Name: 중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 학습하세요 마우스 중추신경계로 비강 siRNA 전달을 위한 위치 장치 사용법을. 이 방법은 유전자 침묵 효율을 높이고 재현성 있는 결과를 제공하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 한국보건복지부(HI17C1046)가 SK.L.에 후원했습니다.

모든 실험은 한양대학교 동물보호및사용위원회가 승인한 지침과 프로토콜에 따라 수행되었다. 이 프로토콜에서는 20-25 g의 6주령 Balb/c 마우스를 사용하였다(그룹당 n=3). 동물은 물과 음식에 무료로 접근 할 수있는 제어 온도 와 습도 수준에서 12 시간 빛 / 어두운 사이클과 병원균이없는 시설에 보관되었다.
1. 장치 어셈블리
<ol><li>그림 1A와같이 위치 지정 장치의 개별 부품을 어셈블합니다. 참고: 이 장치는 쉽게 조립 및 분해할 수 있는 개별 부품으로 제공됩니다.</li>
</ol>2. 재료 설정
참고 : 액화 약물의 IN 투여에는 다음과 같은 전처리 단계가 필요합니다.
<ol><li>포지셔닝 장치, 10 μL 마이크로파이펫, 10 μL 마이크로파이펫 팁, 처리 용액(예를 들어, RVG9R-siRNA 복합체), 타이머 클럭 및 70% 에탄올을 포함하는 필요한 물질을 준비한다(도 2A참조).</li>
	<li>전원 코드를 연결하여 실험 최소 15-20분 전에 장치 가열 시스템을 켭니다. 동물 실험을 위한 최적 온도는 ~37°C에서 자동으로 유지됩니다.</li>
	<li>마취 케타민:자일라진:인산완충식염수(PBS)를 1:0.5:8.5의 비율로 준비하고 마우스 20g당 200 μL의 최종 부피에서 단일 복강내 주사(i.p.)로 각 마우스를 마취합니다. 참고 : 30-45 분 동안 마취 상태를 보장하기위한 최적화 된 약물을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 마우스 위치 지정
<ol><li>외과 용 평면을 유지하기 위해 페달 반사 (단단한 발가락 핀치)로 마취 수준을 평가하십시오.</li>
	<li>필요한 모든 시약에 편리하게 접근할 수 있도록 위치 지정 장치를 적절한 거리와 높이에 놓습니다.</li>
	<li>마우스가 제대로 마취되면 엄지와 포인터 손가락으로 목 덜미로 각 마우스를 부드럽게 들어 올려 지정된 의자에 놓습니다.</li>
	<li>이 단계에서는 의자에 마우스를 적절히 배치하는 것이 매우 중요합니다. 마우스의 뒷면을 의자의 뒤쪽 지지대와 평행하게 놓고 의자 시트에 90°로 놓습니다. 그림 2B와같이 마우스에서 손을 떼고 동물이 밀거나 누르지 않고 머리 아래 및 앞으로 위치에 자연스럽게 놓이게 하십시오. 동물이 편안한 위치에있는 동안 마우스의 앞다리가 마우스에 불편함없이 자연스러운 지원을 제공해야합니다.</li>
	<li>마우스가 제대로 배치되면, 의자 벨트로 마우스를 묶고 즉시 IN 접종을 시작합니다.</li>
</ol>4. 비강 내 납품
참고: 이 프로토콜은 마우스 포지셔닝 장치를 사용하여 RVG9R:siRNA 복합체의 IN 전달을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 최대 20-30 μL의 용액을 각 마우스에 2 μL 방울로 쉽게 투여할 수 있습니다. 이 부피는 0.032 cm3인마우스의 비강보다 낮기 때문에 시술로 인해 치명적인 콧구멍 폐쇄 또는 질식이 발생하지 않습니다. 이 프로토콜은 적어도 4개의 마우스와 장치당 최대 8개의 마우스를 동시에 접종할 수 있게 해주며, 그 결과 시간 최적화와 가변성이 감소합니다.
<ol><li>10 μL 마이크로파이펫을 가지고 2 μL로 조정하십시오.</li>
	<li>2 μL의 RVG9R:siRNA 복합 용액으로 마이크로파이펫을 로드합니다(예를 들어, 전달 실험을 위해 RVG9R 의 104 μg로 착색된 siCy5의 5.2 μg, 그리고 13.5 μg의 siSOD1은 270 μg의 RVG9R로 착한 siSOD1의 siSOD1, 2의 실링 실험을 위한 최종 PVG9R의 270 μg을 포함, PBS의 최종 부피 5 % 포도당.</li>
	<li>피펫을 지배적인 손에 들고 벤치 상단에 팔꿈치를 놓아 위치를 조정합니다. 투여하는 동안 제어되지 않는 움직임을 피하기 위해 다른 손으로 파이펫을 들고 손을 지지하십시오.</li>
	<li>마우스가 직접 물방울을 흡입 할 수 있도록 ~ 2 μL 드롭을 하나의 콧구멍에 매우 가깝게 놓습니다 (그림 2B참조). 작은 방울이 쉽게 형성되지 않으면 파이펫 팁을 새 것으로 교체하고 작업을 반복합니다. 스톱워치를 사용하여 접종 사이의 시간 간격을 확인합니다.</li>
	<li>이 장치는 한 번에 적어도 4 개의 마우스를 치료 할 수 있습니다. 다른 마우스 그룹이 4.4 단계를 반복해야 하는 경우, 장치에서 한 번에 최대 8개의 마우스를 수용할 수 있도록 첫 번째 의자 위 또는 아래에 4개의 의자가 있는 다른 막대를 설정합니다.</li>
	<li>첫 번째 접종에서 3-4 분 후에 다른 콧구멍으로 4.4 단계를 반복하십시오. 이 시간 간격은 마우스가 첫 번째 용량의 흡입을 완료하고 정상적인 호흡을 복원하기에 충분합니다. 마우스의 나리스에서 우발적으로 코를 골아서 흡입 된 용액한 방울이 빠지면 2 μL의 용액을 추가로 회수하십시오.</li>
	<li>20-30 μL 용량이 완료 될 때까지 대체 콧구멍으로 전체 과정을 반복하십시오. 전체 접종 절차를 완료하는 데 ~ 30-45 분이 소요됩니다.</li>
	<li>마우스의 눈에 젖은 연고를 놓은 후 마우스를 지정된 케이지로 되돌리시고 되돌리시다. 참고: 마우스가 흉골 의전성을 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 방치하지 마십시오.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>형광 표지된 RVG9R의 뇌 침착을 확인하기 위해 마우스를 마취시키고(2.3단계에서 설명한 대로) 폐, 간, 비장 및 신장과 같은 다른 말초 기관뿐만 아니라 뇌를 분리합니다. ImageStation에 각 오르간을 놓고 ImageStation을 사용하여 형광을 시각화합니다.</li>
	<li>Cy5 라벨로 인한 형광을 시각화하려면 Hoechst 33342로 코스타인 20 μm 두께의 저온 절을 준비하고 공초점 현미경으로 전체 뇌 스캐닝을 수행합니다.</li>
	<li>유전자 침묵을 평가하기 위해 후각 전구, 피질, 해마, 시상 하부, 소뇌 및 뇌줄기와 같은 다양한 뇌 영역에서 RNA를 추출하고 RNA 정제 키트를 사용하여 cDNA를 사용하여 cDNA로 역전사합니다. 합성 키트, 그리고 앞서설명한대로 프라이머 쌍으로 qPCR을 수행 15.</li>
</ol>

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</ol>

P.K.와 SK.L.은 시그넷 생명 공학의 공동 설립자입니다. P.K.는 특허 PCT/US07/12,152의 공동 발명가로, 부분적으로 RVG9R과 관련된 클레임을 포함합니다. I.U., K.C., P.K., 및 S.K.L.은 마우스 포지셔닝 장치와 관련된 클레임을 포함하는 제출된 특허(PCT/KR2016/014220)의 공동 발명가로 등재되어 있습니다.

우리는 치료의 코 - 뇌 전달을위한 최적의 위치 마우스를위한 마우스 위치 장치를 개발했다. 이 장치는 다양한 기능을 갖추고 있어 동물을 쉽게 동시 취급할 수 있습니다. 또한 실험 중 동물의 생리적 체온유지를 위한 가열패드를 갖추고 있다. 마취된 마우스는 동물에게 최소한의 불편함으로 특별히 설계된 의자에 의해 머리 아래및 전방 위치에서 유지될 수 있습니다. 포지셔닝 의자의 높이는 약물을 투여하는 동안 동물 콧구멍을 시각화하는 것이 가장 좋은 방식으로 조정할 수 있습니다.
IN 뇌 전달은 콧구멍의 작은 표면적 (투여 당 최대 부피 20-30 μL 허용), 비강 자극, 상피 손상 및 비강 상피에 대한 제한된 흡수를 포함하여 몇 가지 본질적인 한계를 갖는다18. 이 IN 투여는 소핀 위치에 놓인 마우스에 액체 약물을 피펫 또는 폴리우레탄 튜브(24 G x 19 mm)를 통해 동물의 대체 nares에 떨어뜨리는 것으로 뇌 전달에 사용되어 왔으며, 마이크로리터 주사기(19)에 연결되었다. 20. 후각 상피 근처의 약물을 방출하는 튜브 시스템의 사용은 잠재적으로 적합한 접근법이지만 반복적 인 투여 시 자극이나 비강 염증을 유발합니다. 더욱이, 비강의 작은 크기는 이 접근을 제한합니다, 특히 반복에 의해 극복될 수 있는 마우스에서, 뿐만 아니라 비강 점막에서 지속되는 약 제형에 의해. 또 다른 옵션은 마우스(10)를깨우는 치료제의 IN 투여이다. 그러나, 이 접근은 IN 접종 도중 동물 취급을 위한 숙련된 절차가 요구됩니다. 또한, 그것은 동물 스트레스를 일으키는 원인이 되고, 그러므로, 질병 모형, 특히 전염병 모형을 위해 이상적이지 않습니다. 또한, 일관성 없는 주입 폐 또는 불완전 한 동물 그립으로 인해 위장에 약물 배수에서 쉽게 발생할 수 있습니다. 여기에 제시된 접근 방식은 과학자들이 이러한 기술적 장벽을 극복할 수 있게 합니다. 헤드 다운 및 전방 위치는 흡입하는 동안 코에서 폐로 약물 누출의 가능성을 감소, 뇌에 직접 및 선택적 siRNA 전달을 선호. 마우스 위치 지정 장치를 이용한 IN 딜리버리는 접종 동안 동물을 취급하거나 잡기 위한 어떠한 전문적인 기술도 필요로 하지 않는다. 한 번에 4마리의 동물을 적어도 30-45분 동안 치료할 수 있다. 절차는 추가 4 의자 바를 포함하여 확장될 수 있고, 동일한 실험 세션에서 최대 8개의 마우스의 쉬운 관리를 허용합니다. 따라서, 이 방법에 따라, 단일 연산자는 오랜 시간 동안 많은 동물 집단의 뇌로 약물 전달을 유도할 수 있다.
비강의 해부학 적 구조는 코 대 뇌 전달에 강하게 영향을 미칩니다 (Merkus et al.11 및 Ruigrok 및 de Lange21에서검토 한 바와 같이). 마우스에서 비강의 상대적 표면적은 인간보다 15배 크고 후각 상피의 상대적 표면적이 6배 더 큽하다. 설치류에 인간에 있는 비강의 해부학에 있는 중요한 다름이 있더라도, 몇몇 두뇌 무질서를 취급하기 위하여 IN 접근을 사용하여 진행중인 대략 45임상 시험이 있습니다 (www.clinicaltrials.gov). 여기에 제시된 연구 결과는 치료제의 IN 납품을 사용할 때, 과학자가 머리 위치, 수면 및 적당한 납품에이전트와 같은 몇몇 요인을 고려해야 한다는 것을 표시합니다.
우리는 마우스 두뇌에 형광표지된 siRNA의 능률적이고 특정한 증착을 보여주었습니다. 더욱이, IN siRNA 전달 후 관찰된 SOD1 유전자 발현의 현저한 감소는 기능적 효과를 확인하였다. 우리는 이전에 웨스트 나일 바이러스 (WNV) RNA를 표적으로 하는 RVG9R-siRNA 복합체의 IN 투여가 WNV 뇌염 에 강한 치료 효과를 발휘한다는 것을 일관되게 보여주었다15. 특히, 코-뇌 siRNA 전달은 복잡한 siRNA에 세포 표적 리간드(RVG) 및 양전하 분자(9R)를 필요로 했다. 이들 원소의 부재에서, 분자는 전신 회로 및 림프관 48시간 후처리를 통해 지워졌다(도3A)15. 따라서, 여기에 기술된 실험 설정에서, 우리는 뇌에서 특별히 유지된 수준만을 이미지화하기 위해 접종 후 펩티드/siRNA 국소화 48시간 동안 을 조사하였다. 이 접근법은 다수의 뇌 관련 장애의 치료를 위해 단백질, 펩티드 및 나노입자 또는 다른 치료법과 같은 다른 분자의 전달을 위해 쉽게 구현될 수 있다.

BBB는 ">400-600 Da의 조직적으로 투여된 분자가 뇌에 유입되는 것을 방지하며, CNS 및 뇌에영향을 미치는 질병에 대한 치료 생체 분자의 전달에 중대한 도전을 제기한다 1. 뇌에 직접 약물 전달은 입체 주입에 의해 달성 될 수있다; 그러나, 이것은 외과 전문 지식을 요구하고 주사 사이트에 근접한 지역에 납품에서 높게 제한됩니다, 일상적인 임상 사용을 위해 부적당하게만들기 2. IN 은 뇌에 전달하여 BBB를 우회하여 직접 적인 뇌 전달을 초래할 수 있으며, 다양한물질을 뇌에 직접적이고 신속하게 전달할 수 있도록 3,4. 이러한 전달은 비강을 뇌, 뇌척수액 및 림프계에 연결하는 후각 및 삼차 신경을 통한 수송 메커니즘에 의해 발생하는것으로 생각된다 5. 직접 코-뇌 경로 말초 장기와 조직을 포함 하지 않습니다, 그것은 실질적으로 전신 부작용을 감소 하 고 힘을 향상. IN 투여는 치료제의 뇌 전달을 위한 국소 및 전신 경로 모두에 대한 유망한 비침습적 대안이며 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 뇌암, 여러 임상 시험에서탐구되고있다 6,7,8.
접종의 부피 및 방법, 뿐만 아니라 제형 pH와 같은 몇몇 실험적 인자는, 코-뇌통로를통해 CNS에 약물 전달에 강하게 영향을 미친다 9. 마우스를 가진 연구 결과에서, IN 약 납품의 성공은 적당한 헤드 포지에 강하게 달려 있습니다, 이는 능률적인 두뇌 침착을 위해 중요하고 외부 환경 또는 기도로 약물 배수를 피하기 위하여. 특히, 설치류 연구의 대부분은 후각 상피에 약물 전달을위한 70 ° - 90 ° 기울기와 헤드 백 위치 (supine)를 사용, 비록 0 °에서 머리 위치는 기관으로 배수를 선호 할 수 있습니다9. 깨어있는 마우스에서 약물의 전달은 주로 오랜 시간 동안 원하는 위치에 마우스를 보유할 수 없기 때문에, 척추 위치에있는 임의의 응용 프로그램에 비해 감소 된 뇌 침착을 초래한다. 더욱이, 깨어있는 마우스를 위해 채택된 피부 그립 방법에 의해 요구되는 거꾸로 위치는 삼차 신경 및 후각 전구에 있는 약 증착 귀착됩니다, 신장과 폐와 같은 말초 기관, 30 분 안에 사후 접종10. 임상 연구에서 비인간 영장류와 같은 더 큰 동물에서 후각 또는 삼차 신경을 통한 치료제 전달에 가장 적합한 신체 위치는 머리 다운 및 포워드 위치(즉, 메카에게 기도하는 것)인 것으로 보입니다. 위치")11. 그러나, 이러한 위치는 마우스 모델에서 잘 연구되지 않았으며, 척추 위치는 설치류 연구에서 더 널리 사용된다.
이전에는 광견병 바이러스의 최소 수용체 결합 도메인을 기반으로 설계된 펩티드인 RVG9R이 뉴런 및 대식세포와 같은 니코틴 아세틸콜린 수용체 하위 단위를 발현하는 세포에 트로피즘을 표시하고 이를 중재하는 것으로 나타났습니다. 수용체 응집 부위에서 수용체 결합 및 임시 혈장 막 분화와 관련된 메커니즘에 의해 siRNA의 세포내 전달12,13. 중요한 것은, RVG9R-siRNA 복합체의 전신 정맥 투여는 CNS14로siRNA의 혈관 간 전달을 가능하게 한다. 그러나, 전신 경로는 CNS에 전달되는 siRNA의 양을 희석하고, 최근 데이터는 RVG9R:siRNA 복합체의 IN 투여가 헤드 다운 및 전방 위치에 위치하는 마우스에 대한 광범위한 표적 유전자 녹다운을 유도한다는 것을 보여준다. 뇌의 여러 영역15. 중요한 것은, 이 수준의 녹다운은 4회 투여량, 2일 처방에 걸쳐 투여된 13.5 μg의 적은 것으로 달성되었으며, IV 경로는 유사한 녹다운을 달성하기 위해 주사당 ~5배 더 높은 용량을 필요로 한다. IN 접근법의 유일한 단점은 용액을 투여하는 동안 양손을 계속 잡고 마우스를 머리 아래와 앞으로 그리고 둘 사이의 편안한 위치에서 계속 잡는 것이 힘든 절차라는 것입니다. 상당한 긴 치료 기간 동안 각 흡입 (마우스 당 ~ 20-30 μL 부피의 효과적인 섭취를위한 30-45 분 절차). 여기에 제시된 마우스 포지셔닝 장치를 사용하여 적절한 기간 내에 마우스의 여러 코호트를 치료할 뿐만 아니라 프로토콜을 수행하는 동물 및 요원에게 물리적 인 내구성이 거의없는 마우스의 적절한 배치를 가능하게하고, 질병15의후기 단계에서 마우스에 있는 서쪽 나일 뇌염을 위한 치료로 siRNAs를 사용에 관하여 심층적인 연구 결과를 가능하게 하 .

<table><tbody><tr><td>Comercial assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA synthesis kit</td><td>BioRad</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>RNAiso plus</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# 9108</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# RR420A</td><td></td></tr><tr><td>Dyes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# A30052</td><td></td></tr><tr><td>Mouse strain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>Orient Bio</td><td>N/A</td><td>6-8주령, 20-30g</td></tr><tr><td>Oligonucleotides and primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human CD4</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>Sense: 5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3'</td></tr><tr><td>siSOD1</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>감각: 5'-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'</td></tr><tr><td>GAPDH 프라이머</td><td>ST Pharm</td><td>해당 없음</td><td>: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3' R : 5 '-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3 '</td></tr><tr><td>SOD1 프라이머</td><td>ST Pharm</td><td>해당 없음</td><td>: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'</td></tr><tr><td>Peptides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RVG9R</td><td>Peptron</td><td>N/A</td><td>YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRR</td></tr><tr><td>RVM9R</td><td>Peptron</td><td>N/A</td><td>MNLLRKIVKNRRDREDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRR</td></tr><tr><td>소프트웨어, 알고리즘 및 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어 4.3</td><td>FlowJO, LLC</td><td>N/A</td><td>http://docs.flowjo.com/vx/</td></tr> <tr><td>마우스 포지셔닝 장치</td><td>Signet Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 소프트웨어</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td></tr> <tr><td>Prism 소프트웨어</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td></tr></tbody></table>

중추 신경계에 비강 sirna 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

뇌로의 약물 전달(IN)은 중추 신경계(CNS)로 약물을 전달하기 위한 혈액-뇌 장벽(BBB)을 우회하는 유망한 방법으로 대두되었다. 최근 연구는 펩티드의 사용을 보여줍니다, RVG9R, 광견병 바이러스 당단백질의 최소 수용체 결합 도메인을 통합, 뇌의 뉴런으로 siRNA의 전달을 유도에. 이 프로토콜에서, 펩티드-siRNA 제형은 지배적인 손에 있는 파이펫으로 무성하게 전달되고, 마취된 마우스는 폐로의 배수를 피하기 위해 "헤드 다운 및 포워드 위치"에서 비지배적 인 손으로 스크러프에 의해 억제됩니다. 흡입 시 위장에. 마우스의 이 정밀한 그립은 배울 수 있습니다 그러나 쉽지 않으며 효과적인 CNS 장악을 초래하기 위하여 연습과 기술이 필요합니다. 더욱이, 이 과정은 흡입당 1-2 μL 액적 부피에서 총 부피 ~20-30 μL의 투여를 위해 약 45분, 각 흡입 사이에 3-4분의 휴식 기간을 필요로 한다. 본 연구의 목적은 펩티드-siRNA 제형의 효율적인 IN 투여를 위해 마우스의 적절한 배치를 가능하게 하는 마우스 포지셔닝 장치를 개시하는 것이다. 조절 가능한 높이와 기울기가 있는 4개 또는 8개의 포지셔닝 의자와 같은 여러 가지 기능이 장치의 설계에 통합되어 머리 아래및 앞으로 위치에서 마취된 마우스를 억제하여 마우스의 nares와 시술 중 생쥐의 체온을 유지하기 위해 내장된 가열 패드. 중요한 것은, 이러한 방식으로 RVG9R-siRNA 복합체와 동시에 4개 또는 8개의 마우스를 치료하는 능력은 IN 치료 siRNA 접근법의 시험을 위해 훨씬 더 빠른 시간 척도에 대한 연구를 가능하게 한다. 결론적으로, 이 장치는 CNS 전달을 위해 RVG9R-siRNA 및 나노 입자 또는 항체와 같은 다른 치료 분자의 IN 적용을 위한 적절하고 제어된 마우스 헤드 포지셔닝을 허용한다.

IN 투여 동안 머리 위치는 뇌로의 약물 전달의 효율성에 큰 영향을 미친다. 여기서 우리는 마우스의 CNS에 혼합물의 전달을 위한 뇌 표적화 펩티드-siRNA 제형의 IN 투여를 위한 마우스 위치 결정 장치를 사용하여 헤드 다운-포워드 위치를 설명했다. IN 경로를 통한 전달을 확인하기 위해, 우리는 이전에 시험관 내 및 생체 내 세포 둘 다에 효율적으로 결합하는 것으로 나타난 RVG9R 펩티드를 사용하였다14,16.
우리는 먼저 여기에 설명된 마우스 포지셔닝 장치를 사용하여 Alexa Fluor 488(RVG9R-A488)으로표지된 RVG9R 펩티드의 코-뇌 전달을 시험하였다. 48시간 후, 뇌, 부비동, 폐, 간, 비장 및 신장을 포함한 다양한 장기를 절제하여 조직 관련 A488 형광을 측정하였다. nAchR을 결합하지 않는488 단독 또는 대조군 펩티드(RVM9R-A 488)(14)를 음성 대조군으로 사용하였다. 예상대로, A488 또는 RVM9R-A488은 48 시간 후 접종에서 어느 장기에서도 검출되지 않았다 (그림3A,왼쪽). 한편, 강력한 형광 A488 신호는 RVG9R 접종 그룹의 뇌에서독점적으로 검출되었다. 또한, 이 마우스 배치 위치를 효능을 위해 이전에17번사용되어 온 척추 위치 방법과 깨어 있는 방법까지 비교하였다. 우리는 RVG9R-A488 (100 μg)의 고정 된 양을 접종하고 48 시간 후 접종에서 분석 된 바이오 유통을 분석했습니다. 결과는 마우스 헤드를 하향 및 전진으로 위치시키는 것이 뇌 조직 전반에 걸쳐 RVG9R-A488의 침투 및 증착을 개선했다는 것을 나타냈다(그림3A,오른쪽). 대조적으로, 척추 위치에서 접종된 동물은 RVG9R-A488을 뇌로 전달하였지만 포지셔닝 장치 방법으로 볼 수 있는 것만큼 강하지는 않았다. 뇌로의 siRNA 전달을 추가로 확인하기 위해, 우리는 Cy5 표지된 siRNA의 400 pmol (5.2 μg)로 복합된 RVG9R의 단일 IN 투여 후 전체 뇌 스캐닝을 수행하였다. PBS 또는 RVM9R과 는 달리, RVG9R로 착색하면 후각 전구, 피질, 해마, 시상, 시상 하부, 중뇌 및 소뇌를 포함한 주요 뇌 영역에서 siRNA가 강하게 축적되었습니다(그림3B) ).
마지막으로, 우리는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제-1(SOD1) 유전자를 표적화하는 기능성 siRNA의 세포내 전달을 확인하기 위해 RT-qPCR 분석을 사용했습니다. 마우스를 RVG9R:siSOD1(siRNA의 13.2 μg)으로 연속일 3회 동안 접종하였고, SOD1 mRNA 발현을 마지막 접종 후 24시간 분석하였다. RVG9R:siSOD1 투여는 후각 전구에서 SOD1 발현의 상당한 감소를 초래했다 (63%), 피질 (47%), 해마 (61%), 시상 하부 (53%), 시상 하부 (55%), 중뇌 (39%), 및 소뇌 (30%) (그림4). 결론적으로, 포지셔닝 디바이스의 사용은 마우스에서 RVG9R 복합ssiRNA의 쉬운 IN 접종을 가능하게 하며, 그 결과 표적 유전자의 기능적 침묵을 유도하는 뇌 특이적 siRNA 전달을 유도한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig1.jpg"> 그림 1 : 장치 어셈블리의 사진 프레젠테이션. 위치 의자는 나사로 적절한 높이의 스탠드에 조립됩니다. 조립 후, 장치는 접종 시 생리적 온도로 가열하기 위한 전원 공급 장치에 연결된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig2.jpg"> 그림 2 : 위치 지정 장치를 사용하여 IN 접종 절차의 사진 프리젠 테이션. (A) IN 접종에 필요한 실험 장비. (B) 머리 아래 및 앞으로 위치에 있는 동물은 장치(왼쪽)에 앉고 IN 접종을 위한 2 μL 액적의 증착(오른쪽). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig3.jpg"> 그림 3 : IN 투여 후 형광 표지된 펩타이드 및 siRNA 의 분포. (A) 단일 IN 접종 후 48시간에서 경질 접종 된 RVG9R 펩티드의 생체 분포. 뇌 및 기타 말초 장기는 식염수(PBS), A488,RVM-A488및 RVG-A 488(왼쪽)으로 접종된 마우스에서 형광의 존재를 평가하였다. 위에서 언급한 바와 같이 처리된 마우스의 이미징은 깨어 있는 동안, 척추 위치에서, 그리고 마우스 위치에서 머리 아래-앞으로 위치(오른쪽)에서 고안된다. (B) 뇌에서 RVG9R:siRNA 복합체의 생체 분포 (n = 그룹당 3). Cy5 표지된 siRNA의 분포는 식염수(PBS)로 접종된 동물의 공초점 레이저 현미경으로 전체 뇌 저온절에서 가시화되었고, siRNA는 대조군 펩티드(RVM9R-siCy5) 또는 뇌 표적화 펩티드 RVG9R(RVG9R-siCy5)으로 착안하였다. 스케일 막대는 1 mm. 약어를 나타냅니다: o.b = 후각 전구; ctx = 피질; 해마 = 해마; hypo = 시상 하부; tha = 시상; m.b = 미드브레인; cer = 소뇌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig4.jpg"> 그림 4 : IN RVG9R:siSOD1은 뇌의 여러 영역에서 표적 유전자 침묵을 유도합니다. 표시된 뇌 영역에서 뮤린 SOD1 mRNA에 대한 qPCR 분석은 식염수의 마지막 IN 접종 후 24 시간, RVG9R : siCD4 (siCD4), RVM9R : siSOD1 (RVM9R), 및 RVG9R : siSOD1 (RVG9R). 후각 전구에서 의 상대SOD1 침묵, 피질, 해마 (상부), 시상, 시상 하부, 소뇌 (중간), 및 중뇌 (하부)가 도시된다. 데이터는 식염수 처리 된 마우스의 해당 데이터로 정규화 한 후 GAPDH에 상대적인 평균 ± SD를 나타냅니다(n = 그룹 당 3). IN 접종 후 표시된 뇌 영역에서 SOD1 mRNA의 백분율을 묘사하는 만화가 표시됩니다 (오른쪽 아래). **P &lt; 0.01, *** P &lt; 0.001. 약어: o.b = 후각 전구; ctx = 피질; 해마 = 해마; 저기 = 해마; tha = 시상; m.b = 미드브레인; cer = 소뇌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서, 우리는 중추 신경계에서 효과적인 유전자 침묵이 가능하게 하는 뇌 표적화 펩티드-siRNA 제제의 비강 내 투여를 위한 마우스의 적절한 배치를 가능하게 하는 마우스 포지셔닝 장치를 이용한 프로토콜을 제시한다.

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

이 프로토콜은 마우스 CNS에 생체 분자의 비강 내 전달을 위한 위치 지정 장치의 사용을 자세히 설명합니다. 이 장치의 사용은 마우스의 취급과 치료 시간을 크게 감소시켜 기술의 효율성과 재현성을 향상시킵니다. 이 절차를 시작하려면 수술 평면을 유지하기 위해 페달 반사에 의해 마우스의 마취 수준을 평가합니다.다음으로 위치 지정 장치를 적절한 거리와 높이에 배치하여 필요한 모든 시약에 편리하게 액세스할 수 있도록 합니다. 그런 다음 동물의 눈에 연고를 바하십시오. 의자 벨트로 마우스 한 개를 묶어 마우스의 앞다리가 불편함 없이 편안한 자세를 취하면서 자연스러운 지지를 제공하도록 합니다.나머지 마우스에 대한 절차를 반복합니다. 각 마우스를 의자의 등 받침지지에 평행하게 놓고 90도의 의자에 앉습니다. 동물이 밀거나 누르지 않고 머리 아래로 앞으로 위치에 자연스럽게 누워 보자.모든 마우스가 묶여 나면 즉시 비강 내 예방 접종을 시작합니다. 비강 내 전달을 수행하려면 RVG9R siRNA 복합 용액의 두 마이크로 리터로 마이크로 파이프를 로드합니다. 지배적 인 손에 파이펫을 잡고 siRNA를 투여하는 동안 제어되지 않는 움직임을 피하기 위해 다른 손으로 지원합니다.마우스가 직접 흡입할 수 있도록 두 개의 마이크로리터 액적을 한 콧구멍에 매우 가깝게 놓습니다. 작은 낙하가 쉽게 형성되지 않으면 파이펫 팁을 새 것으로 바꾸고 작업을 반복합니다. 마우스머리를 집게 손가락으로 5초 동안 부드럽게 밀어 내고 위치를 유지합니다.폐내 약물의 배수를 방지하기 위해 마우스가 흡입하는 동안 5 초 동안 검지 손가락으로 마우스 머리를 진정하게 밀어 넣는 것이 중요합니다. 스톱워치를 시작하여 3~4분 후에 첫 번째 마우스의 두 번째 나레에 접종을 합니다. 이 시간 간격은 마우스가 첫 번째 용량의 흡입을 완료하고 정상적인 호흡을 복원하는 데 필요합니다.첫 번째 마우스에 대체 나레스의 접종 사이의 3 ~ 4 분 간격에서, 장치에 배치 된 나머지 3 마리의 마우스 각각에 하나의 나레의 완전한 비강 접종. 스톱워치가 울리면 첫 번째 마우스에 두 번째 콧구멍을 접종하고 위와 같이 다른 마우스에 대한 절차를 반복합니다. 20~30마이크로리터가 4개의 마우스모두에 전달될 때까지 절차를 반복한다.전체 접종 절차를 완료하는 데 약 30~45분이 소요됩니다. 동물을 지정된 케이지로 돌려놓습니다. 그들은 흉골 수직을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 방치 마우스를 떠나지 마십시오.유전자 침묵을 평가하기 위하여는, RNA 정화 키트를 가진 각종 두뇌 지구에서 RNA를 추출하고, cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA로 전사를 역으로, 프라이머 쌍으로 qPCR을 능력을 발휘합니다. 알렉사 플루서(488)로 표지된 RVG9R 펩타이드의 대부분의 뇌 전달은 여기에 기재된 마우스 포지셔닝 장치를 사용하여 처음 테스트되었다. 접종 후 48 시간에서, 다양한 장기는 A488 형광을 측정하기 위해 절제되었다.부정적인 통제의 어떤 기관에서도 아무것도 발견되지 않았습니다. 한편, RVG9R 접종군의 뇌에서만 강한 형광 A488 신호가 검출되었다. 또한, 마우스 배치 위치는 효능에 대한 supine 위치 방법 및 깨어 있는 방법에 비해 하였다.결과는 마우스를 머리를 아래로 그리고 앞으로 배치하는 것은 두뇌 조직을 통해 RVG9R A488의 침투 및 증착을 향상했다는 것을 표시했습니다. 뇌에 대한 siRNA 전달을 추가로 확인하기 위해, 전체 뇌 스캐닝은 Cy5 라벨siRNA로 복잡한 RVG9R의 단일 내비강 투여 후 수행되었다. PBS 또는 RVM9R과 는 대조적으로, RVG9R로 복합화하는 것은 후각 전구, 피질, 해마, 해마, 시상 하부, 중간 두뇌 및 소뇌를 포함하여 주요 두뇌 지구에 있는 siRNA의 강한 축적 귀착되었습니다.위치 지정 장치는 마우스 CNS에 약물 또는 분자의 전달에 사용될 수 있다. 응용 프로그램은 치료뿐만 아니라 CNS에서 세포 메커니즘을 검사하는 것으로 확장됩니다. 이 포지셔닝 장치는 웨스트 나일 바이러스 질병 치료에 siRNAs의 효능을 입증하고 다른 CNS 질병에 대한 치료법을 탐구하기 위해 조사관에 의해 사용되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

intranasally 뇌를 타겟팅의 목적을 위해 깨어 마우스로 약물을 투여하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 긴 마취없이 약물의 비강 관리를 사용하는 기간, 그리고 최소한의 전신 노출과 코 - 투 - 뇌 전달을 통해 주입 반복 할 수 있습니다.

깨어 마우스로 CNS의 치료학의 비강 관리

이 비디오는 종양 용해성 바이러스가 로드된 치료용 신경 줄기 세포를 뇌종양 보유 마우스 모델에 비강 내 전달을 보여줍니다. 줄기세포의 비침습적 비강 내 투여는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 치료 적용을 위해 뇌의 종양 부위로 전달을 용이하게 합니다.

쥐 모델에서 치료용 신경 줄기세포(NSC)의 비강 내 전달: 종양 용해성 바이러스가 로드된 NSC를 뇌종양 베어링 마우스 모델에 종양 표적 전달하기 위한 절차

출처: Ullah, I., et.al. 중추신경계에 비강내 siRNA를 전달하는 동안 마우스를 배치하기 위한 포지셔닝 장치. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 특수 포지셔닝 장치를 사용하여 뉴런 표적 펩타이드-siRNA 복합체를 마우스 뇌에 전달하기 위한 정밀한 비강내 투여 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 폐 배액을 방지하면서 siRNA 흡입을 최적화하기 위해 머리를 아래로 향하게 하고 앞으로 고정합니다. 표적 펩타이드는 뉴런에서 수용체 매개 흡수를 촉진하여 뇌에서 표적 siRNA 전달 및 유전자 침묵을 가능하게 합니다.

포지셔닝 장치를 사용하여 마우스 뇌에 siRNA의 비강내 전달

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

출처: Kanazawa, T., et al. 코에서 뇌로 약물 전달을 평가하기 위한 흡입 마취 하에 비강내 투여를 위한 새로운 방법. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 코에서 뇌로 약물 전달을 달성하기 위해 마취된 마우스에 방사성 표지 약물을 비강내 투여하는 방법을 보여줍니다. 약물이 비강 상피를 통과하고 신경 경로를 통해 뇌에 도달하는 방법과 모양체 운동이 약물 보유 및 제거에 어떤 영향을 미치는지 설명합니다. 또한 비디오에서는 식도를 통해 캐뉼라를 삽입하여 모양체 운동에 반대하여 약물을 전달하고 유지력을 높이고 수송 효율성을 향상시키는 대체 역 캐뉼라 삽입 방법에 대해 설명합니다.

코에서 뇌로 약물 전달을 위한 피펫 및 역캐뉼라 삽입을 통한 마우스의 비강내 약물 투여

우리는 카테터를 이식하거나 마우스의 오른쪽 측면 뇌실에 알약 주입을 수행하여 중추 신경계에 약물을 대상으로하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 특히 초점을 맞 춥니 다. 이 기술은 다른 약물과 쥐에 쉽게 적응할 수있다.

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

MicroRNAs는 뇌에서 중요한 역할을 하며 신경 퇴행을 모델링하기 위한 잠재적인 표적입니다. 그러나 miRNA의 길이가 짧고 뇌 조직에 접근하기 어렵기 때문에 miRNA 수치를 교란하는 것은 어렵습니다. 이 비디오는 마우스에서 뉴로펩타이드를 사용하여 antagomir 설계 및 뇌 특이적 전달 방법을 제시합니다.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다.  siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

여기는 실험 동물에 대 한 안정적인 intranasal 관리 최소한의 물리적 스트레스와 흡입 마 취의 두 가지 새로운 방법에 설명합니다. 우리는 또한 방사선된 [14C]를 사용 하 여 코-투-두뇌 통로 통해 뇌에 약물 분포 레벨의 양적 평가 하는 방법 설명-수용 성 고분자의 모델 기판으로 눌린.

흡입 마 취 코-투-두뇌 약물 전달 평가 Intranasal 행정을 위한 새로운 방법

여기서, 우리는 척추의 요추 내 공간에 카테터를 이식하여 쥐 중추 신경계에 약물을 전달하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 초점을 맞추고, 이 방법은 뿐만 아니라 다른 치료 양식의 전달에 적합 하지만.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

학습하세요 마우스 중추신경계로 비강 siRNA 전달을 위한 위치 장치 사용법을. 이 방법은 유전자 침묵 효율을 높이고 재현성 있는 결과를 제공하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

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