높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험
2019년 2월 27일
여기 우리는 혈 청에서 항 체의 Shigellacidal 활동을 측정 하는 프로토콜을 제시. 혈 청은 박테리아와 외 인 보수, 인 큐베이 팅, 혼합 그리고 반응 혼합물은 한 접시에 도금. 실행 가능한 박테리아는 계산, 자동된 식민지 열거자를 사용 하 고 살 균 titer를 결정 하는 데 사용 되는 식민지를 형성 한다.
Shigella 연구 분야는 현재 예방 접종 또는 감염에 의해 생성 된 항체의 기능적 역할을 검사하기 위해 잘 정의 된 연구가 부족합니다. 이 분석법은 이러한 면역 반응을 검증하고 Shigella 특이적 항체의 살균 활성을 측정하는 잘 정의된 방법을 나타낸다. 이 분석의 주요 장점은 여러 샘플의 높은 처리량 분석을 허용한다는 것입니다.
이 프로토콜에 사용되는 기술은 항체 및 혈청 샘플의 직접적인 세균 성 살인을 측정하기 위해 실습 시간과 전반적인 분석 시간을 크게 줄입니다. 먼저 샘플을 섭씨 56도에서 30분간 배양하여 시험 샘플을 가열하고 활성화합니다. 분석 플레이트와 20 마이크로리터의 분석 버퍼를 얻어 1~12개의 열A를 통해 G.Add 20 마이크로리터의 분석 버퍼를 각 테스트 샘플의 1개와 2개의 행 H.Load 30 마이크로리터에 추가하고 분석 플레이트의 H행H로 복제한다.
테스트 샘플의 세 배 직렬 희석을 수행하기 시작하려면 멀티 채널 파이펫을 사용하여 우물 3H에서 12H까지 10 마이크로리터를 제거합니다. 샘플을 G행G및 파이펫의 해당 우물로 옮기고 8~10회 위아래로 피펫을 사용하여 시료를 잘 혼합합니다. 그런 다음 이 우물에서 10 개의 마이크로 리터를 제거하십시오.
F행의 해당 우물으로 옮기고 파이펫을 위아래로 8~10회 위아래로 섞어 섞는다. 행 A.를 통해이 직렬 희석 과정을 계속 A.행 A에서 우물을 혼합 한 후, 제거하고 모든 우물의 최종 볼륨이 20 마이크로 리터되도록 12A를 통해 10 마이크로 리터를 제거하고 폐기. 냉동 대상 세균 주 한 유리병을 검색하 고 실온에서 해동.
그런 다음, 분석 완충제의 20 밀리리터에서 박테리아를 희석. 미리 결정된 최적 희석 계수에 따른. 다중 채널 파이펫을 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 희석 된 박테리아 10 마이크로 리터를 추가하십시오.
냉동 아기 토끼 칭찬의 유리병 과 냉동 열 활성화 BRC의 하나의 유리병을 검색할 수 있습니다. 차가운 흐르는 물을 사용하여 바이알을 실온으로 해동하십시오. 그런 다음 100 마이크로리터의 열 활성 BRC를 400 마이크로리터의 분석 버퍼와 혼합합니다.
이 20%의 열 활성화 BRC 솔루션 50마이크로리터를 열1의 모든 우물에 추가합니다. 네이티브 BRC의 밀리리터 1밀리리터와 4밀리리터의 분석 버퍼를 혼합합니다. 이 20% 혼합물의 50 마이크로리터를 2~12개의 열의 모든 우물에 추가합니다.
접시 하나를 플레이트 셰이커 1개를 10-15초 동안 놓고 분석 판을 부드럽게 섞습니다. 미생물 인큐베이터에서 분석 플레이트를 2시간 동안 배양합니다. 한편, 두 LB Agar 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 접시를 생물학적 안전 캐비닛에 올려 놓고 40~60분 동안 건조시.
인큐베이션이 완료되면 분석판을 젖은 얼음으로 옮기고 10~20분 동안 배양하여 반응을 멈춥시다. 12 채널 파이펫을 사용하여, H행에 우물을 혼합하고 LBA 플레이트의 바닥에 반응 혼합물의 10 마이크로 리터를 반점 플레이트. 즉시 접시를 기울이고 반점이 약 1.5 ~2 센티미터 동안 실행되도록합니다.
G, F 및 E 행에 대해 이 절차를 반복하여 이전 행 위에 찾아보세요. 용액이 LBA 플레이트에 흡수될 때까지 실온에서 LBA 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 뚜껑을 접시에 놓고 거꾸로 미생물 인큐베이터로 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다.
다음 날, 추가 25 섭씨 55 섭씨에 오버레이 Agar의 밀리리터, 포함 100 밀리리터 TTC 당 마이크로 그램과 0.1 각 LBA 플레이트에 % 나트륨 아지드. 살아남은 박테리아가 붉은 색을 개발할 수 있도록 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 디지털 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영합니다.
이미지를 컴퓨터로 전송하고 NIST의 통합 콜로니 열거 소프트웨어를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 이미지를 분석합니다. 대표적인 LBA 플레이트는 하룻밤 동안 잠복및 오버레이 추가 후 색상 개발이 이루어졌으며 살아남은 모든 식민지가 빨간색으로 보입니다. 세균성 살인은 처음 3개의 희석에서 시험된 모든 견본을 위해 명확하게 보입니다.
세균성 살인의 감소는 견본이 접시 위로 더 희석되고 혈청이 더 적게 집중되기 때문에 보입니다. 그런 다음 NIST 소프트웨어를 사용하여 마이크로 콜로니 카운트가 수행됩니다. 각 샘플의 각 희석에 대한 평균 CFU 카운트는 50%의 살인 값과 마찬가지로 계산됩니다.
이 50%의 살인 값은 SBA KI를 계산하는 데 필요한 값을 결정하기 위해 각 혈청 희석에 대한 평균 CFO에 적용됩니다. 이 프로토콜은 LB 오거에서 일관되고 균일한 세균 도금에 의존합니다. 좋은 스팟 도금 및 틸팅 기술은 이산 마이크로 콜로니와 정확한 식민지 계산의 성장을 허용합니다. 이 기술은 살아있는 악성 Shigella를 사용하고 박테리아가 BSL 2 절차에 따라 안전하게 처리되도록 적절한 무균 기술과 PPE가 필요합니다.
개요
이 기사는 혈청의 항체의 시겔라 살균 활성을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 고속 분석을 가능하게 하며 시겔라 특이적 항체의 살균 활성을 평가하는 동안 직접적인 작업 시간을 줄입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 미생물학
- 혈청학
배경
- 시겔라 연구 분야에는 항체 반응을 검사하기 위한 정의된 분석법이 부족합니다.
- 이 프로토콜은 면역 반응을 정량화하고 살균 활성을 측정합니다.
- 여러 샘플의 효율적인 분석을 가능하게 합니다.
- BSL 2 조건에서 생 독성 시겔라를 사용합니다.
연구 목적
- 시겔라 살균 활성을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 분석법을 확립합니다.
- 예방접종이나 감염으로 인한 면역 반응의 평가를 용이하게 합니다.
- 직접적인 작업 시간을 최소화하고 처리량을 최대화하는 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 혈청 샘플의 열 활성화.
- 시험 샘플의 3배 연속 희석.
- 희석된 박테리아와 보체를 이용한 분석 판의 접종.
- 배양 후 자동화된 소프트웨어를 이용한 콜로니 계수.
주요 결과
- 다양한 희석에서 박테리아 살균의 성공적인 측정.
- 배양 후 살아남은 콜로니를 빨간색으로 명확하게 시각화합니다.
- CFU 계수의 정량화 및 50% 살균 값의 결정.
- 분석법의 신뢰성 및 효율성의 시연.
결론
- 이 프로토콜은 항체 기능을 평가하기 위한 표준화된 방법을 제공합니다.
- 시겔라에 대한 면역 반응의 이해를 향상시킵니다.
- 미래의 적용으로 백신 효과 연구가 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-throughput Shigella-specific serum bactericidal assays (SBAs) address a critical gap in functional antibody evaluation for vaccine and immunotherapy development. By enabling robust, reproducible quantification of bactericidal activity, this assay supports predictive confidence in early discovery and translational research. Its standardized, scalable workflow enhances portfolio decision-making and risk-adjusted advancement for Shigella-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of functional antibody-mediated bacterial killing for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying immune effector function against Shigella.
- Facilitates comparative evaluation of candidate antigens or immunization strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, high-throughput platform for screening serum samples across multiple conditions.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay standardization and cross-lab comparison.
- Reduces manual labor and increases throughput using 96-well plates and automated colony counting.
Translational & Preclinical Research
- Enables assessment of functional antibody responses pre- and post-antigen exposure in preclinical models.
- Supports translational biomarker development by linking bactericidal titers to protective immunity.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation for vaccine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This SBA protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical evaluation, providing a standardized readout for functional antibody activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-mediated bacterial clearance and immune mechanism elucidation.
- Screening: Offers reproducible, quantitative bactericidal titers for candidate and cohort comparison.
- Analytics: Utilizes automated colony enumeration and 50% killing index calculations for robust data outputs.
- Translational Research: Aligns functional antibody measurements with preclinical and clinical immune response endpoints.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, transferable assay platform for multi-site and multi-program deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and functional immune response assessment.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, reducing labor and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing standardized, quantitative functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vaccine and immunotherapy candidates based on functional antibody activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, microbiology, and aseptic technique for BSL-2 pathogens.
- Needs access to 96-well plate handling, automated colony counting software, and microbiological incubators.
- Demands cross-team standardization for assay setup, plating, and data analysis.
- Adaptable to various serum sources and Shigella strains with protocol optimization.
- Live virulent Shigella use necessitates strict biosafety and PPE compliance.
