다음으로, 멸균, 얇은 끝 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착되어 소뇌부 주변의 해부 매체에 대한 액세스를 흡인시합니다. 그런 다음, 티슈 헬기로 소뇌의 300 마이크로 미터 두께의 처진 부분을 슬라이스합니다. 다음으로, 얇게 썬 소뇌에 해부 매체 한 방울을 부드럽게 넣습니다.그런 다음, 넓은 멧돼지 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착되어 슬라이스 된 소뇌를 천천히 흡기하고 얼음 차가운 해부 매체를 포함하는 60mm 세포 배양 접시로 다시 옮춥습니다. 다음으로, 두 개의 미세한 직선 집게를 사용하여 개별 조각을 분리합니다. 그런 다음, 넓은 멧돼지 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착된 후, 버미에서 선택한 최대 4개의 슬라이스와 6개의 웰 플레이트의 하나의 배양 삽입에 일부 해부 배지를 전달합니다.얇은 끝 파이펫 팁을 사용하여 슬라이스 주위의 해부 매체에 대한 액세스를 제거합니다. 탈근의 경우, 시험관내 6일 후 배양 삽입물 아래에 있는 모든 배양 배지를 제거하고 밀리리터 LPC당 0.5밀리그램을 함유한 미리 따뜻하고 신선한 배양 배지의 웰당 1밀리리터로 교체하십시오. 이산화탄소 환경의 섭씨 37도에서 15~17시간 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 사전 데운 배양 배지 1밀리리터를 함유한 25밀리리터 페트리 접시에 넣음으로써 인서트를 세척합니다. 그런 다음, 신선한, 미리 데운 배양 매체를 포함하는 새로운 6 개의 우물 접시에 배양 삽입을 즉시 전송합니다. 면역 히스토케를 시작하려면 먼저 집게를 사용하여 배양 삽입을 들어 올리고 그 아래에 배양 배지를 제거하십시오.그런 다음, 소뇌 슬라이스를 해결하기 위해 멤브레인 인서츠에 1x PBS, ph 7.4에 4 %의 PFA의 2 밀리리터를 추가합니다. 30분 후, 매 세척할 때마다 1x PBS 2밀리리터로 슬라이스를 세 번 씻습니다. 다음으로, 쌍안경 현미경의 밑에, 25x에서 30 배율을 사용하여, 메스 또는 브러쉬를 사용하여 멤브레인서 삽입에서 조각을 부드럽게 분리합니다.그런 다음 브러시를 사용하여 부동 조각을 4개의 웰 플레이트의 우물로 옮기고, 항체 소비를 제한하는 1x PBS를 함유한다. 그런 다음, 각 우물에서 PBS를 흡인하고 15 ~20 분 동안 영하 20도에서 미리 냉각 된 100 % 에탄올에서 슬라이스를 배양합니다. 인큐베이션 후 100% 에탄올을 흡인하고 1배 PBS로 슬라이스를 간략하게 씻어낸다.그런 다음, 각 세척 할 때마다 10 분 동안 1 x PBS로 실온에서 두 번 씻습니다. 비특이적 항체 고정 부위를 차단하기 위해 PBS를 흡습하고 1x PBS, 5%NGS 및 0.3%비 이온 세제를 실내 온도에서 30~45분 동안 포함하는 용액으로 슬라이스를 배양한다. 다음으로, 차단 용액에 희석된 1차 항체를 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 슬라이스를 배양한다.하룻밤 동안 인큐베이션 후, 매 세척 할 때마다 10 분 동안 1 x PBS로 슬라이스를 세 번 씻으시다. 그런 다음 차단 용액에 희석된 이차 항체를 1~500희석 비율로 추가하고 3시간 동안 어둠 속에서 실온에서 슬라이스를 배양한다. 이차 항체와 인큐베이션 후, 매 세척할 때마다 10분 동안 어둠 속에서 1x PBS로 슬라이스를 세 번 씻는다.다음으로 쌍안경 현미경으로 슬라이드에 1x PBS의 100 마이크로리터를 놓고 브러시로 조각을 PBS로 옮기고 슬라이드에 평평하게 놓습니다. PBS에 대한 액세스를 제거합니다. 마지막으로, 유리 커버 슬립에 직접 장착 매체의 한 방울을 놓고 부드럽게 조각을 커버.골린 면역스테인링은 9일에서 10C57 블랙 6마리의 중성마우스로부터 얻은 조직형 소뇌슬라이스에서 11일 간 관찰되었으며, 전압 문이 있는 나트륨 채널에 농축된 로나비의 노드를 통해 11일 간 관찰되었으며, 편집증적 악소글리아 접합 도메인에 의해 측면이 있다. PLP-GFP 형질전환 마우스에 대해 동일한 결과가 관찰되었다. 파켄기 세포의 양수는 대부분 문화에서 1 주일 후에 달성된다.LPC 치료는 완전히 자발적으로 재myelinate 완전히 6 일 사후 탈근을 골라 진화 슬라이스를 demyelinates. 이 절차는 최대 25분이 소요됩니다. 그것은 정말 가장 중요한 포인트입니다.Organotypic 슬라이스 배양은 myelination 역학의 라이브 이미징 연구에 적합합니다. 그것은 또한 약물 선별 실험을 대상으로 사용할 수 있습니다. 이 기술은 근생 및 재분화 프로세스를 연구하기 쉬운 정량적 접근 방식을 허용합니다.실험자는 동물 복지, 과도하고 날카로운 신비에 적용되는 기본 안전 절차를 따라야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 방법은 organotypic 소뇌 문화의 생성 및 다른 소뇌 세포 유형의 생존 능력에 특정 apoptotic 자극의 효과를 설명합니다.

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

우리는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에서 자란 개별 Purkinje 세포의 수지상 나무의 형태를 확인하고 양적 엉덩이에 할 수 있습니다 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 Purkinje 세포 수지상 개발의 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기위한 것입니다.

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

이 비디오는 마우스 소뇌에서 조직 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 소뇌 절편은 수초화 역학을 포함한 신경 발달 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 유기형 배양에 사용할 수 있습니다.

소뇌 절제 및 절편 준비: 마우스 소뇌에서 조직 절편을 생성하는 방법

이 비디오는 쥐 강아지의 뇌에서 소뇌 유기형 절편을 채취하여 영양소와 성장 인자로 보충된 배지에서 절편을 배양하여 체외에서  소뇌 발달을 모방하는 기술을 보여줍니다.또한 특정 소뇌 절편을 테스트 화합물로 처리하고 면역형광 염색 기술을 사용하여 화합물의 신경 보호 능력을 분석합니다.

유기형 소뇌 절편 배양에서 Purkinje 세포 생존 분석

전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다.  이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

출생 후 소뇌 발달 동안, 생식대에서 유래한 미성숙 과립 세포는 최종 목적지에 도달하고 신경 네트워크를 구축하기 위해 뚜렷한 이동 방식을 보입니다. 이 프로토콜은 소뇌 절편의 준비와 신경 세포 이동을 조절하는 요인을 조사하는 데 사용되는 공초점 거시적 접근 방식을 설명합니다.

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

핵막 단백질은 많은 기본적인 생물학적 과정에서 중심적인 역할을 하며 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다.  이 프로토콜은 LINC 복합체 파괴의 시공간 제어를 허용하는 새로운 Cre/Lox 기반 마우스 모델을 설명합니다.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.

오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존

배우세요 마우스 소뇌 오가노타이픽 슬라이스 배양을 이용한 수초 형성 및 면역염색 기법. 이 방법은 중추신경계 수초화 및 재수초화 메커니즘을 연구하며 조직 구조를 보존하여 실시간 이미징과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

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