Name: 시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 조직 공학 기법을 이용한 기관 이식물의 재생 메커니즘 연구 방법입니다. 마우스 모델에서 골수 단핵세포를 활용한 이식 기술을 통해 기관 협착의 세포적 원인을 규명하고 임상 적용 가능성을 평가합니다.

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우리는 그래픽 디자인에서 로버트 Strouse 연구 정보 솔루션 및 그들의 지원에 대 한 전국 어린이 병원 혁신 부서를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 NIH (NHLBI K08HL138460)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 전국 어린이 병원에 의해 승인 되었습니다.
1. 비 계 제조
<ol><li>하 여 폴리머 nanofiber 전조 솔루션 준비: 1) 녹이는 8 wt % 애완 동물 2) 실 온에서 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol에서 3 wt %PU 용 해 하 여 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol 및 60 ° C에 솔루션을가 열.</li>
	<li>일단 냉각, 애완 동물 및 PU (과)의 최종 폴리머 혼합물을 만드는 솔루션을 결합 합니다.</li>
	<li>스테인레스 스틸 로드 (1 밀리미터 직경)에 PET+ PU 솔루션 PET:PU 솔루션으로 가득 60 mL 주사기에 20 G 무딘 팁 바늘을 이용 하 여 높은 전압 DC 전원 공급 장치 설정 14 사용 하 여 바늘, 다른 높은 전압 DC 전원에 kV 공급-3로 설정 하는 Electrospin kV 5 mL/h 흐름 속도 20 cm 팁-기판 거리. 섬유 증 착 동안 350 rpm에서 막대를 회전 합니다.</li>
	<li>300 µ m의 원하는 비 계 벽 두께 얻을 때까지 전기를 계속 합니다. 비 계는 막대에서 슬라이드 다음 하룻밤 어떤 잔여 용 매를 제거 하려면 진공에서 개최.</li>
	<li>이식 전에 350 mJ/cm2 의 자외선 빛 복용량을 사용 하 여 발판 소독.</li>
</ol>2. 골 수 파생 된 단 세포 (BM-MNC) 수확
<ol><li>안락사는 6-8 주 오래 된, 여성, C57BL/6 마우스 마 취 제 (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg)과 ketoprofen (10 mg/kg)의 칵테일. 꼬리 핀치 방법으로 완전 한 안락사에 대 한 확인 합니다. 안락사에 대 한 지역의 지침을 따르도록 해야 합니다.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 화관과 tibias 좋은 위 및 마이크로 Adson 집게를 사용 하 여 뼈를 노출 하는 피부를 제거 합니다. Dumont #5 집게 및 Dumont #5/45 집게를 사용 하 여 근 막 및 힘 줄을 제거 하. 뼈를 분리 하 고 양쪽에 그들의 각각을 잘라. 5 mL 주사기와 25 G 바늘 using Rosewell 공원 기념 연구소 (RPMI) 미디어의 30 mL를 포함 하는 페 트리 접시에 골 수 플러시. 50 mL 튜브에 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 골 수와이 RPMI를 필터링 합니다.</li>
	<li>Biosafety 내각에 15 mL 튜브에 polysurcrose와 나트륨 diatrizoate의 5 mL을 놓습니다. 2 개의 층의 혼합을 방지 하려면 RPMI 튜브의 측면 골 단 세포를 포함 하는 부드럽게 추가 합니다. 원심 분리기와 30 분 461 x g 에 "브레이크 1" 24 ° c.에 참고: 우리의 원심 분리기에 브레이크 1 약자는 긴 시간 감속 동안에 밖으로 실행합니다.</li>
	<li>형성 하는 3 개의 층에서 플라즈마의 탑 (핑크) 레이어를 삭제 하 고 골 단 세포로 구성 된 중간 (명확한) 레이어를 수집 합니다. 적혈구의 침전을 삭제 합니다.</li>
	<li>24 ° c.에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) "브레이크 9" 1:1 비율에 461 x g 에서 원심 분리기로 10 분에 골 단 세포 (BM-MNC)를 희석</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 PBS의 5 mL와 펠 릿을 희석. 원심 분리기로 10 분 동안 461 x g 에 "브레이크 9" 24 ° c.에</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 RPMI의 ~ 10 mL와 펠 릿을 희석.</li>
	<li>0.4 %trypan 파랑 1 mL 튜브에의 동등한 양으로 BM MNC 솔루션의 10 µ L를 희석. 챔버 슬라이드를 계산 하는 셀에 솔루션의 장소 10 µ L. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 단계를 반복 하 고 셀의 평균 수를 계산 합니다. 참고: 1 X 108 셀의 평균 세포 수 두 기증자 마우스의 사용에서 얻은 했다. 이 두 개의 화관에 해당 될 것 이며 골 수 뼈 두 tibias 격리.</li>
	<li>24 ° c.에서 10 분 동안 461 x g 에서 BM MNC 솔루션 "브레이크 9" 원심 상쾌한을 제거 하 고 107 셀/이식에 셀 농도 희석. 참고: 우리 공부 1, 10 및 100 백만 셀 사이의 효율 시드 하 고 이식 당 10 백만 셀 높은 시드 효율 산출 발견.</li>
</ol>3입니다. 세포는 이식에 시드
<ol><li>장비의 길이 측정 하 고, 필요한 경우 5 m m의 길이에 그들을 잘라.</li>
	<li>미리 젖은 5 분 제거는 RPMI 위한 RPMI의 5 µ L로 비 계.</li>
	<li>10 분 동안 발판의 루멘에 BM MNC 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>이식의 루멘을 통해 21 G 바늘을 통과 하 고 품 어 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 RPMI의 1000 µ L에 이식.</li>
</ol>4. 이식 이식
참고: 관리는 이식 이식 절차 동안 무 균 기법을 유지 하기 위해 취해야 한다.
<ol><li>받는 사람으로 6 8 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 셀 시드 이식에 대 한. Enrofloxacin (10 mg/kg) 피하 주사의 바로 전에 절 개 수술 전과 24 h.</li>
	<li>그리고 마우스 무게 intraperitoneally 진통으로 케 타 민 (100mg/kg), xylazine (10 mg/kg)과 ketoprofen (5 mg/kg)의 마 취 칵테일의 0.1 mL/10 g 복용량을 관리.</li>
	<li>마 취의 비행기 꼬리 핀치 방법에 의해 달성 되었습니다 경우 확인 하십시오. 진정의 수준을 확인, 눈에 불 임 안과 연 고를 적용 하 고 clavicles에서 턱 수술 사이트에 머리를 클립. 장소 등 휴식 위치에서 패드에 동물. Povidone-요오드 준비 패드, 뒤에 알코올 준비 패드 (70% 알코올), 그리고 한 번 더 povidone-요오드 준비 패드 먼저 사용 하 여 수술 부위의 소독.</li>
	<li>외과 의사에서 머리와 해 현미경 동물을 놓습니다. 좋은 위 및 마이크로 Adson 겸의 도움으로 hyoid 뼈는 clavicles에서 배열 하는 중간 절 개를 확인 합니다. Dumont # 5와 필요, 하 고 자기 유지 Colibri 견인 삽입 경우 멸 균 면봉 함께 Dumont #7 좋은 집게 근 막 청소.</li>
	<li>갑 상선 연골, 반지 연골과 기도 노출 하 몬 트 #5 및 Dumont #7 좋은 집게와 스트랩 근육 (그림 3A)를 엽니다. 퉁 명 스럽게 회귀 후 두 신경 식도 (그림 3B)에서 기도의 원주 분리 뒤 양쪽에 병렬 실행에서 기도 구분 합니다.</li>
	<li>Using 20 G 바늘과 수술 표식, 기관지의 앞쪽 부분 얼룩.</li>
	<li>기도 식별 하 고 세 번째 tracheal 연골 반지 아래 절 개 transect 욕실이 Tubingen 봄이 위 및 Dumont #7 좋은 집게의 쌍을 사용 하 여 기관. 고급 곡선된 겸 자와 그것을 잡고, 살 균을 사용 하 여 흉 골을 말 초 기관지를 만드는 임시 tracheostomy (그림 3C) 9-0 나일론 봉합 보안. 참고: 사용할 수 있는 대체 봉합 사 물자 tracheal 주입 및 근육 reapproximation에 대 한 9-0 PDS는.</li>
	<li>20 G 바늘과 수술 표식, 앞쪽 부분을 표현 하기 위해 이식 얼룩.</li>
	<li>근 위-후부, 인접 측면 삽입 이식 임 플 란 트 하 고 9-0 살 균 나일론 봉합 (그림 3D), 몬 트 # 7을 사용 하 여 순서 대로 인접 앞쪽 봉합 좋은 집게와 바늘 홀더.</li>
	<li>외과에서 꼬리를 동물 180 °를 설정 합니다. 임시 tracheostomy를 놓습니다. 말 초 기관 철회에 대 한 그 루터 기로 절제 세그먼트의 사용을 허용 하도록 transected 불완전 이다. 더 이상 필요 하지, 5 MM 기관 세그먼트 완전히 제거 됩니다.</li>
	<li>근 위 문 합으로 비슷한 패션에는 봉합을 배치 하 여 원심 문 합을 완료 합니다.</li>
	<li>다시 이식 위치와 스트랩 근육 대략적인. 운영 하는 본에 9-0 살 균 나일론 봉합을 사용 하 여 절 개를 닫습니다.</li>
	<li>Buprenorphine (0.1 mg/kg)의 0.1 mL를 피하 주사 하 고 다른 동물 케이지에서 없이 난방 패드에 복구에에서 동물을 배치.</li>
	<li>의식 하 고 ambulate, 다음 부드러운 침구, 촉촉한 차 우와 48 h에 대 한 치료 물 (이 부 프로펜, 30 mg/kg)로 새로운 케이지를 마우스를 전송할 수 있게 될 때까지 마우스를 관찰 합니다. 이 기간 후 마우스를 다른 마우스와 일반 케이지 돌아갑니다. 참고: 마우스는 호흡 곤란을 유지 또는 이식 후 활동 감소는 32 ° C 배양 기에서 실험실 및 동물 또는 직원에 의해 관찰 된다. 이 48 시간 이상 계속 되 면 쥐 안락사 해야 한다.</li>
</ol>5. 조직학 및 Immunohistochemistry
참고: Hematoxylin에 오신 얼룩 했다 표준 기술을 사용 하 여 의해 수행 전국 어린이 병원 형태학 코어. Immunohistochemistry에 따라 수행 된 단계 아래.
<ol><li>슬라이드 deparaffinize H2O (dH2O) 5 분 5 분, 5 분 동안 2) 크 실 렌, 5 분, 5 분의 4) 90% 에탄올, 5 분, 5) 70% 에탄올 3) 100% 에탄올에 대 한 1) 크 실 렌을 사용 하 여 6) 증류수.</li>
	<li>시트르산 버퍼에 슬라이드를 잠수함과 물 가득 압력 밥 솥에 놓습니다. 다음 10 분 동안 열 실내 온도에 냉각 수 있습니다. 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA-PBS) PBS에와 dH2오 분 린스 세척 참고: 난방도 온수 욕조 또는 15 분 동안 전자 레인지로 할 수 있습니다.</li>
	<li>3% 정상 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h와 슬라이드를 품 어. 0.1%와 세척 5 (1:1000)6각 질 14 (1: 250)6 , 4 ° c.에 하룻밤 18 h f 4/80 (1: 100)7 BSA-PBS 5 분에 대 한 각 질에 대 한 농도와 1 차 항 체에 품 어</li>
	<li>0.1% BSA PBS 두 번 10 분 동안 각 세척 세척. K5/K14 및 1:300 F4/80 실 온에서 1 h 1: 500의 농도에서 적절 한 2 차 항 체로 품 어. 0.1% BSA PBS 두 번 10 분 동안 각 세척 세척.</li>
	<li>마운트 4', 6-diamidino-2-phenolindole를 사용 하 여 (DAPI) 포함 하는 설치 미디어와 유리 커버 전표. 이미징 하기 전에 30 분 동안 앉아서 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li>
<li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+A+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li>
<li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+basal+cells%3A+A+facultative+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li>
<li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li>
<li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li>
<li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery+%28United+States%29%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li>
<li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li>
<li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pediatric+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

조직 설계 tracheas에 대 한 마우스 모델의 개발 요인 임상 번역 TETGs;의 제한 된 이해에 필수적 이다 즉 이식 붕괴, 협 착 증 및 지연된 epithelialization4. 이러한 제한에 기여 하는 몇 가지 요인이 이식 재료, 제조 공정, 비 계 디자인 및 프로토콜 시드 셀의 선택을 포함 합니다. 이 모델 빠른 평가 이러한 요인의 영향을 미치는 세포 및 분자 메커니즘을 이해 하기 위해 수 있습니다.
우리는 여기에 표시 된 상피 세포 (그림 4)의 존재 뿐 아니라 이식 협 (그림 5);를 정리 하는 모델의 능력 그러나, 모델의 성공적인 사용은 이식 과정에서 몇 가지 주요 단계에 따라 다릅니다. 첫째, 초기 절 개 및 마우스 기도의 절연을 하는 동안 그것은 부상을 피하기 위해 필수적 또는 tracheoesophageal ...

긴 세그먼트 tracheal 결함 완전 tracheal 반지 및 tracheal agenesis로 외상, 악성 종양, 감염 등 희귀 한 선 천 적 조건으로 제시할 수 있습니다. 성인 또는 어린이 tracheal 길이의 30%에서 6 cm를 초과 하는 경우 이러한 결함 수술 재건에 의해 대우 될 수 없습니다. 자가 조직, 싱가포르로 이주, 및 인공 구조와 기도 대체 하려고 만성 감염, 알갱이 만듦, 기계 고장, 그리고 협 착 증에 의해 괴 롭 혀 되었습니다.
조직 설계 tracheal 이식 (TETGs) 잠재적으로 평생 면역 억제에 대 한 필요성을 피하고 있는 동안이 문제를 해결할 수 있습니다. 지난 10 년간에서 TETGs 동물 모델에서 테스트 고 동정 사용1,2,3의 드문 경우에 임상적으로 활용 되었습니다. 임상 및 큰 동물 연구에서 조직 설계 기도 교체에서 수술 복구 필요한 전투 협 수많은 개입 (정의 > 50 %luminal 좁히기) 고 기도 patency 유지. 추가 TETG 작업을 선택, vascularization와 비 계 디자인 시드 셀의 역할 평가 통해이 협 착이 증을 줄이기 위해 노력해왔다. 셀 시드 선택 및 비 계 디자인 네이티브 기관지 구조/기능을 복원 하기 위한 주로 호흡 상피 세포 및 다양 한 resorbable, 비-resorbable 및 decellularized 건설 기계에 시드 chondrocytes에 집중 되었습니다. 로 vascularization 가능성이 협의 개발에 중요 한 역할을, 다른 그룹 생체 외에서 또는 heterotopic 모델 revascularization 또는 neoangiogenesis4를 신속 하 게 최적화에 집중 했다. 그럼에도 불구 하 고, 또한 기계적으로 유능 하 고 기능 TETG를 유지 하면서 성공적인 vascularization 달성 도전 남아 있습니다. 최근 발전에도 불구 하 고 협 최소화 임상 번역 중요 한 장애물을 남아 있다.
이 histopathological 응답 TETG 주입에서 vivo에서조사, 우리 조직 설계 tracheal 교체의 양 모델을 개발 했다. 이식 혼합된 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)과 폴리우레탄 (PU) electrospun 비 계 골 파생 된 단 세포 (BM-MNCs) 시드 구성 되었다. 이 작은 일대에 우리 시드 헌 BM MNCs 다시 epithelialization 가속 및 지연 협5시연. 비록 헌 BM MNCs 향상 생존 시드는 BM MNCs 조절 기능 neotissue의 형성 세포 메커니즘 불분명 남아 있습니다.
조직의 murine 모델의 세포질 수준 필요한 개발 조사 설계 tracheal 교체. 양 연구와 마찬가지로, 우리는 BM로 시드 PET:PU electrospun 비 계 활용-MNCs. 일관성 양 모델, TETG 협 이식1,2,3 다음 첫 2 주에 걸쳐 개발 ,5. 이 murine 모델을 더 기도 협 착을 기본 셀룰러 메커니즘을 심문 이전에 관찰 병 리 지 제안 했다.
이 보고서에서 우리 조직 설계 tracheal 교체 비 계 제조, BM MNC 절연, 시드, 이식 및 이식 (그림 1, 그림 2)를 포함 하 여 마우스 모델에 대 한 우리의 프로토콜 세부.

<table><tbody><tr><td>0.9% 염화나트륨 주사</td><td>APP 제약</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>10cc 혈청학적 피펫</td><td>팔콘</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>18G 1.5in. 니들</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>25cc 혈청학 피펫</td><td>Falcon</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>25G 1in. 바늘</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>50cc 튜브</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드</td><td>Fisher Healthcare</td><td>NDC 69250-661-02</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloxacin) 솔루션</td><td>Bayer Healthcare, LLC</td><td>NDC 0859-2267-01</td><td></td></tr><tr><td>블랙 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사, 9-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T05A09N10-13</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6,</td><td>여성 잭슨 실험실</td><td>664</td><td>6-8 주 된</td></tr><tr><td>구연산염 완충제 pH 6.0 20x 농축액</td><td>ThermoFisher</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Colibri 견인기</td><td>FS</td><td>T 17000-04</td><td></td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>Fisher</td><td>Scientific 23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 14 단일 클론 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 집게</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5/45 집게</td><td>F.S.T</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 7 - 미세 집게</td><td>F.S.T</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>F4 / 80 쥐 안티 마우스 항체</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497R</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100mL</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위 - 날카로운 무딘</td><td>F.S.T</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 커버 안경</td><td>ThermoFisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield 마운팅 미디어, DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>염소-안티 마우스 IgG 보조 항체 Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>염소-안티 토끼 IgG 보조 항체 Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>염소-안티 쥐 IgG 2차 항체 Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen</td><td>Precision Dose, Inc</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>요오드 준비 패드</td><td>Professional disposables international, Inc.</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td></td></tr><tr><td>케라틴 5 폴리 클로 항체, 정제</td><td>BioLegend</td><td>905501</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염 주사</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson 겸자</td><td>FS</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>부직포 스폰지</td><td>Covidien</td><td>441401</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Dechra 수의학 제품</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PET / PU (폴리에틸렌 테레프탈레이트 & 폴리우레탄) 스캐폴드</td><td>나노섬유 솔루션</td><td></td><td>맞춤형 주문</td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TISH 바늘 홀더/집게</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>트리머</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen 스프링 가위</td><td>F.S.T</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>온수 순환기</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>자일라진 멸균 용액</td><td>Akorn 동물 건강</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 tracheal 이식의 이식

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

선 천 성 또는 보조 긴 세그먼트 tracheal 결함에 대 한 치료 옵션 역사적으로 기능 조직을 대체 하는 무 능력으로 인해 제한 되었습니다. 조직 공학 3 차원 비 계에 세포 신호 분자를 통합 하는 기능과 잠재적인 솔루션으로 위대한 약속을 보유 하고있다. 조직 설계 tracheal 이식 (TETGs)와 최근 작품 본 일부 성공 하지만 그들의 번역 이식 협 착에 의해 제한 되어, 붕괴, 이식 epithelialization 지연. 이러한 문제를 운전 하는 메커니즘을 조사 하기 위하여 우리는 조직 설계 tracheal 이식 이식에 대 한 마우스 모델을 개발 했습니다. TETGs 애완 동물 및 PU (과 % 무게)의 혼합물에 electrospun 고분자 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)과 폴리우레탄 (PU)를 사용 하 여 건설 되었다. 건설 기계 했다 다음 골 단 세포 6-8 주에서 격리를 사용 하 여 시드-그라데이션 원심 분리에 의해 오래 된 C57BL/6 쥐. 이식 당 10 백만 셀 발판의 루멘에 시드 되었고 제 3의 그리고 일곱 번째 tracheal 반지 사이 주입 전에 밤새 품 어 수 있습니다. 이러한 이식 협 착 증의 결과 정리 할 수 있었고, 조직학 분석과 면역 형광 검사에서 기저 상피 세포 각 질 5와 각 질 14의 부족에 의해 증명으로 epithelialization를 지연. 이 모델은 개장 하는 호스트에 관련 된 세포 및 분자 메커니즘을 조사 하기 위한 도구로 될 것입니다.

그림 1 에서는 TETG 시드 및 이식의 회로도를 보여 줍니다. 골 수는 C57BL/6 마우스에서 수확 했다 하 고 체 외에서배양. BM MNCs 밀도 원심 분리에 의해 분리 되었고에 TETG에 시드. 시드 TETGs syngeneic 받는 사람 C57BL/6 마우스에 이식 했다.
그림 2 는 PET:PU TETG 비 계 제조 공정에 대 한 개요 이다. PET:PU 솔루션 기본 마우스 기도을 1mm의 300 µ m 및 루멘 직경의 최종 TETG 벽 두께 달성 하기 위하여 20 G 무딘 바늘에 electrospun 이었다. TETG의 표면 스캐닝 전자 현미경 이미지 애니메이션 단 세포에서 볼 수 있습니다.
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이식 협 조직 설계 기도 교체에서 중요 한 장애물을 포즈. 협 기본 셀룰러 메커니즘을 조사, 우리 시드 골 단 세포 (BM-MNC)와 조직 설계 tracheal 교체의 murine 모델을 활용 합니다. 여기, 우리가 우리의 프로토콜을 비 계 제조, BM MNC 절연, 이식 시드, 및 주입을 포함 하 여 선발.

시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

조직 으로 설계된 기관의 임상 응용 은 접목 협착증 및 지연 된 상피화로 인해 제한되었습니다. 직교 학장 교체의 마우스 모델은 재생을 구동 하는 세포 메커니즘의 연구를 허용. 기도의 긴 세그먼트 결점은 현재 치료가 치료할 수 있는 무슨을 초과할 수 있습니다.조직 으로 설계된 기관체는 이러한 조건에 대 한 대체 기관을 만들 수 있는 잠재력을 제공 합니다. 이 모델은 형질전환 및 계보 추적 특성을 가진 동물에게 적용할 수 있습니다. 그런 다음 접목 재생에 기여하는 호스트 요인을 조절할 수 있습니다.스캐폴드 를 생성하는 주요 과제 중 하나는 전기 방사 매개 변수가 매번 동일하다는 것을 측정하고 결정하는 것입니다. 따라서 스캐폴드를 생성할 때마다 매번 스캐폴드가 동일한지 확인하기 위해 컬렉터 거리, 습도 및 온도를 측정해야 합니다. 이 모델의 성공에 중요한 것은 절차 전반에 걸쳐 자발적인 환기를 허용하는 마취의 올바른 평면의 미세 수술 기술 및 유지 보수의 정제입니다.호스트 기관체는 약 1밀리미터의 내부 직경을 가지고 있기 때문에, 이식및 네이티브 조직 처리 및 봉합사 배치는 시각적으로 가장 중요하고 가장 잘 입증됩니다. 육각형플루오로이소프로파놀에서 8중량% 폴리에틸렌 테레프탈레이트 또는 PET를 용해하고 그 결과 용액을 섭씨 60도로 가열하여 시작합니다. 용액이 따뜻해지는 동안, PET 솔루션이 냉각되면 솔루션을 결합하여 헥사플루오로이소프로판올에 3 중량%의 폴리우레탄 또는 PU를 용해합니다.폴리머 혼합물을 장착한 60밀리리터 주사기를 20게이지 블런트 팁 바늘로 적재합니다. 주사기와 바늘에 긍정적 인 14 킬로볼트로 설정 된 고전압 DC 전원 공급 장치, 또 다른 고전압 DC 전원 공급 장치를 마이너스 3 킬로볼트로 설정하고, 시간당 5 밀리리터 - 투 - 기질 거리, 그리고 1 밀리미터 직경의 스테인리스 강막대에 전기 스핀20 센티미터 팁 - 기판 거리를 사용합니다. 300 마이크로미터 스캐폴드 벽 두께가 달성될 때까지 전기 회전을 계속합니다.그런 다음, 스캐폴드를 낚싯대에서 밀어내고, 하룻밤 동안 진공 밑에 비계를 놓고 잔류 용매를 제거하고, 약 15분 동안 센티미터당 350밀리줄의 자외선 투여량으로 비계를 살균한다. 멸균 조건하에서, 6-8주 된 암컷, 미세 가위 및 마이크로 Adson 집게를 가진 C57-Black/6 마우스의 뒷다리에서 피부를 제거하고, Dumont 넘버 5 포셉과 듀몬트 넘버 5/45 포셉을 사용하여 근막과 힘줄을 제거합니다. 뼈를 분리하여 양쪽 끝에서 잘라낼 수 있도록 하고, 25게이지 바늘이 장착된 5밀리리터 주사기를 사용하여 골수를 RPMI 배지 30밀리리터를 함유한 페트리 접시에 넣습니다.모든 뼈가 플러시되면 70 마이크로미터 나일론 세포 여과기를 통해 골수를 50밀리리터 원추형 튜브로 필터링하고 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 옮긴다. 층을 혼합하지 않고 폴리수크로오스와 디아트리조아테 5밀리리터를 포함하는 15밀리리터 튜브의 측면에 여과된 단핵 세포 용액을 부드럽게 추가하고 밀도 그라데이션 분리에 의해 백색 및 적혈구로부터 플라즈마를 분리한다. 원심분리의 끝에서, 골수 단핵 세포로 구성된 중간 명확한 층을 수집하고, 원심분리에 의해 PBS에서 1 대 1 비율로 골수 단일 핵 세포를 세척한다.두 번째 세척을 위해 PBS의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 카운트에 대한 신선한 RPMI 매체의 10 밀리리터에 재서스펜션. 이어서, 추가 원심분리를 사용하여 세포를 수집하고, 신선한 RPMI 농도의 5개의 마이크로리터 당 7개의 세포로 세포를 1회 10으로 희석한다. 스캐폴드를 시드하기 전에 필요에 따라 폴리머를 5mm 길이로 자르고 5분 동안 RPMI 배지5마이크로리터로 스캐폴드를 적십합니다.인큐베이션의 끝에서, 과잉 매체를 제거하고, 골수 단핵 세포 용액의 5마이크로리터로 스캐폴드 루멘을 10분 동안 적재한다. 이어서, 스캐폴드의 루멘을 통해 21게이지 바늘을 삽입하고, 37도 섭씨 인큐베이터에 밤새 RPMI 배지의 1밀리리터에 이식편을 놓는다. 전신 마취를 유도 한 후, 받는 사람의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고, 동물의 눈에 연고를 적용합니다.턱에서 clavicles에 수술 부위에 머리를 잘라, 등대 구형 위치에 수술 패드에 동물을 배치. 무균 기술을 사용하여 순차적인 포비도요오드, 70%에탄올, 포비도오드 요오드 와이프 시리즈로 수술 부위를 소독하고 12시에 머리와 함께 해부 현미경으로 마우스를 이동시다. 미세 한 가위와 마이크로 Adson 집게를 사용하여 클라비클에서 효이드 뼈로의 중간 선 절개를 하고, Dumont 번호 5 번과 7 번 미세 포셉과 멸균 면봉을 사용하여 파시카를 청소한 후 자체 유지 Colibri 재트랙터를 절개에 삽입하십시오.집게를 사용하여 스트랩 근육을 열어 갑상선 연골, 크리피드 연골 및 기관지를 노출시키고 조직의 양쪽에서 평행하게 실행되는 재발하는 후두 신경과 기관을 무뚝뚝하게 분리한 다음 식도에서 기관체의 둘레 분리를 합니다. 20 게이지 바늘과 수술 마커를 사용하여 기관지의 전방 부분을 얼룩지게합니다. Vannas-Tubingen 스프링 가위와 듀몬트 넘버 7 미세 집게 를 사용하여 세 번째 기관 연골 반지 아래에서 절개를하여 기관지의 3링 섹션을 절제하십시오.미세 곡선 포셉으로 기관추를 잡고, 멸균 9-0 나일론 봉합사를 사용하여 흉골에 대한 기관의 단부 단부를 확보하고, 20 게이지 바늘과 외과 마커를 사용하여 접목의 전방 부분을 염색한다. 이식편을 이식하려면 9-0멸균 나일론 봉합사, 듀몬트 번호 7 미세 집게 및 바늘 홀더를 사용하여 근위 후방, 근위 측삭 및 근위 전방 바늘을 삽입하고 동물을 180도 돌립니다. 마우스가 위치에 있을 때, 일시적인 기관 절제술을 방출하고, 말단 해부학을 용이하게 하기 위해 이식편의 전방 부분에서 5밀리미터 떨어진 측면 절개를 한다.불경하를 완성하려면 봉합사를 근위 적층과 유사한 방식으로 배치하고 접목 위치와 스트랩 근육을 다시 근사화하십시오. 그런 다음, 9-0 멸균 나일론 봉합사를 실행 패턴으로 절개를 닫고, 전체 복구까지 모니터링과 가열 패드에 배치 복구 케이지에 혼자 동물을 배치합니다. 이식 후 2 주, 몇 기저 상피 세포는 조직 공학 기관 이식 조직 섹션에서 기저 세포 각질 5 및 14 염색에 의해 관찰 될 수있다.기저 세포는 또한 이식 후 7 일 에서 접목의 발광 표면에서 검출됩니다. 방호 및 조직학적 분석에 따라, 이식협은 호흡 곤란과 황장의 징후를 보여주는 이식 이식 마우스의 주요 기여 요인으로 확인되었습니다. 접목과 네이티브 기관의 텔레스코핑은 수술 기술의 결과로 일반적인 발견이다.F4/80에 대한 염색은 기저 상피 세포의 존재와 함께 접목의 스테노틱 영역 내의 숙주 대식세포를 나타낸다. 재발하는 후두 신경의 조작을 피하고, 해부학에서 밀폐 씰을 허용하기 위해 근위 및 단부 봉합사가 제자리에 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜은 생물 안전 수준 1 에이전트 마우스에서 파생된 골수 단핵 세포를 다루기 때문에 오염을 피하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

줄기 세포 식별에 중요한 돌파구가 계속 만들어지고있다. 이러한 발견을 번역하기 위해, 그러나, 세포 전달을위한 새로운 방법을 고안해야합니다. 난 여기기도는 줄기 세포 이식을위한 폐에 안전한 경로를 제공하는보고합니다.

기관 절개술 : 폐에 줄기 세포의 이식을위한 방법

이 동영상은 쇼, 생쥐의 obliterative기도 질환 (OAD)의 개발, heterotopic 및 orthotopic tracheal 이식 모델을 연구하는 두 실험 모델을 비교합니다.

Obliterative 에어웨이 질환의 발전을 연구하는 모델로 사용 마우스의 Heterotopic 및 Orthotopic Tracheal 이식

세포 및 분자 neotissue 형성에 대한 우리의 지식을 개선하기 위해, TEVG의 쥐 모델은 최근에 개발되었다. 이식은 C57BL / 6 마​​우스의 신동맥 대정맥 개재 이식으로 이식되었다. 이 모델은 우리의 임상 연구에서 달성 된 것과 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 훨씬 단축 된 시간 과정을 통해.

마우스 모델에서 하대 정맥 끼어 이식의 주입

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

Laryngotracheal 협착증은 기관 기도를 비판적으로 좁히고 효과적인 의학 치료가 결여되는 병리학적인 흉터 침착에서 유래합니다. PLLA-PCL (70% 폴리-L-락티드 및 30% 폴리카프롤락톤) 스텐트를 국소 약물 전달 시스템으로 사용하여, 기관내 흉터 증식을 감소시키는 것을 목표로 하는 잠재적치료법을 연구할 수 있다.

후두절협증을 가진 마우스에 있는 생체 적합성 약 용출 기관 스텐트의 디자인

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

이 원고의 목적은 마우스에서 이종 후두 이식을 수행하는 데 필요한 미세 수술 단계를 설명하는 것입니다. 후두 이식의 다른 동물 모델과 비교하여이 마우스 모델의 장점은 비용 효율성과 면역 학적 분석 및 데이터의 가용성입니다.

후두 이식 연구를 위한 이종 마우스 모델

쥐 폐내 기관 이식(IPTT) 모델은 폐 이식 후 폐쇄성 기도 질환(OAD)을 연구하는 데 유용합니다. 높은 재현성으로 동종 이식 후 기도 소멸에서 폐 특이적 면역학적 및 혈관 형성 거동에 대한 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 IPTT 절차와 예상 결과에 대해 설명합니다.

쥐 폐내 기관 이식: 폐 이식 후 폐쇄성 기도 질환을 조사하기 위한 모델

이 논문은 탈세포화(decellularization) 및 재세포화(recellularization) 방법을 사용하여 생체공학적 마우스 폐를 만드는 방법을 설명합니다. 또한 후속 정소성 폐 이식에 대해서도 자세히 설명합니다.

탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

여기에서는 커프 기법을 사용하여 조직 공학 혈관 이식편을 마우스 경동맥에 이식하기 위한 프로토콜을 제시하여 혈관 조직 재생 메커니즘을 조사하는 데 적합한 동물 모델을 제공합니다.

커프 기법을 통한 마우스 경동맥에 조직 공학 혈관 이식편 이식

배우세요 조직 공학 기법을 이용한 기관 이식물의 재생 메커니즘 연구 방법입니다. 마우스 모델에서 골수 단핵세포를 활용한 이식 기술을 통해 기관 협착의 세포적 원인을 규명하고 임상 적용 가능성을 평가합니다.

시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식

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