Name: 병원성 메커니즘 연구를위한 BALB / c 마우스에서 약물 유도,자가 면역 간염의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 배우세요 BALB/c 마우스에서 약물 유도 자가면역 간염 모델을 이용한 병원성 메커니즘 연구 방법입니다. 성별 차이 분석과 재현 가능한 실험 기법을 통해 간 질환의 발병 과정을 심층 탐구할 수 있습니다.

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Njoku 박사는이 모델의 공식화를 초래 한 그의 지침과 통찰력있는 토론에 대해 Dr. Noel R. Rose, MD PhD를 인정하고 싶습니다.

<ol><li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune+liver+disease%3A+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li>
<li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+presentation%2C+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li>
<li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%3A+a+diagnostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li>
<li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li>
<li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li>
<li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+drug-induced%2C+immune-mediated+hepatitis%2C+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3%2B+T-cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li>
<li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+hepatitis%3A+disease+induction%2C+time+course+and+T-cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li>
<li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li>
<li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+bias+in+experimental+immune-mediated%2C+drug-induced+liver+injury+in+BALB%2Fc+mice%3A+suggested+roles+for+Tregs%2C+estrogen%2C+and+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).</li>
<li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li>
<li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li>
<li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li>
<li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li>
<li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+adducts%2C+circulating+antibodies%2C+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li>
<li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li>
<li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li>
<li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity%3A+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li>
<li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li>
<li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+metabolism%3A+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li>
<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
</ol>

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이 프로토콜의 강점은 재현성에 있습니다. 따라서 제안 된 단계를 준수하는 것이 중요합니다. 면역원의 제형은 일부에 대한 장벽이 될 수 있고; 그러나 우리는 문서에 설명 된 에피토프를 사용하여 모델을 재현하여 간장의 S100 분획을 분리 할 필요가 없습니다. 추가적인 에피토프 또는 단백질이 변경되어 면역화 후 간염을 유발할 수 있을 가능성이 높습니다. 그러나 우리는 신뢰할 수있는 결과와 함께 사용한 단백질을 설명합니다. 몇몇 단백질은 할로겐화 마취제 노출시 트리플루오로아세틸화되는 것으로 입증되었다. 에피토프 확산으로 인해 가장 가능성이 높으며, 이들 단백질 중 일부는 또한 그들의 천연, 비트리플루오로아세틸화 상태에서 자가항체의 표적이 된다. 일례로서, 피루베이트 데하이드로게나제 복합체 (PDH-E2)의 E2 서브유닛은 TFA-부가물 내의 TFA-모이어티에 대한 구조적 유사성을 갖는 에피토프 (리포산 보철 그룹)를 운반한다. 할로탄 간염 환자에서 생성된 항체는 TFA-단백질 및 PDH-E2 20,21...

이 방법의 목적은 생체 내에서 발생하는 약물 유도 자가면역 간염의 마우스 모델을 기술하고이 질병의 분자적, 면역 학적 및 유전 적 기초를 조사하는 데 어떻게 활용 될 수 있는지 입증하는 것입니다. 우리 연구의 장기적인 목적은 감수성 환자에서 DIH를 연구함으로써 만성 간 염증 및 부상의 발달을 담당하는 메커니즘을 밝히는 것입니다. 간 질환과 간경변은 25 세에서 64 세 사이의 성인에서 여섯 번째로 흔한 사망 원인을 구성합니다. 약물 유발 자가면역 간염(DIH)이라고도 하는 특발성 DILI는 미국에서 급성 간 기능 부전의 세 번째로 흔한 원인입니다. DIH는 자가면역간염 1형 간염 환자의 약 9~12%에서 관찰되는 가장 흔한 간 약물-유도성 과민증 과정이다. DIH 환자의 압도적 인 대다수는 여성 2,3,4입니다. DIH의 유형은 이소플루란, 세보플루란, 데스플루란 또는 할로탄과 같은 할로겐화 휘발성 마취제를 투여한 후 감수성이 있는 개체에서 발생합니다. 이러한 마취제는 신진 대사의 반응성 산물과 간 단백질에 공유적으로 결합하여 알레르기 또는 자가면역 반응을 유도 할 수있는 새로운 자기 항원을 만듭니다5.
마취제 및 DIH의 모든 형태의 개발에 관련된 병원성 메커니즘에 대한 연구는 이전에 인간 질병의 유도를 밀접하게 모방하는 동물 모델의 부족으로 인해 방해 받았다. 우리는 환자에서 면역 매개 DILI와 유사한 기능을 가진 DIH의 실험적 뮤린 모델을 개발했습니다. 간염은 시토크롬 P450 2E1(CYP2E1)5 효소에 의해 마취제의 산화 대사 후 형성되는 트리플루오로아세틸 클로라이드(TFA) 대사산물에 의해 공유적으로 변형된 두 개의 자가항원 중 하나로 면역화에 의해 유도된다. 하나의 자가항원은 여러 단백질6의 혼합물인 간 세포질 S100 간 분획이고, 두 번째 자가항원은 마취성 면역 매개 DILI7을 갖는 환자로부터 혈청에 의해 인식되는 CYP2E1의 에피토프이다. 실험적 자가면역간염에 비교적 내성이 있는 BALB/c 마우스를 사용하여 C57Bl/6J 마우스8의 자가면역간염의 S100 유도 면역화 모델과 모델을 구별합니다.
다양한 임상 프리젠 테이션 때문에 DIH는 환자에서 연구하기가 어렵습니다. 번역 실험 모델은 생체내 및 시험관 내에서 질병의 발병기전을 평가하는 능력을 제공한다. 현재, DIH를 유도하기 위한 다른 대안적인 방법은 동물의 사용 없이 생체내 또는 시험관내 적응성 또는 선천적 면역 반응을 완전히 검사하는 것이 아니다. 더욱이, S-100 또는 CYP2E1 에피토프의 트리플루오로아세틸화는 자극성 면역원을 생성하는 것으로 보이지 않으며, 우리는 TFA 변경된 단백질로 면역화함으로써 DIH를 유도하고 있기 때문에, 이들 동물은 면역화 또는 다른 절차 전에 에테르, 할로겐화 마취제, 바르비투레이트 또는 알코올을 투여받지 않을 것이며, 이러한 제제가 우리가 연구하고있는 파라미터를 바꿀 수 있다는 점을 고려한다. 그럼에도 불구하고, 우리는 컴퓨터 시뮬레이션을 활용하여 발견 된 CYP2E1 에피토프9 의 결합 선호도를 확인하고 여성 BALB / c 마우스가 더 심한 DIH10을 개발한다는 것을 보여줌으로써 여성의 성별을 암시하는 인간 DIH를 미러링함으로써 마우스 사용을 줄였습니다.
환자에서 DIH의 다양한 제시와 임상 질환 연구의 도전에도 불구하고, 반응성 약물 대사 산물에 의한 천연 단백질의 번역 후 변형은 할로겐화 마취제11을 따르는 DIH 병인에서 받아 들여지는 핵심 메커니즘입니다. 조사관들은 또한 CYP2E1이 이 과정12,13에서 주요 자가항원이라는 것을 받아들인다. 번역 후 변형된 CYP2E1 및 기타 간 단백질을 인식하는 인터루킨(IL)-4-상향조절된 CD4+T 세포의 역할은 호중구, 호산구 및 비만 세포를 간(14)으로 유인함으로써 마취 DIH의 수용된 개시제이며, 이 기전은 DIH15,16의 여러 형태에서 확인되었다. 유도된 FoxP3-발현 CD4+CD25+T 세포 (Tregs)는 DIH의 중증도를 감소시키고, 비장에서 이들 세포의 상대적 결핍은 DIH 10,7을 악화시킨다. 따라서, DIH를 이해하는 진보의 대부분은 생체내 및 시험관내 DIH의 유전적, 대사적 및 면역학적 메카니즘을 평가하기 위해 생체내 마우스 모델을 활용함으로써 가능하게 되었다.
우리와 다른 연구자들이 다른 마우스 모델을 사용하여 DIH를 개시하는 과정에서 IL-4, 호중구 및 호산구에 대한 역할을 밝혀 냈기 때문에이 관찰은 사용 된 DIH 모델에 관계없이 간염 및 부상이 IL-4에 의해 유도된다는 우리의 주장을 뒷받침한다고 믿습니다. 우리의 프로토콜의 강점은 수컷 및 암컷 마우스 모두의 생체 내 방법론의 활용과 조직학, CD4+ T 세포 증식 분석 및 사이토카인의 반복에 있습니다. 시험관 내 연구의 우리의 사용의 강점은 DIH를 유도하는 세포 상호 작용을 분리하는 방법론을 제공하면서 필요한 생쥐의 수를 줄인다는 것입니다. 우리는 수컷과 암컷 마우스의 사용을 권장하는데, 이는 결과의 해석에서 무의식적 편향의 가능성을 줄이고 DIH의 발생률, 유병률 및 중증도가 여성17에서 더 높기 때문에 우리 연구의 번역 잠재력을 강화하기 때문입니다. 마우스는 단일 공급 업체에서 얻는 것이 좋습니다. 그러나 이것이 가능하지 않다면 유전자 변형 마우스와 동일한 공급 업체로부터 깔짚 메이트 대조군 또는 야생형 마우스를 얻으십시오.

<table><tbody><tr><td>0.1% 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산 (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP 기판 키트</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 마우스</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; CFSE 세포 증식 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>일반 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&trade; 세포 동결 보존</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable 아쿠아 데드 셀 염색 키트&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>백일해 독소</td><td>목록 생물학적 제제</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 pH 7.4</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피어싱&트레이드; 프로테아제 억제제 미니 정제, EDTA 무료</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer 투석 카세트 (10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade; SDS 솔루션, 10%</td> <td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, 페놀 레드</td><td>없음 ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

병원성 메커니즘 연구를위한 balb / c 마우스에서 약물 유도,자가 면역 간염의 유도

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

약물-유도성 자가면역간염(DIH)은 자가면역간염 환자의 약 9~12%에서 관찰되는 가장 흔한 간약물 유도성 과민화 과정이다. DIH 환자의 압도적 인 대다수는 여성입니다. 유병률에서 이러한 성별 차이의 근본적인 메커니즘은 인간의 질병을 모방 한 동물 모델의 소박함 때문에 명확하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 근본적인 메카니즘은 인간 백혈구 항원 일배체형 및 성 호르몬과 관련되는 것으로 널리 믿어지고 있다. 대조적으로, DIH 마우스 모델을 사용하여, 우리는 IL-4 개시 CD4+ T 세포가 시토크롬 P450 2E1의 에피토프에 대해 지시된 것을 밝혀냈고, 이는 여성 BALB/c 마우스의 간으로의 호중구, 대식세포 및 비만 세포의 유입을 유도한다. 이 모델을 사용하여, 우리는 또한 IL-33-유도된 FoxP3+조절 T 세포가 암컷 및 수컷 마우스에서 DIH에 대한 보호를 부여한다는 것을 보여주었다. 이 DIH 모델은 DIH와 관련된 약물 대사 산물과 공유적으로 변경된 CYP2E1의 에피토프로 마우스를 면역화함으로써 유도된다. 이러한 에피토프는 DIH 환자에 의해 인식된다. 우리의 방법은 DIH의 발병 기전을 연구하는 데 활용할 수있는 강력하고 재현 가능한 간염 및 자가항체를 유도합니다. 생체내 연구가 부적절하게 행해질 때 마우스에서 과도한 통증과 고통을 야기할 수 있지만, 생체내 모델의 장점은 다수의 마우스에서 질병의 발병기전을 평가할 수 있다는 것이다. 또한, 변경된 간 단백질의 생물학적 효과는 침습적 인 절차를 사용하여 연구 할 수 있습니다. 시험관 내 연구를 실험 설계에 추가하면 세포 수준에서 신속한 반복 및 기계론적 분석이 가능합니다. 따라서, 우리는 우리의 모델 프로토콜과 DIH의 생체 내 및 시험관 내 메커니즘을 연구하는 데 어떻게 활용 될 수 있는지 입증 할 것입니다.

도 1에 도시된 DIH를 유도하기 위해 활용된 면역화 스케쥴은 목의 기저부(제0일제)와 꼬리의 기저부(제7일제)에서 요구되는 두 개의 면역화를 나타낸다. 도 2는 마취제의 CYP2E1, JHDN5, CYP2E1 에피토프 및 트리플루오로아세틸(TFA) 대사산물에 반응하여 CFSE를 사용하여 14일째에 수득된 대표적인 증식 데이터를 보여준다. 도 3은 14일째에 수득된 유도된 CD4+CD25+FoxP3+ Tregs의 게이팅 전략 및 대표적인 유세포 분석 분석을 보여준다. 도 4는 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색된 슬라이드를 나타내며 21일째 6일째에 간염의 진화를 입증한다. 도 5는 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색된 슬...

우리는이 질병에서 볼 수있는 성별 차이를 포함하여 약물 유발 자가면역 간염의 발병 기전을 연구하는 데 활용할 수있는 BALB / c 마우스의 생체 내 예방 접종, 번역 형 간염 모델을 설명합니다. 우리는이 모델이 생체 내 및 시험관 내 실험 기술을 사용하여 재현 가능한 분석을 시연하는 방법을 설명 할 것입니다.

병원성 메커니즘 연구를위한 BALB / c 마우스에서 약물 유도,자가 면역 간염의 유도

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

간 질환과 간경변은 25세에서 64세 사이의 성인에서 6번째로 흔한 사망 원인입니다. 약물 유발 간염, 자가면역 간염 또는 면역 매개 간염이라고도 하는 특이성 DILI는 미국에서 급성 간부전의 세 번째로 흔한 원인이며 가장 흔한 간 약물 유발 저감작 과정입니다. 이 과정은 자가면역 간염 환자의 약 9-12%에서 발생하며, 이러한 형태의 간염은 약물이 상업 시장에서 제거되는 가장 흔한 이유입니다.약물에 의한 간염 환자의 압도적 다수는 여성입니다. 이 프로토콜은 간염, 자가항체 및 성별 차이와 같은 환자에서 볼 수 있는 중요한 특징을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 마우스 모델에서의 재현성으로, 과학자들은 질병의 발달과 그 후유증을 관찰할 수 있습니다.이 프로토콜을 사용하여 마취제 및 바이러스성 간염에서 흔히 볼 수 있는 진원결정인자(epitope)를 발견했는데, 이 항원결정기는 마취성 간염 환자에서 우세한 항원결정기이며, 바이러스성 간염 환자의 섬유증과 유의한 관련이 있습니다. 우리는 이 정보가 약물 유발 또는 바이러스성 간염 또는 관련 섬유증에 대한 특정 진단 검사를 개발하는 데 사용될 수 있다고 믿으며, 이를 통해 이 질병 또는 그 후유증이 발생할 위험이 있는 개인을 예측할 수 있기를 바랍니다. 서면 기술은 결과의 재현성을 보장하기 위해 항상 여러 가지 견제와 균형을 사용하기 때문에 압도적일 수 있습니다.처음 실험을 할 때는 충분한 시간을 갖는다. 첫 번째 시도 후에는 꽤 빨리 진행됩니다. BALB/c 마우스의 안락사 후 정중선 절개를 사용하여 미세 수술 가위로 복강 내 내용물을 노출시키고 하대정맥을 작게 절개하여 혈액을 제거합니다.그런 다음 24게이지 혈관 카테터를 문맥에 삽입합니다. PBS를 섭씨 4도의 수조에 보관하고 연동 펌프를 사용하여 분당 10ml의 속도로 40ml의 PBS를 간에 주입합니다. 마이크로 가위를 사용하여 복부에서 간을 조심스럽게 분리하고 무게가 재진 무게를 잴 보트에서 간의 무게를 잰다.간을 10-15mm의 작은 조각으로 자른다. 원고에 따르면 간 샘플과 쥐 간 무게의 4배인 균질화 완충액을 15ml 폴리프로필렌 튜브에 넣고 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 정제를 보충합니다. 일반 실험실 조직 균질기를 중간 속도로 사용하여 얼음 위에서 샘플이 부드러워질 때까지 균질화합니다.간을 1, 10 분 동안 500 시간 G에 균질화하고 100, 000 시간 G에 다시 원심분리 후에 상등액 cytosolic S100를 떨어져 따르고, 드라이 아이스에 있는 상농 cytosolic S100를 스냅 동결하고 영하 80 섭씨 온도에 관을 얼린다. 트리플루오로아세틸화를 시작하려면 S100을 실온에서 해동합니다. 그런 다음 삼각 플라스크에 마우스 S20 mg을 100 밀리리터로 희석하여 탈이온수로 추출합니다.pH 측정기를 사용하여 1-normal 수산화칼륨으로 pH를 10으로 조정합니다. 흄 후드에서 용액에 4.7밀리몰의 S-ETFA를 추가합니다. 약 1시간 동안 1-normal 수산화칼륨을 물방울 형태로 투여하여 pH를 9.9에서 10.0 사이로 유지합니다.각 반응에 대한 수산화칼륨의 총 부피를 기록합니다. 용액을 별도의 투석 카세트로 옮깁니다. 카세트를 4리터의 탈이온수에 넣어 하루에 세 번 갈아주면서 72시간 동안 투석합니다.투석 후 트리플루오로아세틸화 S100의 최종 부피를 기록한 다음 표지된 튜브에 부분 표본을 넣습니다. 튜브를 드라이아이스에 스냅 얼려 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 원고에 따라 단백질 농도가 결정된 상태에서 1밀리리터당 1밀리그램 이상인 경우 별도의 총알 튜브에 있는 1밀리리터의 탈이온수에 각 네이티브 및 TFA 변형 단백질 1밀리그램을 첨가합니다.1ml의 탈이온수를 사용하여 총알 튜브에 블랭크를 준비합니다. 96웰 플레이트에 50마이크로리터의 블랭크 단백질, 네이티브 단백질 및 변형된 단백질을 각각 복제하여 추가합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 4 % 중탄산 나트륨 용액을 첨가 한 다음 50 마이크로 리터의 0.1 % 2, 4, 6- 트리니트로 벤젠 술폰산을 각 웰에 첨가합니다.플레이트를 섭씨 40도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 각 웰에 50 마이크로 리터의 10 % SDS를 첨가 한 다음 25 마이크로 리터의 1- 일반 염산을 첨가합니다. 마우스의 면역 및 마취 후 미세 수술 가위를 사용하여 복강강을 노출시킵니다.비장을 확인합니다. 척추경에서 비장을 잘라 2%의 태아 송아지 혈청이 함유된 PBS가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 세포를 분리하려면 두 개의 젖빛 유리 슬라이드 사이에 비장을 끼우고 함께 문지릅니다.전자 피펫을 사용하여 셀을 50ml 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 세척하려면 2%FCS가 포함된 PBS를 튜브에 추가하여 50밀리리터의 부피에 도달하고 탁상형 냉장 원심분리기를 사용하여 335배 G로 원심분리합니다. 상층액을 붓고 세척 단계를 반복합니다.ACK 용해 완충액 1ml를 튜브에 넣고 적혈구를 제거하기 위해 1분 동안 세척합니다. 그런 다음 FCS가 보충된 PBS 세척 단계를 반복합니다. 30분 동안 CFSE로 세포를 라벨링한 후 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 72시간 동안 라벨링된 세포를 자극하기 위해 시토크롬-P450 2E1, JHDN5 또는 트리플루오로아세틸화 오알부민을 밀리리터당 10마이크로그램씩 첨가합니다.배양 후 얼음에서 30분 동안 1:100의 비율로 알로피코시아닌으로 표지된 CD4로 세포를 염색합니다. 원고에 기술된 대로 면역된 마우스의 개복술 후, 25게이지 바늘로 문맥을 캐뉼링한 다음 신장 정맥 아래의 하대정맥을 절단합니다. 섭씨 37도의 수조에서 분당 10ml의 유속으로 40ml의 PBS를 각 간에 관류합니다.관류 후 미세 수술 가위를 사용하여 간 척추 경에서 간을 자르고 담낭을 제거한 다음 골목에서 간을 자릅니다. 300메쉬 스테인리스 스틸 체에 20ml 멸균 주사기 절구공이와 차가운 PBS를 사용하여 간을 파괴합니다. 스크린을 사용하여 생성된 세포 현탁액을 50ml 사전 멸균된 원심분리 튜브로 필터링합니다.차가운 PBS를 사용하여 각 현탁액을 50ml로 가져온 다음 370회 G에서 10분 동안 원심분리로 현탁액을 세척하고 상등액을 버린 다음 처리를 통해 펠릿을 새로운 50ml 튜브로 결합합니다. PBS에서 35% Percoll 45밀리리터와 헤파린 밀리리터당 100 국제 단위로 결합된 펠릿을 현탁합니다. 그런 다음 각 튜브를 섭씨 20도에서 10분 동안 500배 G로 돌립니다.상등액을 버리고 펠릿을 PBS 5밀리리터에 현탁시킨 다음 각 펠릿에 1밀리리터의 ACK 용해 완충액을 첨가하고 얼음에 10분 동안 보관합니다. 370배 G에서 원심분리로 PBS로 다시 세척한 후 상등액을 버리고 FCS 보충 PBS로 세포를 370회 G.Using에서 10분 동안 원심분리로 세척합니다. 이 실험에서 CD4+T 세포 면역 반응은 유세포 분석을 사용하여 측정되었습니다.대표적인 증식 데이터는 트리플루오로아세틸 대사산물인 시토크롬-P450 2E1, 시토크롬-P450 2E1 에피토프, JHDN5에 대한 반응으로 CFSE를 사용하여 14일에 얻어졌다. 항원이 없는 웰을 대조군으로 사용하였다. 대조군과 비교했을 때, BALB/c 마우스는 트리플루오로아세틸화 오브알부민과 사이토크롬-P450 2E1에 대한 반응으로 증식이 발생했지만 JHDN5는 그렇지 않았습니다.TFA가 완전한 Freund 보조 면역에서 유화된 지 3주 후, 암컷 BALB/c 마우스는 수컷 BALB/c 마우스에 비해 약물 유발 자가면역 간염이 더 많이 발생했습니다. 간 조직의 조직학적 분석은 또한 수컷 마우스보다 암컷 마우스에서 더 심각한 간염 염증을 보여줍니다. 간 CD4+CD8+NK+ 및 NKT+세포의 수는 남성보다 여성에서 유의하게 높았다.이 쥐들 사이에서 B 세포의 차이는 보이지 않았지만 하루가 길지만 이 제형은 오래 지속된다는 것을 기억하십시오. 이 절차는 에피토프를 트리플루오로아세틸화하기 위해 수행할 수도 있습니다. 이 절차를 통해 연구자들은 간 질환 발달의 시간 경과를 분석하고 단백질과 경로의 새로운 발견 가능성을 높일 수 있었습니다.S-에틸트리플루오로티오아세테이트는 독성이 있으므로 흄 후드에서 처리해야 합니다. 또한 좋은 실험실 실습과 기술을 강력히 권장합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 어떻게 조직 병리학하여 심각도를 평가하기 위해 SJL 마우스 및 면역 hypophysitis를 유도하는 방법을 보여줍니다.

SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

주요 인간 autoantigen을 표현 아데노 바이러스와 생쥐의 감염은 CYP2D6의 광범 간염, 섬유증 및 생성을 특징으로 면역 - 매개 간 질환의 영구적인 형태로 제 2 형자가 면역 간염 결과에서 고통받는 환자 세라 인정 P450 2D6 (hCYP2D6)를 시토크롬 특정 면역 반응.

CYP2D6 동물 모델 : 마우스에 면역 간염을 유발하는 방법

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

여기에서는 syngeneic CD4+CD45RBhigh T cell을 T 및 B cell 결핍 수용자로 이식하여 마우스에서 결장 염증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 임상적 및 조직병리학적 특징은 인간의 염증성 장 질환을 모방합니다. 이 방법을 사용하면 결장 염증의 시작과 질병의 진행에 대한 연구를 할 수 있습니다.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

bm12 림프구가 C57BL/6 수용자로 이식되는 것은 전신 홍반성 루푸스의 확립된 모델입니다. 여기에서는 이 모델을 사용하여 질병을 시작하는 방법과 유세포 분석을 통해 T 여포 보조 세포, 생식 중심 B 세포 및 형질 세포를 특성화하는 방법을 설명합니다.

C57BL / 6 마​​우스의 전신 홍 반성 루푸스의 BM12 유도 성 모델 (SLE)

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/-- 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

배우세요 BALB/c 마우스에서 약물 유도 자가면역 간염 모델을 이용한 병원성 메커니즘 연구 방법입니다. 성별 차이 분석과 재현 가능한 실험 기법을 통해 간 질환의 발병 과정을 심층 탐구할 수 있습니다.

병원성 메커니즘 연구를위한 BALB / c 마우스에서 약물 유도,자가 면역 간염의 유도

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