Name: 단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 학습하세요 단일 분자 수준에서 단백질 라벨링 균일성을 정량화하는 방법을. 형광 표지와 전기영동을 활용하여 복합 샘플 내 단백질 종의 이질성을 정밀 분석하고, 향후 진단 적용을 위한 초민감 분자 농도 측정 기술을 개발합니다.

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저자 감사 Masae 오노와 카즈야 니시무라 실험적인 지원 및 조언. 이 작품은 프레스 토 (JPMJPR15F7), 일본 과학 및 기술 기관, 젊은 과학자 (A) (24687022), 도전 탐구 연구 (26650055), 및 혁신적인 지역 (23115005), 일본 학회에 과학 연구에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다 승진의 과학, 그리고 다케다 과학 재단 및 모 기념 재단에서 교부 금에 의해 의료 및 제약 연구에 대 한. S.L. 인정 RIKEN 국제 프로그램 연결 (IPA) 프로그램에서 지원 합니다.

1. 세포 준비
<ol><li>37 ° C에서 10 cm 접시에 HeLa 세포 배양 미만 5% CO2 Dulbecco의 수정 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 글의 중간.</li>
	<li>그들은 70 %confluency, ATCC 지침17다음에 도달 되 면 기 하 급수적으로 성장 세포를 수집 합니다.<ol>
<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (pH 7.4) x 1의 5 mL로 세포를 씻어. PBS를 제거 합니다.</li>
		<li>0.1% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에서 5 분을 품 어</li>
		<li>현미경으로 세포 분리의 진행을 모니터링 합니다.</li>
		<li>일단 셀 라운드 되 고 접시에서 분리, 성장 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 덩어리를 pipetting으로 휴식.</li>
		<li>셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>원심 분리기 튜브에서 10 분 150 x g 에서. 매체를 제거 하 고 resuspend 1 x PBS (pH 7.4)의 5 mL와 함께 셀 펠 릿.</li>
		<li>1.2.6 단계를 반복 합니다. 106 셀/ml 단계 1.2.5에서에서 카운트 번호를 사용 하 여 최종 농도를 1 x PBS (pH 7.4)에 셀 resuspend 참고: 셀 정지 수 aliquoted-80 ° C에서 저장 몇 달 동안. 냉동/해 동 주기를 반복 피해 야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 세포의 용 해 및 형광 라벨
<ol><li>게 lysing 버퍼의 10 mL (0.1 m M 붕 산 염, 1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 1% 트윈 20). PH 12 2 M NaOH를 사용 하 여 조정 됩니다. 주의: 집중된 NaOH 부식성입니다. 이 솔루션을 준비 하는 때 적합 한 장갑과 안경 착용. 참고: Lysing 버퍼는 실 온에서 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1 M dithiothreitol (DTT)의 1 μ와 버퍼 및 4 lysing의 믹스 100 μ μ의 50 %3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (챕).</li>
	<li>2.2 단계에서 혼합된 lysing 버퍼와 세포 배양 (약 1, 000 셀)의 믹스 1 μ. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 5 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 품 어. 다시 천천히 pipetting으로 솔루션을 균질.</li>
	<li>2 μ g/mL Cy3 NHS 에스테 르 염료의 1 μ를 추가 합니다. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 어둠 속에서 5 분 동안 품 어. 참고:이 버퍼의 높은 산도 단백질, 높은 반응성 선도 리 진 잔류물의 중화를 발생 합니다.</li>
	<li>2 μ g/mL Cy3 NHS 에스테 르 염료의 1 μ의 추가 반복 합니다. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 어둠 속에서 10 분 동안 품 어. 참고:이 반복 NHS 에스테 르 염료의 추가 때문에 일부 Cy3 NHS 에스테 르 염료의 분해 반응 버퍼의 높은 pH에 의해 비활성화 라벨 효율을 증가 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>PH 7.2 0.8 M의 100 μ를 추가 하 여 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 조정-NaOH pH 7.2 반응 해소. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질.</li>
	<li>추가 19 mg/mL biotin-(폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG))2의 20 μ-아민 및 20 mg/mL 1의 5 μ-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 어둠 속에서 1 시간에 품 어. 참고:이 biotinylation 단계 현미경 coverslip 고정 밀도 및 아무 단백질 종에 단백질 분자를 해결할 필요가 있다.</li>
	<li>Unreacted 라벨 시 약을 제거 하 고 제조업체의 지침에 따라 10 kDa 커트 오프와 한 열을 사용 하 여 샘플을 집중. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플 몇 주 동안-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 프로테옴 분리 및 복구
<ol><li>SDS 샘플 버퍼 (200 mM Tris HCl pH 6.8, 4 %SDS, 4% 글리세롤과 0.4 %bromophenol 블루) x 4를 추가 합니다. 참고: 염료 손상을 방지 하려면 단백질 샘플 수가 열 안 표준 SDS 페이지에서 다 고 실 온에서 보관 한다.</li>
	<li>단백질 견본 및 20% 아크릴 아 미드 젤을 사용 하 여 분자 사다리에 대 한 표준 SDS 페이지를 수행 합니다. 샘플을 마이그레이션하는 마이그레이션까지 일정 전압 (160 V)에서 젤 앞 그냥 젤 종료.</li>
	<li>단백질 밴드 (그림 3)의 위치를 식별할 수 젤 이미지.</li>
	<li>밴드 위치에 따라 날카로운 칼 날을 사용 하 여 관심사의 단백질 분수 포함 젤 부분을 잘라. 마찰 16, 23, 55 및 120 kDa 봉우리와 19-25, 25-32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136, 136-226 kDa 영역은 그림 3에 나와 있습니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 6-8 kDa의 기 공 크기와 electroelution에 의해는 dialyzer를 사용 하 여 단백질을 추출 합니다. 참고: 추출 된 샘플 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 몇 주 동안.</li>
</ol>4. 현미경 coverslip 준비
<ol><li>각 샘플 avidin 버퍼 (5 mM HEPES NaOH pH 7.2, 10 ng/mL avidin, 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA))의 200 μ를 준비 합니다.</li>
	<li>22 m m x 22 m m, 0.15 m m 두께의 coverslips을 준비 합니다. 공기 플라즈마를 사용 하 여 플라즈마 1 분 동안 청소기 청소 하 고 그들의 표면 활성화 coverslips를 노출 합니다.</li>
	<li>코트 1000 rpm에서 30 초 뒤 500 rpm에서 5 초 동안 스핀 coater를 사용 하는 avidin 버퍼의 스핀 코팅 200 μ에 의해 avidin와 coverslips. 드라이 그들을 실 온에서 15 분 동안 coverslips를 품 어.</li>
	<li>Coverslips 단백질 샘플 준비.<ol>
<li>5 mM HEPES NaOH ph 7.2 (3.5)에서 단백질 샘플 100 배 희석.</li>
		<li>(4.3 단계)에서 avidin 코팅 coverslip의 중심에서 표면에 희석된 샘플의 장소 100 μ.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 어둠 속에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>긍정적인 통제를 준비 합니다.<ol>
<li>10 ng/mL의 장소 100 μ (단계 4.3)에서 5 mM HEPES NaOH pH 7.2는 avidin의 센터에서 코팅 coverslip 형광 biotin 정화.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 어둠 속에서 품 어. 참고:이 긍정적인 통제 coverslip 제공 한다 avidin 밀도 바인딩 관광 명소를, LO를 계산 하는 데 사용 되는.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부정적인 통제를 준비 합니다.<ol>
<li>스핀-코트는 플라즈마 (avidin) 없이 5 mM HEPES NaOH 및 2 mg/mL BSA의 200 μ와 coverslip 청소.</li>
		<li>건조 실 온에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>5 mM HEPES NaOH ph 7.2 10 ng/mL 정화 형광 biotin의 100 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 어둠 속에서 품 어. 참고:이 부정적인 제어 coverslip avidin 없이 coverslip에 형광 biotin의 일반적인 바인딩 양을 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>팁과 coverslip의 중간을 터치를 하지 coverslip의 가장자리에 pipetting으로 증류수 200 μ와 각 coverslip 린스. 이 세척 3 번 반복 합니다. 참고:는 coverslip에 발음, 후 물 즉시 두어야 한다 완전히 밖으로 건조에서 그것을 방지 하기 위해 coverslip에 다시.</li>
	<li>4.2 단계에서 coverslips의 동일한 수에 어 플라즈마에 노출.</li>
	<li>건조를 피하기 위해 단계 4.7에서에서 샘플 바인딩된 coverslip 청소 coverslip을 놓습니다.</li>
</ol>5입니다. 단일 분자 형광 현미경으로 관찰
<ol><li>넓은 필드 또는 사라져 분야 형광 현미경을 시작 합니다. 주의: 직접 또는 흩어져 레이저 방사선 눈 발생할 수 있습니다 또는 피부 손상. 적합 한 보호 고글을 착용 하 고 방패 레이저 빛 경로. 참고: 현미경 설치를 참조 하십시오 우리의 이전 게시16. 간단히, 고 전력 488 nm 레이저 구동, 높은 수 가늠 구멍 객 관 렌즈와 고감도 카메라 넓은 필드 또는 사라져 분야 형광 현미경이이 측정을 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 자동 측정, 컴퓨터 제어 XY 변환 샘플 단, 레이저 업무가 대 한 기계적 셔터와 자동 초점 시스템 설치에 권장 됩니다.</li>
	<li>현미경에는 coverslip를 설정 하 고 포커스를 찾을.</li>
	<li>적어도 100 이미지를 타일 스캔을 수행 합니다. 참고: 레이저 조명 photobleaching를 최소화 하기 위해 카메라와 이미지를 기록 하는 경우에 샘플에 노출 될 기계적 셔터와 제어 한다. 많은 샘플을 확인 하 고는, 자동된 측정 현미경 장치를 제어 하는 컴퓨터 프로그램을 사용 하 여 것이 좋습니다. 각 이미지 60 x 객관적 렌즈를 사용 하는 경우 일반적으로 100-500 단일 분자 관광 명소를 포함 합니다.</li>
</ol>6. 이미지 분석 및 정보 추출
<ol><li>이미지 흘 레이저 조명 패턴 때문에, 그것에 게18를 해결 하기 위해 이미지 처리 실시 합니다.<ol>
<li>균일 하 게 확산 염료 설정 단계 5.3 같은 카메라를 사용 하 여 구성 된 coverslip 샘플 측정 하 여 참조 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>없는 레이저 여기 같은 카메라 설정을 사용 하 여 측정 하 여 오프셋된 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>오프셋된 이미지의 가치와 모든 샘플 이미지와 참조 이미지에서 각 픽셀 값을 뺍니다.</li>
		<li>뺀된 참조 이미지에 값 뺀된 샘플 이미지의 각 픽셀 값을 나눕니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제대로 획득된 이미지 수집 및 이미지 배경 제거.<ol>
<li>큰 형광 집계를 수동으로 포함 된 이미지를 제거 합니다.</li>
		<li>ImageJ20를 사용 하 여 50 픽셀의 공 반경으로 회전 공 알고리즘19 를 적용 하 여 배경 이미지를 제거 합니다.</li>
		<li>ImageJ를 사용 하 여 흐린된 이미지를 빼서 이미지를 선명 하 게 (이미지 기능을 선명 하 게).</li>
	</ol>
</li>
	<li>찾아서 이미지 관광 명소 단일 분자 분석.<ol>
<li>ImageJ를 사용 하 여 엔 임계값 알고리즘21 단일 분자 관광 명소를 식별 합니다.</li>
		<li>제외할 카메라와 관광 명소의 어두운 소음 ImageJ (ROI 관리자)를 사용 하 여 단백질의 집계 제외 20 픽셀 미만 두 픽셀와 명소를 필터링 합니다.</li>
		<li>각 이미지에 관광 명소의 수를 계산 합니다. 조명 수정된 이미지 (6.1.4 단계) 분석을 사용 하 여 모든 명소에 대 한 픽셀 내에서 농도 총 ImageJ를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 수식을 사용 하 여 라벨 인 (LO)를 계산. LO = (샘플에서의 번호 / 긍정적인 컨트롤의 번호) x 100</li>
	<li>단일 단백질 분자 (n̄염료)에 바인딩된 형광 염료의 평균 수를 계산 합니다.<ol>
<li>모든 자리의 농도의 히스토그램을 분석 합니다. 참고: 히스토그램 일반적으로 여러 개의 봉우리, 그리고 모든 피크는 단백질에 바인딩된 염료 분자의 다른 수를 나타냅니다. 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 피크 히스토그램에 각각 1, 2, 3 분자에 해당.</li>
		<li>히스토그램에서 평균 강도 계산 합니다. 또한 가우스 피팅을 적용 하 여 첫 번째 피크의 피크 강도 계산 합니다.</li>
		<li>N̄염료 피크 강도 평균 강도 나누어 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed%2C+Comprehensive%2C+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li>
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저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): RIKEN SL 및 Y.T. 공동 발명가로 라는 이러한 결과에 특허 출원을 제기 했다.

이 문서는 SDS 페이지 (3 단계)와 분리 후 셀에 각 레이블이 단백질 종의 라벨 동질성을 계량 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분리 방법 분리 및 특수 장비23을 요구 하면서 높은 해상도, 세포질 단백질의 분류를 허용 하는 모 세관 전기 이동 법, 액체 크로마토그래피 등 다른 방법으로 교체하실 수 있습니다. 현재 프로토콜에 NHS 에스테 르를 사용 하 여 라벨 메서드 예 maleimide-에스테 르 또는 항 체를 사용 하 여 다른 방법으로 대체할 수 있습니다.
커플링 효율 분석에 가정 동질성 분석을 라벨에 대 한 요구 사항은 간단한 무작위 과정에서 일탈 얼마나 라벨에 따라 다릅니다. 우리의 최근 연구16 는 pH 및 세제 같은 반응 조건에 따라 임의의 프로세스에서 일탈 단백질의 NHS 에스테 르 레이블 표시. 우리는 몇 가지 조건 이종 단백질에 염료의 협력적인 바인딩 또는 불완전 한 가용 화 ...

프로테옴 분석, 셀에 표시 하는 단백질 분자의 전체 집합을 계량 하는 것을 목표로, 현재 생물의 약 연구에 귀중 한 접근 이다. 이 분석은 일반적으로 단백질 종 단백질 이온화1,2,3를 통해 생성 된 스펙트럼에 따라 식별 하는 질량 분석에 의존 합니다. 프로테옴 분석에 대 한 대체 방법 이며 전기 이동 법, polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 포함 하 여, 모 세관 전기 이동 법 2 차원 (2D) 젤 전기 이동 법. 이 방법은 일반적인 전기 이동 별거 및 탐지 및 정량화 각 단백질의 분석 된 셀에서 모든 단백질 분자의 형광 라벨에 의존 합니다. 달성 하기 위해 필요한 일반적인 단백질 라벨, 하나의 전략 Coomassie Blue와 Sypro-루비4,5,6 등 정전기 및 소수 성 상호 작용을 통해 단백질을 바인딩할 수 있는 형광 염료를 사용 하는 . N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 또는 maleimide, 1 차 아민 및 thiols와 같은 일반적인 잔류물을 통해 단백질에 묶는 covalently 수 있습니다, 각각7, 를 포함 하는 염료와 화학식 라벨을 사용 하는 대체 전략은 8.
한편, 형광 검출의 감도 낮은 풍부한 단백질 및 세포의 작은 숫자 분석에 이상적입니다. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 염료와 생체 외와 생체 조건9,10,,1112, 레이블이 지정 된 단백질의 검출을 허용 하는 가장 중요 한 방법 중 하나는 13,,1415. 응용 프로그램 이미징이 방법의 전기 기반 프로테옴 분석을 개별 붙일 표시 된 단백질을 계산 하 여 매우 민감하고 양적 분석을 사용 예정입니다. 그러나, 남아 있다 불분명 여부 형광 염료로 충분히 균질에 걸쳐 모든 단백질 분자 이며 어떻게이 동질성 다른 단백질 종 (그림 1)에 의해 영향을 받습니다. 간단한 대량 솔루션 측정 '커플링 효율'8 또는 '효율 라벨' 라는 단백질에 형광 염료의 어 금 니 비율을 얻기 위해 사용할 수 있지만이 속성 중 라벨의 동질성에 정보를 제공 하지 않습니다. 단백질 분자입니다.
여기, 우리는 라벨 동질성16셀 (그림 2) 모든 단백질 종에 대 한 조사 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 분석 결과의 두 가지 주요 단계는 단백질 정화 및 이미징. 첫 번째 단계에서 셀에 모든 단백질은 붙일 표시 하 고 biotinylated, 다음 별도로 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 압축을 푼 뒤에 electroelution. 두 번째 단계에서 추출 된 표본에서 개별 단백질 분자의 형광 속성 단일 분자 이미징에 따라 평가 됩니다. 우리가 라벨 인 (LO)16, 전화와 형광 염료의 평균 수는 단일 단백질 분자에 바인딩된는이 데이터를 매개 변수 계산 분석에 대 한 중요 한 단백질의 비율 이라고 적어도 한 같은 염색 (n̄ 염료), 특성화 될 수 있습니다. 프로토콜, NHS 에스테 르 기반 Cyanine 3 (Cy3) 염료와 HeLa 세포 프로테옴을 라벨에 대 한 최적화 절차를 예를 들어, 제시 하 고 원하는 연구 목표에 따라 다른 레이블 프로시저를 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>22x22x0.15mm 커버슬립</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488nm 아르곤 레이저</td><td>Coherent</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488nm 이색성 미러</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>488nm 방출 필터</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>560nm 이색성 필터</td><td>Semrock</td><td>Di02-R561</td><td></td></tr><tr><td>560nm 방출 필터</td><td>Semrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>560nm 파이버 레이저</td><td>MBP 통신</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>60x 오일 이멀젼 렌즈</td><td>Olympus</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-amine</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Alexa Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borate</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-에스테르 염료</td><td>GE 헬스케어</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>투석기&nbsp; - D-튜브, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>Epi 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>젤 뷰어</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테레신 믹스</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>Size 정화 칼럼 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

셀 proteomes 전기 이동 법 분석 실험, 세포에 있는 단백질의 모든 종 형광 염료와 레이블이 아닌 구체적으로 하 고 그들의 분리에 따라 매칭에 의해 발견을 사용 하 여 특징. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 분자 시각화 능력 磁 단백질 검출을 제공할 수 있다. 그러나, 전기 이동 법 분석 실험에이 강력한 이미징 방법의 응용은 프로테옴 걸쳐 각 단백질의 형광 라벨의 동질성을 특성화 하는 방법의 부족에 의해 방해 된다. 여기, 우리는 단일 분자 형광 이미징 분석 결과에 따라 프로테옴 걸쳐 라벨 동질성을 평가 하는 방법을 개발 했다. 헬러 세포 샘플, 우리는 '라벨 인' 되 나 적어도 하나의 염료와 함께 표시 하는 단백질의 비율을 사용 하 여 측정에서 (LO), 결정 되었다 범위를 50%에서 90%, 단일 분자 이미징에 응용 프로그램의 높은 잠재력을 지 원하는 민감하고 정확한 프로테옴 분석입니다.

그림 4 는 긍정적이 고 부정적인 제어 뿐 아니라 HeLa 세포, lysate에서 단백질의 다른 분자량 분수에 대 한 원시 이미지 데이터를 나타냅니다. 단백질 견본 및 긍정적인 이미지 당 100-500 전시 명소를 제어 하는 동안 부정적인 컨트롤 없음 또는 프로토콜 충분히 coverslip 표면에 염료의 일반적인 바인딩을 억제를 보여주는 몇 가지 관광 명소를 표시 합니다. 자리 강도 히스토그램 단백질 샘플 및 긍정적인 통제에 대 한 여러 봉우리, 대표 하는 염료의 확률적 바인딩 단백질 및 avidin tetramer 구조22, 1 차 아민을 각각 제시. 모든 관광 명소 깜박이 stepwise photobleaching 연속 레이저 여기, (그림 5AB) 단일 분자 수준에서 관찰을 강조 했다.<...

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

이 방법은 계수를 위한 단일 분자 공정을 가진 액체 견본에 있는 단백질 양을 정량화의 보정을 보여줍니다. 특히, 단백질 인구가 각 분자 수준에서 형광으로 표시될 수 있는 방법을 설명할 수 있습니다. 이전 방법은 형광 및 단백질 분자의 어금니 비율을 분석하기 위해 대량 측정을 수행했지만 이질적으로 단백질 인구가 실제로 어떻게 표지되는지 밝힐 수 없습니다.우리의 방법은 단일 분자 수준에서 직접 할 수 있습니다. 우리의 방법은 표본에 있는 병원성 분자의 능률적인 사실 인정을 허용하는 미래 진단 방법으로 이끌어 낼 초감도및 향상된 분자 농도 assays를 향해 확장될 수 있습니다. 우리의 방법은 형광 항체를 이용한 단일 단백질 종 분석뿐만 아니라 전기 전구 또는 크로마토그래피로 분리된 모든 단백질에 대한 비특이적 라벨을 사용하여 다중 종 분석에 적용될 수 있습니다.이 기술의 가장 중요한 점은 데이터 재현성을 얻는 것입니다. 여러 샘플을 측정할 때 가능한 한 동일한 실험 상태를 유지하는 것이 좋습니다. 이 기술의 시각적 데모는 각 실험 단계를 안정적이고 재현 가능하게 만드는 방법을 제공합니다.또한 현미경 커버립의 스핀 코팅 및 세척과 같은 생화학 프로토콜에서 몇 가지 드문 단계를 보여줄 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액 버퍼와 1%Tween-20을 준비합니다. 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 12로 조정합니다.1개의 어금니 DDT의 마이크로리터 1개, 50%CHAPS의 4개의 마이크로리터와 100마이크로리터의 리싱 버퍼를 섞는다. 준비된 세포 배양의 마이크로리터 1개를 추가하고 거품을 피하기 위해 느린 파이펫팅으로 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요와 함께 실온에서 5 분 동안 어둠 속에서 배양.그런 다음, 천천히 위아래로 파이프하여 용액을 다시 호질화. Cy3 NHS 에스테르 염료 1 마이크로그램을 추가하고 거품을 피하기 위해 파이프팅을 느리게하여 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요로 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.이 과정을 반복하여 동일한 양의 염료를 추가하고 샘플을 한 번 배양합니다. 용액의 pH를 7.2로 조정하고 반응을 담금질하기 위해 0.8 개의 어금니 HEPES-수산화 나트륨의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 용액을 균질화하기 위해 위아래로 천천히 파이펫을 합니다.다음으로, 비오틴-2-아민 2-아민의 마이크로리터 20개와 EDC 5마이크로리터를 추가합니다. 천천히 위아래로 피펫을 하여 용액을 균질화합니다. 부드러운 동요와 실온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 배양.그 후 10킬로달톤 컷오프가 있는 초여열을 사용하여 반응되지 않은 라벨링 시약을 제거하고 시료를 농축합니다. 단백질 샘플 및 분자 사다리에 대한 표준 SDS-PAGE를 수행한 후, 젤을 이미지하여 단백질 밴드의 위치를 식별한다. 날카로운 블레이드를 사용하여 밴드의 위치에 따라 관심있는 단백질 분수를 포함하는 젤 부분을 잘라냅니다.먼저 22mm x 22밀리미터, 두께0.15밀리미터의 커버립을 설정합니다. 플라즈마 클리너를 사용하여 커버립을 공기 플라즈마에 1분 동안 노출하여 표면을 청소하고 활성화합니다. 다음으로 스핀 코터를 사용하여 500RPM에서 5초 동안 200 마이크로리터의 아바딘 버퍼로 커버립을 코팅하고 1000RPM에서 30초가 됩니다.커버립을 실온에서 15분간 배양하여 공기가 건조해질 수 있도록 합니다. 단백질 샘플을 위한 커버립을 준비하려면 희석된 단백질 샘플을 사용하십시오. 희석된 시료 100마이크로리터를 아바딘 코팅 커버립의 중앙에 놓습니다.실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 양성 조절을 준비하려면 정제형 형광 비오틴 100마이크로리터를 5개의 마이크로몰라 HEPES-수산화나트륨에 pH 7.2의 중앙에 배치하여 아바딘 코팅 커버슬립의 중심에 놓습니다. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요.음의 대조를 준비하기 위해 스핀 코트 플라즈마 커버립5 HEPES-나트륨 수산화기의 200 마이크로 리터와 아바딘없이 BSA의 밀리리터 당 2 밀리그램. pH 7.2에서 5개의 마이크로몰라 HEPES-나트륨 수산화제에 100마이크로리터를 정제형 형광 바이오틴에 첨가하십시오. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.그 후, 각 커버슬립을 가장자리에 파이펫으로 200 마이크로리터의 증류수를 헹구고 파이펫 팁으로 커버슬립의 중간을 만지지 않도록 하십시오. 이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 1 분 동안 공기 플라즈마에 동일한 수의 새로운 커버립을 노출하십시오.건조를 피하기 위해 각 샘플 바인딩 커버슬립 위에 청소된 커버슬립을 놓습니다. 넓은 필드 또는 에반에센트 필드 형광 현미경을 시작합니다. 현미경에 커버 슬립을 설정하고 초점을 찾을 수 있습니다.그런 다음 타일 스캔을 수행하여 최소 100개의 이미지를 얻습니다. 이 연구에서는, 세포에 있는 각 표지된 단백질 종의 표기 균질성은 SDS-PAGE로 분리 한 후에 정량화됩니다. HeLa 세포 용해에서 단백질의 다른 분자량 분획뿐만 아니라 긍정적이고 부정적인 대조군을 위한 원시 이미지 데이터는 여기에서 볼 수 있습니다.단백질 샘플과 양성 대조군 모두 이미지당 100~500개의 반점을 나타내지만, 음의 대조는 거의 없는 것으로 나타낸다. 이것은 프로세스가 커버 슬립 표면에 염료의 비특이적 결합을 충분히 억제한다는 것을 보여줍니다. 단백질 샘플과 양성 제어를 위한 반점 강도 히스토그램은 각각 단백질 및 아바딘 테트라머 구조의 1차 아민에 염료의 야상적 결합을 나타내는 여러 봉우리를 제시한다.모든 반점은 연속 레이저 여기와 깜박임과 단계별 광표백을 보여 주었다, 단일 분자 수준에서 관찰을 강조. 라벨링 점유, 또는 LO는, 그 때 양성 대조군에서 모든 단백질 샘플에 있는 반점의 수의 비율에서 계산됩니다. HeLa 세포 용해 샘플에서 측정된 LO는 더 작은 분자량 분획의 경우 50%에서 더 높은 분자량 분획의 경우 90%까지 다양합니다.분리가 없는 전체 프로테오메 시료에 대한 LO는 72%로 볼 수 있으며, 특히 커버립을 준비하는 동안 갓 만든 시약을 사용하고 먼지를 피하는 것이 중요하다. 이 절차에 따라, 특정 부피에서 단일 분자 계수 분석은 각 단백질의 농도를 정량화하기 위해 수행 될 수있다. 예를 들어, 임의의 원료 제품, 또는 겔 및 모세관 전기포고염 제품에 대한 분석은 수행될 수 있다.이 기술은 분자 의학, 유기 화학 및 omics 분석에 단 하나 분자 형광 화상 진찰을 이용하기 위한 도로를 포장합니다. 농도와 숫자 사이의 개념을 연결하는 것입니다. 농축 된 수산화 나트륨은 부식성이며, 그것을 취급할 때 적절한 보호가 착용되어야합니다.또한, 고출력 레이저 방사선은 눈 손상을 일으킬 수 있으므로 보호 고글을 착용 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수...

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

고처리량 프로토콜은 단백질체학 및 글리코믹스 정제와 혈장에서 LC-MS/MS 정량화를 결합하기 위해 개발되었습니다. N-linked glycosylation motifs의 탈아미드화 분석은 탈glycosylated 부위에 특이적이었습니다. N-글리칸의 정확한 정량화는 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 필터 지원 N-글라이칸 분리를 개별성 정규화에 결합함으로써 달성되었습니다.

양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

단백질 추출, 정량화, 강수량, 소화, 라벨링, 프로테오믹스 시설에 대한 제출, 데이터 분석 등 각 단계에 대한 자세한 정보를 포함하는 최적화된 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링 프로토콜을 제시합니다.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.

Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

학습하세요 단일 분자 수준에서 단백질 라벨링 균일성을 정량화하는 방법을. 형광 표지와 전기영동을 활용하여 복합 샘플 내 단백질 종의 이질성을 정밀 분석하고, 향후 진단 적용을 위한 초민감 분자 농도 측정 기술을 개발합니다.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

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