Name: Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 lck:eGFP 제브라피시를 이용한 악성 및 비악성 B 세포 분리 기법으로, 소아 백혈병 연구와 적응 면역 체계 이해에 활용할 수 있습니다.

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우리는 메 간 말론-페레즈 zebrafish 관리, 그리고 OUHSC 흐름 cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 현대 바퀴, 오클라호마 센터 발전의 과학 기술 (HRP-067), NIH/NIGMS INBRE 파일럿 프로젝트 수상 (P20 GM103447)에 대 한 희망에서 교부 금에 의해 지원 되었다. JKF 일정 & 델 마 게이 부여의 자에서 소아 혈액학-종양학 어린이 병원 재단의 보유합니다.

제 브라와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 오클라호마 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 되었다.
1. 유전자 변형 lck:eGFP 생선 에서 비 악성 B 및 T 림프 구 분리
<ol><li>물고기 물고기 시스템 물에 0.02 %tricaine (MS-222)를 사용 하 여 anesthetize</li>
	<li>제 브라와 다른 teleosts14의 아가미 구멍의 dorsomedial 측면에 있는 형광 thymi에 대 한 2-6 달 오래 된 물고기를 검사 합니다. (470/40 여기 파장과 525/50 방출 필터) GFP를 감지 하는 epifluorescence 현미경을 사용 합니다.</li>
	<li>로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 포함 1% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 (정렬 미디어) x 필터 살 균 1의 50 mL를 사전에 준비 합니다. 사용 하지 않는 정렬 미디어 4 ° C에서 최대 2 개월까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>0.2% 들어 있는 비 커에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사 약 5 분, Tricaine 뒤에 얼음 목욕 침수. Opercular (길) 움직임의 정지에 의해 죽음을 확인 합니다.</li>
	<li>안락사 물고기를 페 트리 접시에 놓고 GFP+ thymi14, 그리고 밝은 분야 현미경 검사 법 설정을 신장 골 수, 비장15를 해 부 해 부에 형광 현미경을 사용 하 여 관심사의 림프 기관 해 부 합니다. 여기에 제시 된 결과 3 개월 된 물고기를 사용 하 여 얻은 했다. 림프 구 비율과 절대 수 나이 및 유전자 형 (추가 세부 사항에 대 한 토론 참조) 마다 다릅니다.</li>
	<li>각의 해 부 기관 미디어 정렬 감기 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배치 합니다.</li>
	<li>유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 얼음에 조직 균질</li>
	<li>무 균된 조직 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 35 µ m 메쉬 필터를 통해 전달 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.</li>
</ol>2. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; lck:eGFP 제 브라 에서 악성 세포 분리
<ol><li>
2-4 개월에 시작에 불과합니다, 미세 스크린 rag2:hMYC; 비정상적인 GFP 패턴에 대 한 lck:eGFP 물고기. 참고: B 세포는 GFPlo lck:eGFP 배경에서 그래서 B-모든 필요 인식; 연습 T-모든 때문에, T 세포는 GFP안녕하세요. 결과적으로는 rag2:hMYC, lck:eGFP 듀얼-유전자 변형 라인은 두 개의 고기: 밝은 형광 T-모두, 일반적으로 thymus에서 발생 하 고 몸과 어렴풋이 형광 B-모든으로 확장.<ol>
<li>형광 현미경을 사용 하 여 화면 (200 ms, 2.4 x 이득) 밝은 T-모든 (그림 1A) 및 "높은 노출" 파악 "낮은 노출" 설정을 사용 하 여 물고기 (1.5 s, 3.4 x 이득) dim B-모든 (그림 1A)를 식별. WT 컨트롤 및 사전 leukemic 물고기 GFP thymus (그림 1B)에 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anesthetize 고 1.1-1.2 단계에서 설명한 대로 물고기를 검사 하십시오.</li>
	<li>간단한 3 카테고리 시스템을 사용 하 여 GFP 형광의 정도에 따라 생선을 분류: 참고: 레벨 1: 형광만 제한 지역 확산 thymic 종양으로 나타납니다. 레벨 2: thymus, 관련 된 넘어 형광 표시 < 신체의 50%. 레벨 3: 형광 신체의 50% 넘어 확장 됩니다.</li>
	<li>암 없는 그 모든 물고기를 구분 합니다. 모니터링 미리 leukemic 물고기 (GFP+ 종양 즉, 생선) 한 번 매달의 새로운 개발에 대 한. ~ 9 개월, 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기 개발 T-모든, B-전체, 또는 둘 다.</li>
	<li>T 또는 B 모든 세포 격리를 위한 선택 레벨 3 물고기 (모든 관련 > 본문의 50%)는 항복 2 x 10 이상6 셀을 모두, 그리고 더 일반적으로 많은.</li>
	<li>1.4 단계 에서처럼 물고기 안락사 참고: 모든 세포를 얻기 위해 두 가지 방법이 있다: 균질 및 복 막 세척 기술16몸 전체. 따라서, FACS 양의 시간이 필요 하 고 비용과 방법 셀 정렬, 수집된의 절대 수에 다 (더 자세한 내용 참조).</li>
	<li>두 메서드 중 하나에 대 한 먼저 안락사 물고기 페 트리 접시에 놓고 thymic 지역을 포함 한 머리 제거 면도칼 블레이드를 사용 하 여. 이 수는 별도로 처리, 원하는, 또는 조직학 얼룩에 사용 하는 경우.</li>
	<li>
복 막 세척 방법
	<ol>
<li>P1000 피 펫을 사용 하 여 씻어 감기 미디어, 세포와 미디어 5 mL 튜브에 수집을 정렬의 500 µ L로 생선 복 막 구멍.</li>
		<li>신선한 피 펫 팁을 사용 하 여, 신체 구멍으로 차가운 정렬 미디어의 추가 200-300 µ L를 주사. 다음, 신체 구멍에서 세포를 돌출 시킬 물고기 몸에 부드러운 압력을 적용는 피 펫의 끝을 사용 하 여. 이 미디어를 수집 하 고 5 mL 튜브에 추가.</li>
		<li>2.8.2 단계 2-3 회 반복 합니다. 얼음에 미디어를 정렬에 수집 된 셀을 계속.</li>
		<li>35 µ m 메쉬 흐름 cytometry/FACS 전에 필터링 하 고 분석까지 얼음에 셀을 계속 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
몸 전체 균질
	<ol>
<li>생선 머리를 제거 후 미디어 정렬의 200 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 시체를 놓습니다.</li>
		<li>유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 본문 균질</li>
		<li>감기 미디어 정렬의 추가 300 µ L를 추가 합니다. 하지만 35 µ m 메쉬 필터 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 필터에 조직 파편만 남아 때까지 필터를 통해 모든 셀을 세척 하는 데 필요한 정렬 미디어를 추가 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cytometric 분석 정상 또는 악성 B 세포의
<ol><li>흐름 cytometric 분석 및/또는 제조 업체의 설명서에 따라 FACS 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	<li>
처음 샘플을 특성화 하는 이벤트의 원하는 번호를 취득 합니다. 1 x 104 5 x 10 후속 정렬 단계에 대 한 특정 게이트 결정을 정렬 하기 전에4 이벤트를 분석 합니다.
	<ol>
<li>결정 문: 림프 구 및 조상 세포 게이트 앞으로 산포 (FSC) 및 세포질 파편 (그림 2A-C)17제외 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 정의. FSC 그리고 SSC 셀 크기/직경 및 세분성에 각각 해당합니다. 참고: GFP-, GFP소호, 그리고 GFP안녕하세요 셀이이 인구 간단 합니다 (그림 2-5)의 분리를 만드는 10-에-100-배 그들의 GFP 형광 강도 측면에서 다릅니다. 살고 죽은 차별이 시점에서 propidium 요오드 (PI) 또는 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) 생존 얼룩을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 이전 실험 PI와 일반적으로 입증 > FACS 후 GFP+ 세포의 생존 능력 95%.</li>
		<li>사용 중인 FACS 기계의 매개 변수에 따라 셀 남자를 제외 합니다.</li>
		<li>림프 및/또는 전조 게이츠 내 수 및 GFP+ 세포의 백분율을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GFPlo GFP안녕하세요 셀 대 대 게이트 GFP- 에 대 한 정의 phycoerythrin (PE) 및 GFP 농도 사용 합니다. 참고: Dim GFP 형광을 전시 하는 B 세포와 T 세포 lck:eGFP 라인에 밝은 GFP를 표시. 많은 림프 기관 또는 종양 샘플 포함 모두 GFP+ 인구. B 계보 세포/B-모든 GFPlo 와 T-계보 세포/T-모든은 GFP안녕하세요. GFP-, GFPlo및 GFP안녕하세요 셀, 사이 구별 하는 게이트를 정의 하 고 이러한 인구를 별도로 수집(그림 2A-C, 그림 3A-C, 그림 4A 와 그림 5A).</li>
	<li>미디어, 정렬의 2 개 mL를 포함 하는 다른 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 또는 추가 분석 (예를 들어, RNA, DNA, 또는 단백질 추출, 여 보세요-이식 등)에 대 한 적절 한 버퍼를 포함 하는 다른 1.5 mL 튜브에 직접 각 세포 인구를 정렬 합니다.</li>
	<li>얼음 추가 분석 이전에 순화 된 셀을 유지.</li>
</ol>

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<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
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<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

저자는 관심의 충돌을 선언합니다.

우리가 개발 하 고이 B 계보 레이블3,4다른 D. rerio 모델에 추가 하는 것은 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish에서 B 세포 격리 프로토콜을 제공. 약간 의외로, GFP로 B 셀이이 라인의 식별이 갔다 2004 년에 그것의 설명부터 주목. 일반적으로, lck 는 T 세포 관련6, 간주 됩니다 하지만 최근 연구 발견 예기치 않은 lck 식 자연 킬러에 의해 및 골수성 세포, 또한 같이18,19B 세포에서. 우리의 발견 zebrafish B 세포 GFPlo, 사전-B, 순진한, 그리고 성숙 B와 인간에서 세포 또한 LCK<sup class="xr...

Zebrafish는 강력한 특성, 유전자 manipulability, 높은 통치, 광학 반투명, 급속 한 발전 등 유전자 방법을 사용 하 여 공부 척추 개발을 용이 하 게 제공 합니다. Teleost 및 포유류 조의 공유 기능과 함께 이러한 장점을 D. rerio 애벌레 성인 기 동안에 그들의 가장 이른 외관에서 lymphopoiesis 및 림프 구 기능 vivo에서 분석에 적합 확인합니다. Zebrafish에 혈액 개발, 포유류와 공유 하는 잘 보존 유전 프로세스에 의존 하 고 이러한 적응형 면역 체계에 확장. 또한, 림프 개발을 경 세 하는 분자 메커니즘은 너무나 zebrafish 및 포유류1사이 보존 하 고.
지난 2 년간 유전자 변형 D. rerio 라인 그 레이블 특정 혈액 계보 그리고 돌연변이 라인 결핍이 계보에 생성 된2,3,,45. 이 lck:eGFP 유전자 변형 라인 중 하나 GFP 식6드라이브 zebrafish 림프 구 단백질 티로신 키 니 아 제 (lck) 발기인을 사용 하 여. 높은 T-혈통 선구자와 성숙한 T 세포에 의해 표현,이 유전자 vivo FACS7thymic T 세포 개발의 및 T-계보 세포의 생체 내 정화 전 추적에서 있습니다. 이전에 우리 사용이 줄 앞으로 유전 ENU mutagenesis 화면에 T-모든 경향이 생식 돌연변이 식별 하 고 somatically 인수 유전자 T 셀 발암8,9에 연결 된 이벤트를 공부 하.
최근, 우리 연구소는 더 lck:eGFP zebrafish의 유틸리티 확장. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC (인간 MYC), T-모든 10, 개발 된 lck:eGFP D. rerio 에서 우리가 발견 B 계보도11를 발생 하는 모든. T-모든 높은 GFP 식 인해 밝은 형광,이 모델에서와 달리 B-모든은 어렴풋이 형광 수준 때문에 낮은 GFP, B-모든 구별 될 조잡 한 그 T-모든 형광 현미경 검사 법에 의해를 가진 물고기를 수 있도록. 이 차동 GFP 식 또한 허용 GFP로 B-모든 세포의 분리에서 GFP안녕하세요 FACS11를 사용 하 여 T-모든 셀. 또한, 낮은 lck 식 고유 하지 않습니다 제 B-전체, 브라를 LCK11,12의 인간의 B-모든 익스프레스 또한 낮은 수준으로. 마찬가지로, D. rerio, 쥐, 및 인간의 정상적인 B 계보 세포는 또한 lck의 저급을 표현 /LckLCK, 미 성숙한 B 세포와 데 높은 식11,13. 셀 당 기준 lckeGFP zebrafish 또는 파생 라인에 B 계보 세포 표현 1-10% 만큼 GFP T 림프 톨으로. 이러한 GFP로 표현 특성 등 pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, B 세포 mRNAs 세포와 골 수, 흉 선, 비장, 또는 주변에서 순화 될 수 있다 피11. 따라서, 둘 다 B-및 T-계보 세포 수 격리 lckeGFP zebrafish, 그리고 rag2hMYC, lckeGFP 동물, 뿐만 아니라 B 및 T 모든 셀의 경우11.
여기, 우리가 현재 우리의 프로토콜 효율적으로 FACS 정화 비 악성 B 세포에 lck:eGFP zebrafish, 및 rag2hMYC;의 비 악성 또는 악성 B 세포에서 lck:eGFP 물고기, 다양 한 소스 티슈를 사용 하 여. 원하는 경우 이러한 셀 마찬가지로 FACS 격리 없이 cytometry에 의해 측정할 수 수 있습니다. 낮은 lck 식의 발견-GFP 식 결과, 낮은-b 셀 비보 B 세포 발달 연구와 같은 lckeGFP zebrafish에 대 한 실험 가능성의 새로운 문의 엽니다. 따라서, 2004 년에 처음 보고 된이 유전자 변형 라인 우리가 추구 zebrafish 적응 면역에 관한 신선한 통찰력을 수집에 그것을 활용 새로운 생명이 있다.

<table><tbody><tr><td>35 &마이크로; m mesh</td><td>Sefar Filter technology</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>Falcon Corning 브랜드</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>VWR international</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 세설포 네이트; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>버전 4.13</td><td></td></tr> <tr>참조<td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Petsle 마이크로 튜브 균질화 장치</td><td>전자 현미경 과학</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 전송 pippetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>참조 Gutierrez et al., 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

lck:egfp 제 브라에서에서 malignant 및 비 malignant b 세포 분리

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio)는 림프 구 개발을 공부 하는 강력한 모델입니다. 포유류 처럼, D. rerio B와 T 림프 톨을 포함 하는 적합 한 면역 계통을 소유. D. rerio 세포 표면 마커를 인식 하는 항 체는 일반적으로 분리 및 B 계보를 포함 하 여 다른 림프 구 인구의 특성을 복잡 하 게 사용할 수 없습니다 때문에 제 브라 lymphopoiesis의 연구는 어려운 셀입니다. 계보 특정 fluorophore 식 유전자 변형 라인 자주이 문제를 우회 하는 데 사용 됩니다. 유전자 변형 lck:eGFP 라인 D. rerio T 셀 개발, 연구 하는 데 사용 되었습니다 그리고 또한 모델 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병 (T-모든) 활용 되었습니다. Lck:eGFP 물고기 널리 사용 되었습니다 T-계보를 분석, 하지만 그들은 하지 B 세포 연구에 사용 되었습니다. 최근, 우리가 발견 lck을 표현 하는 많은 zebrafish B 셀 낮은 수준에 쓰 신. 따라서, lck:eGFP B 세포는 마찬가지로 GFP의 저급을 표현 한다. 이에 따라, 우리 lck:eGFP zebrafish, 우리가 보고 여기에서 B 계보 세포를 정화 하는 프로토콜을 개발 했다. 우리의 방법은 정화 lck:eGFP 물고기 또는 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; 등 관련된 라인에서 B 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 활용 하는 방법을 설명 합니다. lck:eGFP 물고기입니다. 에이 라인, B 세포, 특히 미 성숙한 B 세포, 낮은 하지만 감지 수준 급행 GFP 그들 고유 높은 GFP를 표현 하는 T 세포에서 허용. B 세포는 골 수, 흉 선, 비장, 혈액, 또는 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 정화 D. rerio B 세포, B 세포 개발 및 B 림프 구 악성 같은 주제에 초점을 맞춘 연구를 활성화 하는 새로운 방법을 제공 합니다.

우리 사용 분석 cytometry FACS GFP소호 및 GFP안녕하세요 세포 thymus, 신장 골 수, 및 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish의 비장 으로부터 분리. 3 개월 된 물고기의 분석 thymus 포함 GFP+ 세포 주로 밝혔다. GFP+ 세포 림프 게이트 이전 Traver 외.17에 의해 설명에 주로 국한 되었다. 두 가지 GFP+ 인구, GFPlo와 GFP안녕하세요, thymus에서 관찰할 수있습니다 . GFP안녕하세요 세포 GFP로 셀은 덜 풍부 하 고, 총 thymic 세포 (표 1)의 40% ~ 60%, 더 높은 백분율 표현. 달리 포유류, 물고기 조 혈 골...

유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.

Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

우리는 최근에 LCK GFP 제브라피쉬에 있는 많은 B 세포가 GFP의 낮은 수준을 표현하는 다는 것을 것을을 발견했습니다. 이것은 이 줄을 T 세포뿐만 아니라 B 세포를 연구하기위한 유용한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 지금 우리가 LCK GFP 제브라피시에서 B 세포와 T 세포를 공부할 수 있고 암에 있는 물고기에서 B-ALL 및 T-ALL 세포를 공부할 수 있다는 것입니다.이러한 방법을 통해 제브라피시에서 B 세포 개발 및 B-ALL 연구를 가능하게 합니다. 적응형 면역 체계를 이해하는 데 관련이 있으며 소아암에서 흔히 볼 수 있는 악성 종양입니다. 좋은 흉선과 골수 샘플을 얻을 수 있을 때까지 기술을 몇 번 구체화하려는 경우가 있습니다.시각적 데모는 시청자가 물고기에서 불소와 B-ALL을 인식하고 격리를 위해 B 및 T 셀을 분리하기 위한 올바른 설정을 선택하는 데 도움이 됩니다. 물고기 시스템에서 0.02%의 트리카인을 마취한 후 지분 내측 양상에서 형광 티미에 대한 2~6개월 된 제브라피시를 검사하기 위해 상피성 현미경에 GFP 필터를 사용합니다. 흉선을 찾은 후 페트리 접시에 안락사 된 생선을 배치하고 형광 현미경을 사용하여 GFP 긍정적 인 티미를 제거합니다.그리고 신장 골수와 비장을 수확하는 밝은 필드 현미경 검사 설정. 수집된 각 장기를 1.5 밀리리터 튜브에 놓고 500마이크로리터의 냉기 선별 매체를 포함하고 유봉 마이크로튜브 균질화기를 사용하여 얼음에 있는 조직을 균질화합니다. 이어서, 35 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 균질화된 조직을 변형하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포를 얼음 위에 놓습니다.2~4개월부터 는 형광 현미경을 사용하여 이중 형질성 rag2:hMYC LCK EGFP 물고기를 낮은 노출 설정을 사용하여 밝은 T 세포 급성 림프구성 백혈병 또는 T-ALL 및 고노출 설정을 식별하여 희미한 B-ALL 동물을 식별합니다. 야생형 조절및 백혈병 전 물고기는 GFP가 흉선에서만 국한되어 있다. 간단한 세 가지 범주 시스템을 사용하여 GFP 형광의 정도를 기준으로 물고기를 분류합니다.레벨 1 물고기는 제한된 국소 확산을 가진 흉종양으로 형광 신호를 보여줍니다. 레벨 2 물고기는 신체의 50 % 미만을 포함하는 흉선 너머의 형광 신호를 보여줍니다. 그리고 레벨 3 물고기는 신체의 50 %를 넘어 확장 형광 신호를 보여줍니다.모든 물고기와 모든 것을 암이없는 것과 분리하십시오. 그리고 새로운 ALL의 발달을 위해 매월 한 번 GFP 양성 종양없이 전 백혈병 물고기를 모니터링한다. T 또는 B-ALL 셀 절연의 경우 면도날을 사용하여 안락사 된 레벨 3 물고기의 머리와 흉선 부위를 제거하고 시체를 페트리 접시에 넣습니다.P-1000 파이펫을 사용하여 500마이크로리터의 냉기 선별 매체로 물고기 복막 구멍을 세척하여 5밀리리터 튜브에서 세포와 배지를 수집합니다. 신선한 파이펫 팁을 사용하여 2-3마이크로리터 부피를 체공에 넣고 파이펫 끝을 사용하여 체내에서 세포를 5밀리리터 튜브로 돌출합니다. 그런 다음 35 마이크로리터 메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 변형시보도록 합니다.그리고 세포 측정을 유동하여 분석 할 때까지 세포를 얼음에 놓습니다. 전신 균질화를 위해 유봉 마이크로튜브 균질화제를 사용하여 물고기의 신체를 균질화하고 튜브에 차가운 선별 매체의 300 마이크로리터를 추가로 추가합니다. 35 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 필터링하고, 필터에 티슈 파편만 남아있을 때까지 필요에 따라 추가 선별 매체로 필터를 세척합니다.그런 다음 분석할 때까지 세포를 얼음 위에 놓습니다. 격리된 세포의 유량 세포 측정 해석을 위해 제조업체의 지침에 따라 유동 세포계 매개변수를 설정합니다. 그리고 림프구 및 전구 세포 게이트를 정의하고 세포 이물질을 배제하기 위한 전방 분산 및 측면 산란 파라미터를 설정하고 셀룰러 이물질을 배제하기 위해 10, 000 ~ 50, 000 이벤트를 획득한다.세포 두 배를 배제하고 림프구 및/또는 전구체 게이트를 사용하여 GFP 양성 세포의 수와 백분율을 결정합니다. 물리에리트린과 GFP 강도를 사용하면 GFP 음성에 대한 게이트를 GFP 의 낮은 GFP 고세포에 비해 정의합니다. GFP 낮은 및 GFP 높은 세포를 격리하기 위한 문을 어디에 배치할지 배우는 것은 순수한 B 및 T 세포 집단을 얻는 데 중요합니다.두 개의 별개의 GFP 양성 인구, GFP 낮은 B 세포 및 GFP 높은 T 세포는 흉선으로부터 얻을 수 있다. 3개월 된 제브라피쉬의 신장 골수에 거주하는 B 세포는 GFP의 낮은 수준을 표현한다. GFP 높은 세포는 그러나 부족합니다, T 림프구의 단지 작은 백분율이 나이의 3 달에 골수에 존재한다는 것을 나타내는.마찬가지로, 비장 샘플은 GFP 높은 세포보다 낮은 GFP의 높은 비율을 보여줍니다. 아직 급성 림프 구성 백혈병을 개발하지 않은 이중 형균 물고기에서, 흉골, 골수 및 비장의 GFP 발현은 단일 형질전환 LCK EGFP 물고기에서 관찰된 것과 유사합니다. 그러나, 기관 당 림프구의 수가 증가.아마도, 때문에 RAG2 프로모터가 활성화되는 미성숙한 B와 T 세포 인구의 MYC 구동 확장. 6개월에 의하여 형광암을 개발한 B 및 또는 T-ALL을 가진 이중 형질전환 물고기에서 B-ALL은 주로 GFP 저세포를 포함하는 희미하게 형광암입니다. 대조적으로, 밝은 형광 물고기는 GFP 낮은 B-ALL 및 GFP 높은 T-ALL 세포의 고립된 T-ALL 또는 혼합된 인구 둘 다를 수용할 수 있습니다.실제로, 정량적 중합체 연쇄 반응 분석에 의해 평가된 바와 같이 GFP 저세포는 B 세포 전사체의 상부를 발현한다. 및 GFP 높은 세포는 T 세포 유전자, LCK 및 GFP 마커의 상부를 발현합니다. 현미경으로 B-ALL로 물고기를 인식하는 방법을 배우는 것이 중요합니다.그리고 GFP 낮은 및 GFP 높은 인구를 분리하기위한 흐름 세포측정 게이트를 적절하게 정의하는 방법. 이 절차에 따라, 당신은 PCR, 시퀀싱, 혈액 또는 생체 내 이식 실험에 대한 GFP 낮은 및 GFP 높은 세포에서 DNA, RNA, 또는 단백질을 분리 할 수 있습니다. LCK GFB 물고기가 T 세포 이외에 형광 B 세포를 가지고 있다는 것을 알게 되면 B와 T-ALL을 평가하기 위해 동일한 동물에서 두 세포 유형을 연구할 수 있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 - 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 - 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

이 프로토콜은 성체 제브라피시에서 형광 표지된 T 세포 급성 림프구 백혈병(T-ALL) 종양 세포를 분리하고 트리판 블루 염료를 사용하여 정량화하는 기술을 설명합니다.

형광 표지된 T-ALL 세포 분리: 성체 제브라피시에서 T-ALL 세포를 분리하는 방법

여기에서는 제브라피시 골격근 및 배아 횡문근 육종(ERMS)을 성체 면역 손상 rag2E450fs 동형접합 돌연변이 제브라피쉬에 이식하는 세포 이식 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 근육 세포의 재생 및 악성 변형을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다.

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

본 논문은 신경모세포종의 제브라피시 모델에서 종양 전이를 실시간으로 개발, 특성화 및 추적하는 방법을 소개하며, 특히 MYCN 및 LMO1의 과발현을 가진 형질형 제브라피시 라인에서 자발적으로 전이를 발생시합니다.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

배우세요 lck:eGFP 제브라피시를 이용한 악성 및 비악성 B 세포 분리 기법으로, 소아 백혈병 연구와 적응 면역 체계 이해에 활용할 수 있습니다.

Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

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