Name: 스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 학습하세요 CRISPR-Cas9 특이성을 향상시키는 Sniper-screen 유도 진화 방법을 통해 대상 활동 손실 없이 off-target 효과를 줄이는 기술을. 이 프로토콜은 치료용 유전자 편집에 활용됩니다.

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이 연구는 과학 부와 한국 정보 통신 (2017M3A9B4061406) 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 (MSIT) (보조금 번호 2017M3A9B4061404 및 2018M3A9H3020844) Jungjoon 공화국에 의해 자금에서 교부 금에 의해 지원 되었다 리입니다. PGRG36 인코딩 플라스 미드 낸시 크레이그 (Addgene 플라스 미드 #16666)에서 선물 이었고 p11-레이스-wtx1 후 이민 자오에서 선물 했다.

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<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li>
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<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
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<li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190(2017).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191(2017).</li>
<li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+easy+and+efficient%3A+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39(2006).</li>
<li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenCFU%2C+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072(2013).</li>
<li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154(2005).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-Analyzer%3A+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li>
<li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li>
</ol>

ToolGen 스나이퍼 스크린을 다루는 특허 출원 (PCT/KR2017/006212)을 제기 했다 (상태: 보류, 발명가: Jungjoon K. Lee). Jungjoon 케이 리, Joonsun이, Minhee 정 Euihwan 정은 ToolGen, i n c.의 직원

스나이퍼-Cas9 단백질 및 인코딩 플라스 미드 스나이퍼-Cas9를 성가신 심사 절차를 피하려고 하는 사람들을 위해 사용할 수 있습니다. 높은 특이성 비율을 제공 하는 결정 한다 sgRNA의 최적의 길이 사용 하 여 이러한 자료. 또한, 스나이퍼-Cas9 및 sgRNA RNP 형태로 발생 하기 때문에 그것은 일반적으로 플라스 미드 형태로 배달 보다는 더 높은 특이성 비율에 좋습니다. 스나이퍼-Cas9, 달리 다른 조작된 Cas9 변종 잘린된 sgRNAs6,7 또는 예외 (고음질-Cas9) RNP 양식8 에서 배달와 호환 되지 않습니다.
스나이퍼-화면, 일치 하지 않는 시퀀스의 선택 가장 중요 한 단계입니다. GOI 시퀀스 향해 낮은 분열 활동에 연관 된 일치 하지 않는 sgRNA의 선택은 피해 야 한다. 그렇지 않다면, 특이성의 WT 수준 Cas9 변종 대장균 게놈 DNA 일치 하지 않는 대상 사이트를 쪼개 하지 것입니다. 이 효과 심사 절차 전체를 위태롭게 하는 배경 식민지의 많은 수에서 발생 합니다.
E. 콜라이 있기 때문에 빠른 시간 및 효 모, 스나이퍼-화면에 비해 높은 변환 효율을 두 배로 유리에 비해 효 모 기반 심사 방법. 또한, 스나이퍼 화면 다른 대장균보다 더 민감한 해야-는 플라스 미드에 일치 하지 않는 사이트를 수행 하는 시스템을 기반으로: genomic DNA의 1 개의 사본 및 따라서 단 하나 우리의 시스템에 많은 수의 일치 하지 않는 사이트의 복사본 플라스 미드는 단일 내에서 대장균 세포.
DSBs, Cpf1s, SaCas9 등을 유발 하는 다른 DNA endonucleases의 특이성도 스나이퍼-화면을 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 불행 하 게도, 스나이퍼 화면 기본 편집기 DSBs 대장균의 게놈 dna를 유도 하지 마십시오 때문에 직접, 기본 편집기의 특이성을 증가를 사용할 수 없습니다. Nickase 또는 Cas9의 그들의 시스템의 핵심에 죽은 버전을 사용 하는 기본 편집기, 스나이퍼 화면에서 얻은 안타를 사용 하 여 기본 편집기의 특이성을 증가 수 있습니다.

이 문서에서 우리는 다른 전략을 결합 하 여 Cas9의 특이성을 개선 하고자 합니다. CRISPR-Cas9의 대상 오프 효과 피하고 다양 한 방법 들이 개발 되었습니다. 예를 들어 잘린된 sgRNAs 높은 특이성1을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, Cas9 배달 방법 높은 특이성2를 RNP 형식 플라스 미드 형식에서 변경할 수 있습니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes Cas9의 특정 아미노산 잔류물 (SpCas9) 단백질에 따라 합리적인 수정 된 디자인3,,45설명한. 또한, 아미노산 잔류물 무작위 방식으로 변경 되었습니다 및 높은 특이성으로 Cas9 변종 대장균7,8 시스템 심사 또는 효 모6 을 사용 하 여 발견 했다.
그러나, 많은 그룹 보고 Cas9 변형 수 Cas9와 기판 전시 낮은 대상에 활동7,,89, 사이 일반적인 상호 작용을 디자인을 사용 하 여 설계 10 , 11 , 12. 우리는 대장균을 개발-감독된 진화 시스템, 스나이퍼-화면, 임의로 mutagenized Cas9 이체 화면을 기반으로. 시스템 심사는 E. 콜라이 대장균의 빠른 배로 시간과 더 높은 변환 효율성 때문에 효 모 시스템 장점이 있습니다.
부정적이 고 긍정적인 선택, 3 개의 다른 플라스 미드와 관심 (GOI)의 유전자를 대장균 게놈으로 통합에 따라 스나이퍼-화면에 사용 됩니다. Cas9 변종 대장균 에서 확인 된 후보자 subcloning 필요 없이 포유류 세포에서 테스트할 수 있도록 낮은 복사 번호 플라스 미드의 CMV PltetO1 듀얼 모터 시스템 아래 표시 됩니다. GOI Tn7 transposon 시스템을 사용 하 여 대장균 게놈으로 소개 된다. SgRNA 플라스 미드 복제의 온도 민감한 출처를 포함 하는 sgRNA GOI;을 대상으로 표현 그러나, sgRNA 및 GOI 시퀀스는 완벽 하 게 일치 되지. 완벽 하 게 일치 sgRNA 대상 사이트는 치명적인 제품 gyrase 독극물을 인코딩하는 ccdB 유전자를 포함 하는 세 번째 플라스 미드에 존재 합니다. 이 시스템에서 높은 오프 대상 활동 Cas9 이체를 표현 하는 세포 두 배 물가 틈 (DSBs)는 genomic DNA에 있는 일치 하지 않는 사이트에 도입 하기 때문에 제거 됩니다. 다른 한편으로, Cas9 변종 낮은 대상에 활동을 표현 하는 세포도 치명적인 ccdB 유전자 발현 때문에 제거 됩니다. Cas9 변종 식 수준 선택 힘을 조정 하는 anhydrotetracycline (ATC)의 농도 변경 하 여 변경할 수 있습니다.
우리는 그 시스템의 감도 증가 시킬 것입니다 보다는 플라스 미드는 genomic DNA에 일치 하지 않는 sgRNA 대상 사이트를 찾는 것을 권유. 이 방법의 장점은 하나의 게놈 사이트는 반면 각각 단일 내에서 대상 사이트를 포함 하는 많은 플라스 미드는 대장균 세포.
이 시스템을 사용 하 여, 우리는 Cas9 변종, 스나이퍼-Cas9, WT-대상에 활동을 표시 하 고 대상 오프 활동 WT Cas9에 비해 감소 확인. 스나이퍼-Cas9 잘린된 sgRNAs 또는 RNP 기반 배달 보다는 배달 플라스 미드-기반을 사용 하 여 더 높은 특이성 비율을 달성할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>알칼리성 포스파타제, 송아지 장(CIP)</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>피셔 케미컬</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>안하이드로테트라사이클린 염산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>37919 또는 94664</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액</td><td>웰진</td><td>LS203-01</td><td>배지 구성</td></tr><tr><td>요소 BamHI</td><td>효소학</td><td>R003L</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4408</td><td></td></tr><tr><td>다양화 PCR 무작위 돌연변이 유발</td><td>클론텍</td><td>630703</td><td>오류가 발생하기 쉬운 PCR 키트</td></tr><tr><td>DNA 셔플링 키트</td><td>Jena Bioscience</td><td>PP-103</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Welgene</td><td>LM001-17</td><td>Culture media</td></tr><tr><td>Endura Electrocompetent Cells (DUO)</td><td>Lucigen</td><td>60242-2</td><td>E. coli 라이브러리 준비를 위한 전기 역량 세포</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Welgene</td><td>S101-01</td><td>배지 구성</td></tr><tr><td>요소 Gene Pulser II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>E. coli electroporation 장비</td></tr><tr><td>GeneMorph II 무작위 돌연변이 유발 키트</td><td>Agilent</td><td>200550</td><td>오류가 발생하기 쉬운 PCR 키트</td></tr><tr><td>게놈 DNA 준비 kit</td><td>GenAll</td><td>106-152</td><td>gDNA-prep kit</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BioShop</td><td>GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>GP/MP 큐벳, 0.1cm</td><td>Bio-Rad</td><td>BR165-2089</td><td>E. coli electroporation equipment</td></tr><tr><td>HEK293T cell</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Human cell</td></tr> line <tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Acros Organics</td><td>450810500</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)- Arabinose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>LaboPass PCR 정제 키트</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>LaboPass 플라스미드 미니</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>미니 준비 키트</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Formedium</td><td>LMM0202</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth Miller</td><td>Formedium</td><td>LMM0102</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) 혼합물</td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Thermo</td><td>MPK5000</td><td>RNP Electroporation equipment</td></tr><tr><td>Neon Transfection System 10 &micro; L 키트</td><td>Thermo</td><td>MPK1096</td><td>RNP Electroporation 장비</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740420.50</td><td>Midi-prep kit</td></tr><tr><td>Oligo Clean & 저</td><td>용량 용리를 가능하게 하는</td>농축기 <td>Zymo Research</td><td>D4061</td> DNA 정제 키트</tr>, <tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>LS31985070</td><td>형질주입 배지</td></tr><tr><td>p11-lacY-wtx1</td><td>Addgene</td><td>#123945</td><td></td></tr><tr><td>pgrg36</td><td>Addgene</td><td>#16666</td><td>E. coli Mutator Strain</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>피로포파타제</td><td>NEB</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>리보뉴클레오티드 용액 세트</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0251L</td><td></td></tr><tr><td>터보 Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>효소노믹스</td><td>R013L</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Red 유능한 세포</td><td>애질런트</td><td>200129</td><td></td></tr></tbody></table>

스나이퍼-cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 crispr cas9의 영향을 최소화 하

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)의 개발-관련된 단백질 9 (Cas9) 치료 modalities에 요구는 잠재적으로 해로운 오프 대상 효과의 회피. 이러한 효과 줄이기 위해 여러 가지 방법은 고안 되었습니다. 여기, 우리는 대장균을 제시-기반의 지시 진화 방법 스나이퍼-화면으로 최적화 된 Cas9 variant를 불리고 스나이퍼-Cas9 라는 대상에 활동을 유지. 스나이퍼-화면을 사용 하 여, 긍정적이 고 부정적인 선택을 수행할 수 있습니다 동시에. 화면도 다른 단일 가이드 RNA (sgRNA) 시퀀스 진정한 긍정적인 안타에 대 한 풍부 하 게 반복할 수 있습니다. Cas9 변종 표현 하 CMV PltetO1 듀얼 모터를 사용 하 여 풀링된 라이브러리의 성능은 포유류 세포에 신속 하 게 확인할 수 있습니다. 또한 스나이퍼-Cas9의 특이성을 증가 하는 방법은 설명 합니다. 첫째, 잘린된 sgRNAs 사용 하 여 이전 Cas9 특이성을 증가 표시 되었습니다. 다른 조작된 Cas9s와 달리 스나이퍼 Cas9 잘린된 sgRNAs와 결합 될 때에 대상 활동의 야생-타입 (WT) 수준을 유지 합니다. 둘째, 플라스 미드 형식 대신 ribonucleoprotein (RNP) 형태로 스나이퍼-Cas9의 배달 대상에 활동을 영향을 주지 않고 가능 하다.

스나이퍼-화면 수행 된 후 생존 식민지의 백분율 파운드 플레이트 포함에 식민지의 수에 의해 페니, 대, arabinose, ATC (CKAA)을 포함 하는 파운드에 식민지의 수를 분할 하 여 계산할 수 있다 페니와 대만 (CK)입니다. 이 비율은 일반적으로 매우 낮은 때 스나이퍼 화면 SpCas9의 라이브러리와 함께 수행 했다. True-긍정적인 안타 살아남은 풀 화면을 반복 하 여 농축 수 있습니다. 이 대표 스나이퍼-화면에서 예를 들어 100% 생존 율 얻은 후 세 번째 화면 (그림 1). Transfections RNPs 또는 플라스 미드로 인코딩된 스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 다양 한 목표와 결과에 대상 할 수 있는 및 오프 대상 활동에 의해 측정 대상 amplicon 시퀀싱 (그림 2). 최대 및 대상, 스나이퍼 Cas9 보여준다에 대상 활동의 동일한 수준 WT. 끝을 자른 sgRNAs에 비해 더 높은 특이성 비 특이성 (그림 3)을 더욱 향상 하는 데 사용 또한 수 있습니다. 그러나, 그들의 사용 때문에 그들은 대부분의 경우에서 전체 길이 sgRNAs에 비해 낮은 대상에 활동 몇 가지 목표만 제한 됩니다. 따라서, 다양 한 길이 (에서 17-에 20-메)와 sgRNAs를 테스트 해야 합니다와 특이성을 최적화 하에 대상 및 대상 오프 활동을 측정 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg"> 그림 1: 대표 스나이퍼-화면 임의의 Cas9 이체의 다른 라이브러리를 사용 하 여 수행. 변경자 (mutator) 도서관, EP 라이브러리 어 EP 라이브러리 II 다른 상업용 키트를 사용 하 여 만든 라이브러리를 나타냅니다. 첫 번째, 두 번째, 및 최종 농축 화면 횟수 수행7나타냅니다. 이 그림은 리 외.7에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg"> 그림 2:-대상 및 대상 오프 활동 WT-Cas9 또는 스나이퍼-Cas9의 플라스 미드 또는 RNP 통해 전달 20-메 르 가이드 시퀀스와 짝. 특이성 비율 오프 대상 활동에 의해 대상에 작업을 분할 하 여 결정 했다. 오차 막대 표시 SEM (n = 3)7. 이 그림은 리 외.7에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg"> 그림 3: 대상에 및 오프 대상의 스나이퍼-Cas9 WT-Cas9 FANCF01 및 AAVS 사이트를 대상으로 하는 가변 길이와 sgRNAs를 사용 하 여 얻은에 비해 활동. 특이성 비율 나누어 indel 주파수에 대상 사이트에서 각 대상 오프 사이트에서 그 결정 했다. 5' 종점 (GX18 또는 GX19)에 일치 구 아닌과 sgRNAs과 일치 하지 않는 구 아닌 (gX17, gX18, gX19, 또는 gX20)와 함께 표시 됩니다. 정규화 된 대상에 활동 했다 특이성 비율 계산 하지 &lt; 707. 이 그림은 리 외.7에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리 CRISPR-Cas9-대상 활동의 손실 없이 더 높은 특이성을 달성 하기 위해 최적화 하는 프로토콜을 제시. 우리는 원하는 특성을 가진 돌연변이 Cas9를 찾을 수 라고 스나이퍼-화면 감독된 진화 접근을 사용 합니다. 스나이퍼-Cas9와 잘린된 단일 가이드 RNAs는 ribonucleoprotein 형태로 배달 높은 특이성을 달성 하기 위한 잘 알려진 전략 이다.

스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

자연에서 Cas9는 진화가 자발적인 돌연변이로 바이러스 DNA를 갈라질 수 있는 난잡한 특이성을 가진 Cas9를 선호하는 침입 바이러스에 대한 면역 단백질입니다. 우리는 높은 특이성을 가진 최적화된 Cas9 변종을 선호하는 인공 지향 진화 시스템을 구축했습니다. 부정과 긍정적 인 선택은 모두 스나이퍼 스크리닝 시스템에서 동시에 작동합니다.대상 활동이 감소한 Cas9 변형도 대상 활동을 한 번에 선별할 수 있습니다. 돌연변이는 무작위로 전체 Cas9 서열에 도입되어 선별될 라이브러리를 생성하였다. 그리고 이것은 예기치 않은 위치에서 돌연변이를 찾아내도록 가능하게 했습니다.현재, 학계와 업계의 많은 연구자들은 치료 개발을 위해 Y 형 Cas9을 사용하고 있습니다. 그러나 Y형 Cas9의 특이성은 최적화되지 않아 단단히 포장될 수 있습니다. 인간에서, 이것은 심각한 부작용으로 이끌어 낼 수 있는 무작위 유전자에 있는 예기치 않은 돌연변이를 의미합니다.치료에서 개발 되 고 효소 처럼 많은 Cas9 있다. 우리의 기술은 CPF1과 같은 지핑거, 태국 및 Cas9와 같은 그밖 DNA 및 핵의 특이성을 향상하기 위하여 이용될 수 있습니다. 라이브러리를 충분히 크게 만드는 것은 중요한 기능을 가진 변형을 얻을 수있는 가능성을 높이는 열쇠입니다.냉각 단계에서 높은 효율을 얻고 매우 효율적인 유능한 셀을 사용해야 합니다. 이 절차를 시작하려면 CCDB 플라스미드와 SGRNA 플라스미드의 나노그램 1개를 해동된 BW25141 GOI 세포의 50 마이크로리터에 이중 불일치를 추가합니다. 파이펫팅으로 세포를 부드럽게 섞어 0.1센티미터의 전기기큐벳으로 옮춥니다.전기포공을 통해 두 플라스미드로 대장균을 변형시키면 됩니다. 전기 포이션이 완료된 직후 SOC 배지 250마이크로리터를 추가합니다. 용액을 부드럽게 피펫하여 세포와 배지를 혼합하고 혼합물을 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 전달합니다.변형 된 세포를 복구하고 1 시간 동안 부드러운 흔들림과 함께 섭씨 32도에서 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Snyper 스크리닝 셀을 계속 준비합니다. 스니퍼 스크리닝을 수행할 준비가 되면, 이전에 설명된 엘클로포레이션 프로세스를 사용하여 각 라이브러리에서 제조된 Cas9 변종 플라스미드의 100나노그램으로 스니퍼 스크리닝 세포를 변환한다.그런 다음, 세포의 250 마이크로리터를 신선한 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 밀리리터당 10 나노그램의 최종 농도에 ATC 250 피코그램을 추가합니다. 부드러운 흔들림으로 1시간 동안 섭씨 32도에서 배양하여 ATC 함유 및 ATC 가 없는 세포를 모두 복구합니다.클로람페니콜과 카나마이신을 함유한 LB 한천 플레이트에 회수된 ATC 가루 세포의 25마이크로리터플레이트. 245mm LB 한천 플레이트에 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도에 세포를 함유하는 회수된 ATC에 ATC를 추가합니다. 즉시 클로람페니콜, 카나마이신 및 아라비노스를 포함하는 플레이트를 포함하는 LB 천에 ATC 함유 세포를 플레이트.모든 접시를 섭씨 32도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 접시를 촬영합니다. 개방형 CFU 소프트웨어를 사용하여 실행 가능한 식민지 수를 계산하여 비선택적 플레이트의 식민지 수가 라이브러리의 다양성보다 최소 10배 더 큰지 확인하여 모든 변형을 다룹니다.세 개의 라이브러리에서 선택적 판에 살아남은 식민지를 당깁니다. 이 풀이 풀린 식민지를 LB 배지 250밀리리터로 옮기고, 클로람페니콜로 보충하고, 하룻밤 사이에 섭씨 42도에서 배양합니다. 먼저 대상 사이트를 선택하려면 Cas OF 파인더 소프트웨어를 로드합니다.Cas9의 특정 유형및 표적 게놈에 적합한 PAM 유형을 선택합니다. 쿼리 시퀀스 탭을 입력합니다. 불일치 번호를 선택하고 제출 버튼을 클릭합니다.몇 초 후 대상 및 오프 타겟 사이트가 나타납니다. 일반적으로 1~3개의 불일치가 있는 오프 타겟 사이트를 선택합니다. 다음으로, CRRNA와 트랙 RRNA 올리고를 템플릿 시퀀스와 함께 주문하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 템플릿을 증폭시합니다.증폭된 템플릿 DNA의 2개의 마이크로리터를 분석한 다음 2%의 아가로즈 젤을 분석한 다음 템플릿을 정화합니다. 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, DNAse의 0.5 마이크로 리터를 추가하고 15 ~30 분 동안 섭씨 37도에서 배양 한 다음 SGRNA를 정화합니다.그런 다음, 10 마이크로그램의 종아리 장 알칼리인 인산염을 섭씨 3도에서 3시간 동안 250단위로 전사한 RNA를 치료하고, 100단위의 RNA 억제제가 있는 경우, 처리된 SGRNA를 정화한다. 먼저, DMEM에서 HEK293 T 세포를 유지하여 이산화탄소5%를 가진 섭씨 37도에서 10%의 FBS와 1%의 항생제를 보충합니다. 다음으로, 야생 타입 또는 Snyper Cas9 단백질 의 2 마이크로그램을 SGRNA 2마이크로그램과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 배양하여 RNP 복합체를 만듭니다.트립시닉하고 세포를 계산한 다음 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전기 화 완충제에서 준비합니다. RNP 복합체를 30밀리초 동안 1300볼트의 1펄스를 사용하여 세포로 전기포전을 합니다. 전기 기화 직후, DMEM의 500 마이크로 리터로 채워진 48 웰 플레이트에 세포를 판화하여 10 %의 FBS와 1 %의 항생제로 보충합니다.이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다. DMEM에서 HEK293 T 세포를 유지하여 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도에서 10%의 FBS와 1%의 항생제를 보충합니다. 배분 전날, 시험대와 셀카운트.48웰 척도에서 작업하는 경우, 플레이트 10, 000 셀 당 우물 당 및 완전한 성장 매체의 250 마이크로 리터. 지질 기반 형질 전환 시약을 사용하여 250 나노그램의 P3S Cas9 플라스미드와 250 나노그램의 SGRNA를 트랜스펙트용으로 준비합니다. 그런 다음, 혈청이없는 MEM의 25 마이크로 리터에 플라스미드를 혼합합니다.혈청이 없는 MEM 의 25 마이크로리터로 1마이크로리터의 트랜스페션 시약을 희석시. 이 혼합물을 실온에서 5분간 배양합니다. 플라스미드 혼합물을 트랜스페션 시약 혼합물과 결합하고 20분 동안 방에서 배양하여 플라스미드 리포펙타민 복합체를 형성합니다.그 후, 이 혼합물의 50 마이크로리터를 각 우물에 직접 첨가하여 세포를 함유하고 있다. 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 섞습니다. 트랜스 유전자 발현에 대한 속담 전에 48~72시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양한다.이전에 준비된 게놈 DNA를 격리한 후, GDNA의 PCR 증폭에 의해 심층 시퀀싱 라이브러리를 생성하고 표적 및 오프 타겟을 대상으로 하는 프라이머를 생성합니다. 그런 다음 인덱스 프라이머를 사용하여 각 샘플에 레이블을 지정합니다. 차세대 시퀀싱 기계를 사용하여 풀 라이브러리를 페어링된 끝 시퀀싱으로 조정합니다.스니퍼 스크린이 수행된 후, 선택적 LB 플레이트상의 콜로니 수를 비선택적 LB 플레이트상의 콜로니 수로 나누어 생존 식민지의 백분율을 계산할 수 있다. 이 비율은 일반적으로 SP Cas9 라이브러리로 수행할 때 매우 낮지만, 생존 풀로 화면을 반복하여 실제 포지티브 히트를 풍부하게 할 수 있습니다. 대표적인 스니퍼 스크린은 제3화면 이후에 100%의 생존율을 얻어낸다.RNP 또는 플라스미드 인코딩된 Snyper Cas9를 사용하는 트랜스포이션은 다양한 표적에 대해 수행될 수 있으며, 표적 증폭기 시퀀싱에 의해 측정된 결과 대상 및 오프 타겟 활동에 대해 수행할 수 있습니다. 대부분의 대상에서 Snyper Cas9는 야생 유형에 비해 대상 활동과 더 높은 특이성 비율을 보여줍니다. 잘린 SGRNAs는 특이성을 더욱 향상시키는 데 사용할 수도 있습니다.첫 번째 세척 단계에서 높은 변환 효율은 높은 특이성을 가진 클론을 잃지 않는 것이 매우 중요합니다. 나중에 스크리닝 단계는 클론이 이미 첫 번째 스크리닝 단계에서 풍부하기 때문에 변환 효율이 낮아지며 손실 가능성이 적습니다. 스니퍼 화면에서 발견된 복제본이 하나 이상 있습니다.이러한 클론의 대상 및 오프 타겟 활동은 최상의 성능으로 클론을 선택하는 가능한 한 많은 다른 대상을 특징으로한다. 이 방법을 통해 과학자들은 대상 활동의 손실없이 Cas9와 같은 효소의 특이성을 향상시킬 수 있습니다. 또한 과학자들은 개선을 위해 단백질 구조에 대한 사전 지식이 필요하지 않습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

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효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

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빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

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off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

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방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

학습하세요 CRISPR-Cas9 특이성을 향상시키는 Sniper-screen 유도 진화 방법을 통해 대상 활동 손실 없이 off-target 효과를 줄이는 기술을. 이 프로토콜은 치료용 유전자 편집에 활용됩니다.

스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하

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