Name: Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 인간 상피 엔테로이드 배양 프로토콜을 통해 괴사성 장염 연구 방법을 익히세요. 신생아 조직에서 분리한 장줄기세포로 엔테로이드를 배양하고 리포다당류 처리로 염증 반응을 유도하여 질병 메커니즘을 분석합니다.

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이 작품은 당뇨병과 소화와 신장 질환 그랜트 (K08DK106450) C.J.H.에 미국 소아 외과 협회에서 제이 Grosfeld 상 건강 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다

기관 심사 위원회 승인 (IRB #2013-15152) 얻은 앤 로버트 H. Lurie 어린이 병원의 시카고, 시카고, 일리노이에서 창 자 절제술 환자에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한. 모든 프로토콜은 기관 및 국가 지침 및 인간의 복지에 대 한 규정에 따라 수행 했다. 부모의 동의서 정보 요구 되었고 모든 경우에서 샘플 수집 전에 얻은.
1. 시 약 준비
<ol><li>문화 미디어 재고 솔루션 전체 조직 컬렉션에 대 한 준비: 1 L의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 110 mL의 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린-스 (최종 농도 1%)의 11 mL 1.1 ml 필터 소독 인슐린 (최종 농도 0.1%.) 4 ° c.에 게 재고 솔루션</li>
	<li>킬레이트 버퍼 #1 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 600 µ L (최종 농도 10 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%)의 고 암포 B (최종 농도 0.2%)의 60 µ L. 4 ° c.에 게 재고 솔루션</li>
	<li>킬레이트 버퍼 #2 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL Gentamicin (최종 농도 1%)의 0.5 M EDTA (최종 농도 5 m m), 300 µ L의 300 µ L 고 암포 B (최종 농도 0.2%)의 60 µ L. 4 ° c.에 게 재고 솔루션</li>
	<li>인간의 Minigut 미디어 준비: 41.4 mL DMEM/F-12, FBS (최종 10%), 500 µ L의 페니실린-스 (최종 농도 1%), L-글루타민 (최종 농도 1%), Gentamicin (최종 농도 1%), 암포 b (최종 100 µ L의 500 µ L의 500 µ L의 5 mL 농도 0.2%), 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane 술 폰 산 (HEPES)의 500 µ L (최종 농도 10 m m), 100 x 500 µ L N-2 보충, 및 50 x의 1 mL 50 mL의 전체 볼륨에 대 한 비타민 A 마이너스 B-27 보충. -20 ° c.에 게 재고 솔루션</li>
	<li>인간의 Minigut 미디어 완료 준비: 10 mL의 인간 Minigut 미디어 (준비에서 1.4), 10 µ L 100 µ g/mL Wnt3a의 (최종 농도가 100 ng/mL), 100 µ g/mL 머리 (최종 농도가 100 ng/mL), 1 mg/mL R Spondin의 10 µ L의 10 µ L (최종 농도 1 µ g/mL) 500 µ g/mL 표 피 성장 인자 (EGF) (최종 농도 50 ng/mL), 1의 10 µ L의 10 µ L M N-진 (최종 농도 1 m m) 10, 500 µ M의 10 m m Y-27632 (최종 농도 10 μ M), 10 µ L의 µ L A-83 (최종 농도 500 nM), 10 mM SB202190 (마지막의 10 µ L 농도 10 μ M), 1 M 니코틴의 100 µ L (최종 농도 10 m m)와 1 µ L 100 µ M [레이] 15 gastrin 1 (최종 농도 10 nM)의. 전체 용량 10 mL. 4 ° c.에 게 재고 솔루션 참고: 솔루션 내에서 48 h 사용 해야 합니다.</li>
</ol>2. 토 굴 격리 및 전체 조직에서 도금
<ol><li>
요원에 있는 컬렉션의 시간에 인간의 작은 창 자 조직 샘플에서 찬 Dulbecco 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 놓습니다. 대변과 혈액의 클리어까지 차가운 DPBS에 표본을 씻어. 토 굴 격리에 대 한 준비까지 4 ° C에서 견본 RPMI 1640 매체에 저장 합니다. 참고: 조직 24 시간 이상 저장할 수 없습니다.<ol>
<li>표본은 분명 대변과 혈액의 다는 것을 확인 하십시오. 섬세 한 해가 위를 사용 하 여 모든 초과 지방 또는 수술 클립/스테이플 등 제거. 무게는 견본. 참고: 조각 약 0.75-2.5 g에 대 한 목표.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
표본 0.5 cm 조각으로 잘라 하 고 킬레이트 화 버퍼 # 1의 30 mL에 장소 (로 단계 1.2 준비).
	<ol>
<li>4 ° c.에 15 분 동안 낮은 속도 흔들</li>
		<li>100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 조직 필터 및 흐름을 통해 삭제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(1.3 단계에서 준비)로 조직 킬레이트 화 버퍼 # 2의 30 mL를 추가 합니다.
	<ol>
<li>4 ° c.에 15 분 동안 낮은 속도 흔들</li>
		<li>100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 조직 필터 및 흐름을 통해 삭제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.8 단계에서 사용 하기 위해 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스의 500 mL 녹여</li>
	<li>
10 mL 50 mL 원뿔 튜브에 차가운 DMEM의 조직을 추가 하 고 10 대 손으로 적극적으로 악수 s.
	<ol>
<li>100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 수집 (레이블 #1)를 통해 흐름. 튜브 얼음에 # 1를 유지.</li>
		<li>별도 50 mL 원뿔 튜브에 차가운 DMEM의 또 다른 10 mL에 조직을 추가 하 고 10 대 손으로 적극적으로 악수 s.</li>
		<li>100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 수집 (레이블 #2)를 통해 흐름.</li>
		<li>두 개의 추가 시간 흐름 (레이블이 튜브 #1-4)를 통해 4 개의 원뿔 관까지를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
필터 튜브 100 µ m 셀 스 트레이너 및 전송 흐름을 통해 15 mL 원뿔 튜브 (레이블 #1)으로 통해 #1 솔루션. #2-4를 반복 합니다.
	<ol>
<li>원심 분리기 15 mL 튜브 #1-4 200 x g 에서 4 ° c.에서 15 분</li>
	</ol>
</li>
	<li>
층 류 두건에 튜브 #1-4에서에서는 상쾌한을 제거 하 고 삭제 합니다. 경우에 일부 상쾌한 남겨두고 조직 바로 위에 펠 릿의 구름을 방해 하지 마십시오.
	<ol>
<li>천천히 pipetting으로 남은 튜브 #1-4에서에서 표면에 뜨는와 펠 릿을 함께 섞는다.</li>
		<li>하나의 단일 2 mL 원뿔 튜브로 튜브 #1-4에서에서 혼합물을 전송.</li>
		<li>4 ° c.에 20 분 200 x g 에서 원뿔 튜브 원심</li>
	</ol>
</li>
	<li>
상쾌한을 제거 하 고 다시 지하실 멤브레인 매트릭스의 500 µ L에 펠 릿을 중단. 참고: 모든 시간에 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지 하 고 신속 하 게 다음 단계에 대 한 작업. 이 제품은 실 온에서 매우 신속 하 게 polymerizes.<ol>
<li>24-잘 접시에 잘의 센터에 견본/지하실 막 매트릭스 서 스 펜 션의 50 µ L를 적용 됩니다. 이 돔 모양으로 나타납니다. 참고: 냉장된 피 펫 팁의 사용 최소화 합 정지, 매끄러운 전송에 에이즈.</li>
		<li>10 총 우물을 채우기 위해 9 번을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 인큐베이터 중 합 수 있도록 30 분에 24-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>각 우물에 인간 Minigut 미디어 완벽 한 (준비 단계 1.5에서에서)의 500 µ L를 추가 합니다. 2 일 마다 교체 합니다.</li>
	<li>5-10 일 후, 신진 시각 때 enteroids를 수집 합니다. 단계 4 및 5 컬렉션 지침에 대 한 참조.</li>
</ol>3입니다. 실험 NEC의 유도
<ol><li>0에 인간 Minigut 미디어 완벽 한 (단계 1.5에서에서 준비)에 각 잘의 500 µ L를 lipopolysaccharide (LPS)의 5 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 컬렉션까지 2 일 마다 교체 합니다.</li>
</ol>4입니다. 파라핀 포함을 위한 준비
<ol><li>
부드럽게 미디어를 제거 합니다.
	<ol>
<li>PBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 아래로 주의 enteroids를 lyse 않기로 지하실 멤브레인 매트릭스를 해산 하기 위해 플라스틱.</li>
		<li>PBS/enteroid 혼합물을 원심 < 작은 PBS를 제거 하 5 분에 대 한 300 x g .</li>
	</ol>
</li>
	<li>4% paraformaldehyde 1 시간 실 온에서 해결 하기 위해 추가 합니다.</li>
	<li>
원심에서 < 300 x g 5 분 작은, 그리고 PBS를 제거 합니다.
	<ol>
<li>부드럽게 1 mL의 PBS로 세척 하 고 원심에서 < 300 x g 5 분 작은, 그리고 PBS를 제거 합니다.</li>
		<li>4.3.1 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
충분 한 양의 젤 (약 300 µ L) 원뿔 튜브에 원하는 금액을 배치 하 고 액체까지 3-10 분 동안 65 ° C에서 드라이 목욕 인큐베이터에서 온난 하 여 처리 하는 조직에 녹 인 다.
	<ol>
<li>펠 릿을 젤 처리 조직을 추가 하 고 부드럽게 혼합.</li>
		<li>coverslip에서 작은 복제 반지를 놓습니다.</li>
		<li>복제 반지는 coverslip에 장착으로 젤과 enteroid 혼합 처리 조직 플라스틱</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젤, enteroid 혼합물 1 h 4 ° C에서 고형화 처리 하는 조직을 수 있습니다.
	<ol>
<li>파라핀을 포함 하기 위한 준비에 70% 에탄올으로 응고 혼합 복제 반지를 잠수함.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Enteroid 컬렉션 RNA 및 단백질 추출에 대 한
<ol><li>부드럽게 각 우물에서 인간 Minigut 미디어 완전 제거 합니다.</li>
	<li>
1 mL PBS를 추가 하 고 부드럽게 아래로 지하실 멤브레인 매트릭스를 해산 하기 위해 플라스틱. 수는 enteroids을 분리 하지 않도록 주의 하십시오.
	<ol>
<li>살 균 2 mL 원뿔 관으로 PBS/enteroid 혼합물을 놓습니다.</li>
		<li>원심에서 < 작은 5 분 300 x g .</li>
		<li>부드럽게 PBS는 enteroids를 제거 하지 않도록 주의 복용 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단계 시리즈 5.2 두 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>단백질 또는 RNA 추출에 대 한 준비까지-80 ° C에 고정 합니다.</li>
	<li>잘 설립 qRT-PCR 및 서양 Blotting 기술을 사용 하 여 enteroids의 유전자 표현과 단백질 격리를 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

Ex vivo 인간 창 자 enteroid 모델이이 소설 장 장벽 부전 necrotizing enterocolitis (NEC)에서 연구에 대 한 유용한 방법으로 제공 합니다. 여기에 제시 된 enteroid 처리 방법 박사 안개 좋은, 마이클 Helmrath와 제이슨 베르트 하 임10,,1112의 이전 직장에서 적응 했다.
세부 사항 전체를 둘러싼 조직 수집 및 토 굴 격리의 타이밍은이 프로토콜에서 중요 한 단계. 조직 요원 절제 시 즉시 수집 하 고 조직 연구실에 도착 하자마자 토 굴 격리에 대 한 처리 해야 합니다. 우리는이 모델에 대 한 보다 3 개월 환자에서 조직 선택. 지연된 처리 24 시간 이내 전체 조직 컬렉션 후 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 또한, 인간의 조직 샘플의 품질에는 크립 트 격리의 ...

인간 enteroids 있다 전 비보 3 차원 문화 시스템 인간의 창 자 조직 샘플의 장 지하실에서 분리 된 줄기 세포에서 생성 된. 이 획기적인 모델 2007 마우스1소장의 지하실에서 Lgr5 + 줄기 세포의 발견 다음에 Hans Clevers 연구진이 개척 했다. 그들의 작품 전을 설정 하기 위한 토대를 마련 여러 종류의 세포는 상당한 유전적 또는 생리 변화2없이 passaged 수 비보 장 상피 문화. 이 발견 이후 enteroids 정상 소화 생리학, 선 동적인 장 질병, 호스트 병원 체 상호 작용, 재생 의학2등 장 질환의 병 태 생리학을 공부 하 고 새로운 모델으로 사용 되었습니다.
사용 전으로 enteroids의 vivo 모델 장 이상의 연구에 대 한 대체 기술을 통해 몇 가지 장점을. 지난 몇 십년에 대 한 동물 모델과 불멸 하 게 장 암 파생 셀 라인 장 생리학3,,45연구 사용 되었습니다. 단일 세포 배양 세포 유형 정상적인 창 자 상피에 존재 함으로써 셀을 크로스 토크와 세그먼트-특이성 단백질 표정, 신호, 및 병원 체 유발 질병6부족의 다양성을 대표 하지 않는다. Enteroids에 있는 줄기 세포 상피 세포 유형 enterocytes, Paneth 세포, 잔 세포, enteroendocrine 세포와 더 많은3주요로 구분합니다. 그들은 극성을 전시, 상피 전송 기능을 수행 하 고 장 세그먼트 특이성6허용 합니다. Enteroids 인간 장 상피의 여러 세포 유형 정리 수 있습니다, 이후 그들은 암 세포 기반 시스템의 인정된이 제한을 극복 하기 위해 수 있습니다. 시간이 지남에, 셀 라인의 파생 상품 subcloned는 고 단백질 식 및 지역화3에 큰 다양성을 전시 진화. 그와 반대로, 상당한 유전적 또는 생리 변화2없이 enteroids는 passaged 수 있습니다. 선관위에 대 한 수많은 동물 모델 존재, 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 높게 가변 될 수 있습니다. 이러한 제한으로 인해 치료 동물 모델에서 파생 된 시간의 90% 실패 때문에 독성 또는 효능3인간의 재판에서 테스트 했을 때. Enteroids 복잡 한 장 이상과 따라서 더의 더 나은 이해로 이어지는 이러한 결함을 극복할 수 있는 유망한 전 임상 모델 역할 성공적이 고 비용 효율적인 치료 혁신. 또한 최근 증거는 enteroid에서 생성 되는 조직의 나이 생물학으로 중요 한7남아 있다. Enteroids 신생아 조직, NEC와 환자에 게 생리 관련성 유지에서 생성 되므로 이것은 우리의 모델에 대 한 특히 중요 한 정보 이다.
인간 질병의 모델로 enteroids의 유틸리티 확장, 심한와 보급 조건 치료를 찾는 희망 하 고 있습니다. Necrotizing enterocolitis (NEC) 신생아 장 괴 사 특징의 엄청난 장 질환 이며 자주 죽음8, 패 혈 증, 창 자 벽의 구멍 뚫 기를 리드. 때문에 선관위의 복잡 하 고 multifactorial 이상, 질병의 정확한 메커니즘 하지 아직 되었습니다 완전히 해명 했습니다; 그러나, 증가 창 자 침투성은 질병 과정8에서 명확 하 게 연루 되었습니다. 주어진 NEC와 잠재적인 치료제의 연구는 윤리적으로 인체, 특히 어린이에 도전, 매우 인간의 신생아 티슈를 사용 하 여 NEC의 생물학 관련 enteroid 모델을 활용 하는 것이 좋습니다. 지금까지, enteroids NEC의 연구에서 제한 된 역할을 있다. 이 프로토콜 enteroids enterocolitis necrotizing의 연구에 대 한 vivo 모델 전 소설으로 인간의 창 자 조직 샘플에서 파생 된의 사용을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R& D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>ThermoFisher 15290026</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 마이너스 비타민 A</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>기저막 매트릭스 (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자(EGF)</td><td>시그마</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>제미니 바이오 프로</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>시그마</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스( L-글루타민)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-가스트린 1</td><td>시그마</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>리포다당류(LPS)</td><td>시그마</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 술폰산(HEPES)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>시그마</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>조직 처리 젤 (Histogel)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& D 시스템 INC</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>시그마</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

necrotizing enterocolitis의 소설 인간 상피 enteroid 모델

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) 신생아 유아의 치명적인 질병입니다. 그것은, 손상 회복, 그리고 세포 죽음 증가 증가 창 자 침투성으로 이어지는 인간 장 상피에 여러 pathophysiologic 변경 특징. NEC의 수많은 동물 모델을 확인 하 고는, 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 매우 다양 수 있습니다. 또한, 그것은 질병 이상 또는 인체, 특히 아이 들에서 직접 새로운 치료제 연구를 윤리적으로 도전입니다. 따라서, 그것은 매우 바람직한 인간 직물을 사용 하 여 NEC의 새로운 모델을 개발입니다. Enteroids는 3 차원 organoids 장 상피 세포에서 파생 된. 그들은 복잡 한 생리 적인 상호 작용, 세포 신호, 및 호스트 병원 체 방어의 연구에 이상적입니다. 이 원고에 우리 기술 프로토콜 그 문화 인간 enteroids 창 자 절제술 환자에서 장 줄기 세포를 분리 한 후. 토 굴 세포 감 별 법 인간 장 상피의 다양 한 셀 형식 기본으로 격려 하는 성장 인자를 포함 하는 미디어에 교양. 이 세포는 여분의 세포 지하실 막을 흉내 낸를 발판으로 봉사 하는 단백질의 합성, collagenous 믹스에서 성장 된다. 그 결과, enteroids 개발 꼭대기 basolateral 극성. 미디어에서 lipopolysaccharide (LPS)의 공동 관리 enteroids, 조직학, 유전, 선도 및 단백질 식 변경 그 인간의 선관위에서 본 비슷한 염증 반응을 발생 합니다. 우리가이 질병을 위한 치료를 식별 하기 위해 노력 하 고 인간의 조직을 사용 하 여 NEC의 실험 모델 약물 및 치료 인체 실험, 사전 테스트에 대 한 더 정확한 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

도금, 직후 갓 격리 장 지하실 길쭉한 봉으로 표시 됩니다. 시간 내는 enteroid (그림 1a) 둥근 모양에 걸릴 것입니다. 앞으로 몇 일 동안에 enteroids 그림 1b에서 보듯이 구체를 형성 시작 합니다. 신진그림 1(c) 5-10 일 사이 발생 해야 하 고 enteroid 컬렉션은 그 시간에 발생 한다.
성장 enteroids 또한 중앙된 루멘, 꼭대기 국경과 basolateral 도메인 (그림 2)를 포함 하는 극성을 전시할 것 이다. Entero...

Enteroids 인간 질병의 연구에 새로운 모델로 떠오르고 있다. 프로토콜 신생아 조직에서 생성 된 enteroids의 lipopolysaccharide (LPS) 치료를 사용 하 여 인간의 necrotizing enterocolitis에의 enteroid 모델을 시뮬레이션 하는 방법을 설명 합니다. 수집 된 enteroids 그 인간의 necrotizing enterocolitis에 본 유사 염증 성 변화를 보여 줍니다.

Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

엔테로이드는 장 상피 세포에서 유래한 3차원 오르가노이드입니다. 그들은 복잡한 생리적 상호 작용, 세포 신호 및 숙주 병원체 방어연구에 이상적입니다. 우리의 프로토콜은 창자 절제술을 겪고 있는 환자에게서 장 줄기 세포를 격리한 후에 인간 장로이드를 배양하는 방법을 설명합니다.우리 배양 매체에서 리포폴리사카라이드를 공동 투여하면 뇌토학적, 유전적 및 단백질 발현 변경으로 이어지는 장로이드에 염증반응이 발생합니다. 괴사 장염 및 잠재적 인 치료제의 연구가 인간 과목, 특히 어린이에게 윤리적으로 도전적이라는 점을 감안할 때, 인간 신생아 조직을 사용하여 괴사 장염의 이 소설, 생물학적으로 관련된 장염 모델을 활용하는 것이 매우 바람직합니다. 이 기술의 주요 장점은 엔테로이드가 여러 세포 유형의 인간 장 상피를 회수할 수 있으며 동물 모델 및 세포 기반 시스템의 인식한계를 극복할 수 있다는 것입니다.수술을 입증하는 데 도움이 크리스티 Buonpane, 외과 거주자, 캐리 위안, 우리의 실험실에서 실험실 기술자가 될 것입니다. 수술 실에서 수집의 시간에, 감기 DPBS에 인간의 작은 장 조직 샘플을 배치. 혈액과 대변이 맑아지 때까지 차가운 DPBS에서 표본을 씻으시면 됩니다.표본을 RPMI 1640 배지에 섭씨 4도에 저장하여 토굴 격리가 준비될 때까지 보관합니다. 진행 준비가 되면 표본이 대변과 혈액이 명확하지 않다는 것을 다시 확인하십시오. 섬세한 해부 가위를 사용하면 과도한 지방 또는 수술 클립과 스테이플을 제거합니다.표본의 무게와 약 0.75 ~ 2.5 그램의 조각을 목표로합니다. 다음으로, 조직을 0.5센티미터 조각으로 자르고 30 밀리리터가 들어있는 튜브에 배치합니다. 섭씨 4도에서 15분간 저속으로 흔들어주세요.그런 다음, 100 마이크로미터 세포 여과기를 통해 조직을 필터링하고 통해 흐름을 폐기한다. 여과된 조직을 30밀리리터의 첼라팅 완충제 2번을 포함하는 튜브에 추가합니다. 섭씨 4도에서 15분간 저속으로 흔들어주세요.100 마이크로미터 필터를 통해 조직을 필터링하고 흐름을 버립니다. 그 후, 나중에 사용하기 위해 얼음에 지하 막 매트릭스의 500 마이크로 리터를 해동. 50 밀리리터 원추형 튜브에 차가운 DMEM의 10 밀리리터에 일부 조직을 추가하고 10 초 동안 손으로 격렬하게 흔들어.100 마이크로미터 세포 여과기를 통해이 서스펜션을 필터링하고 흐름을 수집합니다. 이 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 별도의 50 밀리리터 원추형 튜브에 차가운 DMEM의 또 다른 10 밀리리터에 약간의 조직을 추가하고 10 초 동안 손으로 격렬하게 흔들어.100 마이크로미터 세포 여과기를 통해이 서스펜션을 필터링하고 흐름을 수집합니다. 1~4개의 라벨을 통해 흐름을 포함하는 4개의 원뿔형 튜브가 있을 때까지 두 번 더 프로세스를 반복합니다. 이어서, 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 튜브 번호 1의 용액을 걸러내고 15밀리리터 원뿔튜브로 흐름을 전달하여 도 1위를 표시하였다.튜브 2~4개에 대해 이 과정을 반복합니다. 원심 분리기 15 밀리 리터 튜브200 시간 G와 섭씨 4도에서 15 분 동안. 라미나르 플로우 후드에서 각 튜브에서 상체를 제거하고 폐기하십시오.펠릿 바로 위에 조직의 구름을 방해하지 마십시오, 그 뒤에 일부 상체를 떠나 의미하는 경우에도. 각 튜브에서 피펫을 천천히 위아래로 뒤집어 펠릿을 남은 슈퍼네티트와 섞습니다. 각 튜브의 혼합물을 2밀리리터 원심관과 원심분리기는 200회 G와 섭씨 4도에서 20분 동안 전달합니다.그 후, 상체를 제거하고 미리 해동된 지하 막 매트릭스의 500 마이크로리터에서 펠릿을 재차질한다. 차가운 파이펫 팁을 사용하여 24 웰 플레이트의 우물 중앙에이 서스펜션의 50 마이크로 리터를 적용하십시오. 이 샘플은 돔 모양으로 표시되어야 합니다.총 10개의 우물을 채우기 위해 이 응용 프로그램 프로세스를 9번 반복합니다. 24개의 웰 플레이트를 37°C의 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 30분간 전달하여 중합을 허용합니다. 그런 다음 각 웰에 완성된 500마이크로리터의 인간 미니구트 미디어를 추가합니다.동일한 조건에서 계속 배양하여 이틀마다 이 미디어를 교체하십시오. 첫째, 10 마이크로리터의 LPS를 밀리리터당 5밀리그램의 농도로 추가하여 0일 0일 플레이트의 각 웰에 완성된 인간 미니구트 미디어의 500 마이크로리터에 넣습니다. 37도에서 이산화탄소 5%로 계속 배양하고 수집까지 이틀마다 보충 된 미디어를 교체하십시오.파라핀 포함을 준비하기 위해 먼저 미디어를 부드럽게 제거하고 PBS 1 밀리리터를 추가하고 부드럽게 파이펫을 위아래로 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스를 용해시키면서 엔테로이드를 분해하지 않도록 주의하십시오. 원심분리기는 5분 동안 300배 미만의 속도로 G를 펠릿한 다음 PBS를 제거합니다. 4%의 파라포름알데히드를 추가하고 실온에서 고치기 위해 튜브를 1시간 동안 따로 놓습니다.원심분리기는 5분간 300배 미만의 속도로 펠릿을 한 다음 파라포름알데히드를 제거합니다. PBS와 원심분리기 1밀리리터로 5분간 300배 G 미만으로 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 제거합니다.PBS로 이 세척 과정을 한 번 반복하십시오. 원하는 양의 조직 처리 젤을 원상 튜브에 넣고 액체가 될 때까지 섭씨 65도에서 마른 목욕 인큐베이터에 데우십시오. 그 후, 멜트화 된 조직 처리 젤을 펠릿에 넣고 부드럽게 섞습니다.작은 복제 링을 커버슬립에 넣습니다. 파이펫은 슈피테트 슈가클과 엔테로이드 혼합물을 커버슬립에 장착되는 복제 링에 넣습니다. 조직 처리 젤과 엔테로이드 혼합물을 섭씨 4도에서 1시간 동안 응고하도록 허용합니다.그런 다음, 클로닝 링을 응고 된 혼합물과 70 % 에탄올로 잠급하여 파라핀 포함을 준비합니다. 도금 직후, 갓 분리된 장 내 지하실은 길쭉한 막대로 나타납니다. 몇 시간 내에 엔테로이드가 둥근 모습을 취합니다.다음 며칠 동안 엔테로이드는 구체 형성을 시작합니다. 신진은 5~10일 사이에 발생해야 하며, 이는 엔테로이드 컬렉션이 발생해야 하는 경우입니다. 성장하는 장용제는 또한 중앙 집중식 루멘, 정색 테두리 및 기초 영역을 포함하는 극성을 나타낸다.엔테로이드는 또한 견고한 액틴 세포골격으로 표현되는 구조적 무결성을 보여줍니다. 문화에서 며칠 후, LBS 처리 엔테로이드는 더 많은 자멸을 경험하고 대조군보다 낮은 수율을 가지고있다. NEC의 뮤린 모델에서 볼 수 있듯이, 수용체 4와 같은 통행료의 증가된 발현은 대조군에 비해 LPS 처리 된 엔테로이드에서 발견된다.엔테로이드는 또한 잘 확립된 qRT-PCR 및 서부 블로팅 기술을 사용하여 RNA 및 단백질 추출을 위해 수집될 수 있고 유전자 발현 및 단백질 절연을 수행할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

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Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델

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