Name: 사용자 지정 외부 Fixator를 안정화 하는 쥐에서 안정적이 고 재현 가능한 크기의 중요 한 단편 대 퇴 결함 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 쥐에서 외부 고정기를 이용한 대퇴골 결함 모델 수술법을 통해 뼈 치유 메커니즘과 재생 치료법을 평가하는 방법을. 이 기법은 정형외과 연구에 효과적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NIH 장비 그랜트 1S10OD023676-01 위스콘신 대학 정형 외과 부서와 재활 및의 대학 및 공중 보건을 통해 제공 하는 추가 지원에 지원 됩니다. UW의 Carbone 암 센터 지원 보조금 P30 CA014520 헤 마틴의 지원에 대 한 그들의 작은 동물 영상 시설, 뿐만 아니라 국립 보건원 훈련 그랜트 5T35OD011078-08의 사용을 인정 하 길. 우리 또한 Musculoskeletal 재생 파트너십의 그들의 지원에 대 한 마이클 및 메리 수 섀 넌을 감사합니다.

이 연구에 사용 된 쥐 동물의 안락사에 대 한 일일 케어 AVMA 지침에 따라 받은: 2013 판16. 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 위스콘신-매디슨 대학 평가 하 고 프로젝트를 시작 하기 전에이 실험 프로토콜을 승인 했다.
1입니다. 동물
<ol><li>무게 약 350 g outbred Sprague-Dawley 남성 쥐를 사용 합니다.</li>
</ol>2. 준비의 뼈 Morphogenetic 단백질-2 (rhBMP-2) 젖은 스폰지 건설 기계
참고: 비 계 준비 대 퇴 골에 이식 직전 발생 한다 (단계 6.14 참조).
<ol><li>콜라겐 스폰지, 동결 건조 된 rhBMP-2, 및 재구성17살 균 물 포함 하는 설립된 rhBMP-2 뼈 이식 키트의 사용에 대 한 제조 업체의 지침을 따릅니다. 무 균 유지, reconstitute 1.5 mg/mL의 농도에 살 균 물과 rhBMP 2.</li>
	<li>가 위 살 균 및 살 균 눈금자 using, 트림 rhBMP-2 배어 콜라겐 스폰지는 5 m m x 3 m m x 3 m m 결함에 맞게 바꿀 수 있습니다.</li>
	<li>주사기를 사용 하 여 배포 rhBMP-2 솔루션 균등 하 게 콜라겐 스폰지에 흡수 되는.</li>
</ol>3입니다. 사용자 지정 외부 고정 장치 준비
참고: 치수의 더 완전 한 목록에 대 한 1A 그림 참조.
<ol><li>2 알루미늄 시트 재고 (종류 6061, 0.088"두께)를 잘라 조각 (1.4" x 6")는 또는 다른 적절 한 도구를 사용 하 여.</li>
	<li>밀링 기계에 원피스를 탑재 하 고, 4 개의 'V' 홈 (0.035 깊은)를 잘라 1/8"90 °-포인트 카바 이드 드릴 선반을 사용 하 여, 세로로. 무료 커트의 다른 조각을 두십시오.</li>
	<li>두에서 0.3"폭의 개별 번호판을 잘라 조각 (그림 1B). 측정 하 고 4-40 스레드 나사 구멍을 드릴 합니다. 4-40 스레드 'V' 홈 플레이트를 누릅니다. #4 나사 신체 훈련에 대 한 홈 없이 접시 드릴.</li>
	<li>모래 모서리 둥글게 줄일 무게 (그림 1C)을 두 조각.</li>
	<li>그루브 일반 판 (그림 1D)에 대 한 플러시 되도록 4-40, 18-8 스테인리스 단추 머리 캡 나사 (0.25") 함께 조각을 스크류합니다</li>
</ol>4. 마 취 절차와 진통
<ol><li>4 %isoflurane 4 L O2/min 제공 유도 실에서 쥐를 배치 하 여 마 취를 유도. 주의: 연구 요원 마 취 가스의 흡입을 방지 하 고 적절 한 후드와 실험실에서 환기를 유지 해야 합니다.</li>
	<li>쥐 righting 반사 손실 후 상공에서 쥐를 제거 하 고 코 콘을 첨부 코 (2-3 L/min와 0.8 %isoflurane O2 배달 속도)를 통해 마 취의 유지 보수 복용량에.</li>
	<li>가 열 패드 또는 저체온증을 방지 하기 위해 지구 온난화 빛에서 쥐를 놓습니다.</li>
	<li>발가락을 곤란 하 게 하거나 종을 반사를 테스트 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다.</li>
	<li>윤 활 막의 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.</li>
	<li>트렁크/등의 수술 후 최대 3 일 동안 진통 제공 하는 외과 사이트, 멀리 쥐에서 확장 릴리스 buprenorphine (1 mg/kg)의 피하 주사를 제공 합니다.</li>
</ol>5. 무 균 준비 및 항생제 preventatives
<ol><li>Hindleg 여백으로 13번째 늑 골, 발, 등 쪽 정중 선, 그리고 복 부 중간을 사용 하 여 주변을 면도.</li>
	<li>10 %povidone-요오드 70% 뒤 젖은 멸 균 2 x 2 거 즈를 사용 하 여 면도 스크럽 영역 EtOH (4 회 각각, 교류).</li>
	<li>관리 요원 quadriceps에 cefazolin (20 mg/kg)의 근육 주사 합니다.</li>
	<li>Postoperatively 지속적인된 항생제 보호를 위해 7 일 동안 식용 수에 있는 enrofloxacin (0.25 mg/ml)를 관리 합니다.</li>
	<li>핀으로 감염을 방지 하기 위해 연구 기간에 대 한 치료 피드 (예: Uniprim)에 쥐를 놓으십시오.</li>
	<li>적용 더블 항생제 연 고 피부 핀 인터페이스를 한 번에 매일 3 일 동안 postoperatively. 참고: 모든 외부 고정 핀을 피 하거나 감염의 발전에 기여할 수 있는 완화 클램프.</li>
</ol>6. 수술
참고: 확인 한 공동 노력을 살 균 분야 및 작업 영역을 유지 하 고 경우의 전체에 걸쳐 메 마른 기술 따라 하.
<ol><li>Fenestrated, 분명 스티커 드 레이프와 살 균 필드를 만드는 메 마른 수건에 커버 외과 벤치를 통해 면도 다리를 확장 합니다.</li>
	<li>대 퇴 골을 만져 하 고 #15 블레이드를 사용 하 여 근 위 대 퇴 골에 더 중대 한 trochanter 슬 개 골에서 연장 하는 피부를 통해 anterolateral 절 개를 만듭니다.</li>
	<li>조심 스럽게 분리 하는 근육의 vastus lateralis 근육 anteriorly는 근육에서 뒤로 측면 대 퇴 골 노출까지 질의 심장 따라 측면 다리 근 막 incise. 더 중대 한 trochanter에 납치범 gluteal 힘 줄 삽입을 유지 합니다.</li>
	<li>주의 atraumatic 원주 연 조직 절 개를 수행 하 고 대 퇴 골의 중간 diaphysis 측면 표면에 시작에 노출. 이렇게 하려면 #15 블레이드를 사용 하 여 부드럽게 뼈 표면의 윤곽에 대 한 병렬 블레이드를 유지 하 여 기본 뼈에서 근육을 잘라. Periosteal 엘리베이터를 사용 하 여 노출 된 뼈에서 근육으로 해 부 되 고 중앙 diaphysis의 7-10 m m ostectomy에 대 한 준비를 모든 면에서 연약한 조직 삭제 될 때까지 대 퇴 샤프트 주위 진행. 참고: 내측 대 퇴 혈관 번들에 부상을 피하십시오.</li>
	<li>4 1.0 m m Kirschner (k) 전선 삽입: 2 근 2 수직 측면 대 퇴 골, 대 퇴 골에서 원심 감독 중간에 바로 옆. 적절 한 안정성 (그림 2A)에 대 한 두 외피가 (bicortical)을 종사 하는 모든 핀을 확인 합니다.</li>
	<li>그냥 측면 뼈의 수준에서 처음, 원심 가장 핀부터 시작. 장소 지 그를 측면 원심 대 퇴 골을 1.0 스레드 끝 k-와이어를 삽입 합니다.</li>
	<li>뼈에 지 그의 위치를 유지, 가장 근 위 핀 지 그 구멍에 따라 뼈를 입력 것입니다 식별 합니다. 위치 결정 되 면 신중 하 게 incise gluteal 힘 줄의 섬유에 평행으로 통과, 근 위 핀에 대 한 조직에 작은 차이 만드는 데 필요한 힘에 의원 성 손상을 최소화. 1.0 m m 비-스레드 k-와이어가이 간격에 다시 핀 종사 두 외피가 (그림 2B) 보장 드릴.</li>
	<li>지 그의 위치는 뼈와 접촉을 유지 하 고 두 개의 스레드 1.0 m m k-와이어, 미래의 결함 사이트의 양쪽에 하나씩 드릴. 핀 두 외피가 (그림 2C) 참여 확인 합니다.</li>
	<li>피부 위에 레벨 1 cm 바 외부 fixator를 놓고 긴밀 하 게, 자리에 바 잠금 나사. 클립 초과 핀 길이 (그림 2D).</li>
	<li>앞쪽 및 후부 대 퇴 골 주위 작은, 곡선 견인을 배치 하 여 주변 연부 조직, 근육, 및 혈관 다발을 보호 하기 위해 ostectomy (결함 생성)에 대 한 준비. ~ 5 mm 화살 진동 활용 보았다 블레이드, 매우 신중 하 게 중간 diaphysis 통해 5mm 단편 결함을 만들. 빛, 불필요 한 골절 (그림 2E)을 피하기 위해 톱으로도 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>뼈의 열 괴 사를 방지 하는 결함을 만드는 동안 필요한으로 관개 (실내 온도 0.9% 메 마른 정상적인 염 분 (NS))의 작은 금액을 적용 합니다.</li>
	<li>결함을 만든 후 10ml의 NS 사용 하 여 상처를 플러시.</li>
	<li>진통제와 vasoconstrictor 상처에 피 네 프 린 (1: 200, 000)와 0.25 %bupivacaine 0.1 mL를 관리 합니다.</li>
	<li>삽입의 콜라겐 스폰지 또는 rhBMP-2 (3 mm x 3 mm x 5) 비 계 ( 2 단계)에서 결함으로 스폰지 젖 었. 각 비 계 스팬 길이 위치에 유지 하는 스폰지를 돕는 결함의 볼륨을 적절 하 게 크기 한다. 참고:이 시점에서, mRNA 단지 수 될 준비 하 고 수행 하는 생물 발광 영상 경우 7.1-7.3 아래 단계에 설명 된 대로 주입.</li>
	<li>4-0 흡수 봉합과 간단한 중단 된 패턴을 사용 하 여 근육 비행기를 닫습니다. 4-0 흡수 봉합 사로 실행 중인 subcuticular 패턴을 사용 하 여 피부 레이어 닫고 피부 접착제를 튀어나온 핀 주위 간격을 닫습니다.</li>
	<li>난방 패드에 남아 있는 코 콘에서 쥐를 제거 하 고 쥐 지속적으로 직 립 자세를 유지할 수 있게 될 때까지 지속적으로 모니터링 합니다. 이 시점에서 복구 하려면 깨끗 한 장에 배치 합니다.</li>
</ol>7. 준비 complexed mRNA 및 생물 발광 영상
참고: mRNA 단지와 Transfection 수술 발광 영상 전에 1 일 동안 수행 되어야 합니다. 무 균 기법을 사용 하 여 mRNA를 처리할 때.
<ol><li>혼합 10 µ L mRNA lipidic transfecting 에이전트의 30 µ L 함께 Gaussia luciferase (1 µ g / µ L의 재고 농도)에 대 한 인코딩.</li>
	<li>실 온에서 적어도 5 분 동안 배양 하 여 mRNA 지질 단지 형태를 허용 합니다. 그들을 안정 시키고 transfection 효율 향상 lipidic transfecting 에이전트 mRNA 분자를 응축 됩니다. 참고: 복합물을 즉시 사용 하지 않는 그들에 저장할 최대 1 시간에 대 한 얼음.</li>
	<li>각각의 결함, 원심 및 인접 끝에 mRNA 단지의 볼륨의 절반을 주사 필터링된 팁을 갖춘 20 µ L 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>다음 날, 이미징, 전에 3 분 흡입된 isoflurane 이전 단계 4.1에 설명 된 대로 사용 하 여 쥐를 anesthetize.</li>
	<li>Vivo에서 이미징 챔버 장착 유지 보수 isoflurane (0.8 %isoflurane, 2-3 L/min의 O2 배달 속도)를 제공 하는 코 콘 쥐를 놓습니다.</li>
	<li>결함의 근접에 4 mg/kg 몸 무게의 복용량에 염 분에서 resuspended coelenterazine 주사.</li>
	<li>Vivo에서 이미징 시스템 (IVIS) 제조 업체의 지침18에 따라 생물 발광 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>8. 이미징 프로토콜
<ol><li>일반 방사선 기계는 x 선 시스템19, 보정 후 anesthetize 흡입된 isoflurane를 사용 하 여 앞에서 설명한 ( 단계 4.1참조)으로 쥐 및 쥐 흡입된 isoflurane (0.8 %isoflurane, O2 와 코 콘에 2-3 L/min의 배달 속도) anteroposterior (AP) 대 퇴 골 방사선 사진에 대 한.<ol>
<li>Sternal recumbency에 쥐를 실행 하는 동안 수술 hindlimb 앞으로 엉덩이에 flexing 사전 및 공동 억압. 약 90 °를 억압 조인트 플렉스. 체 벽에 가까운, 발 발바닥 쪽을 테이프. 뼈도 랑의 가능성을 제거 하기 위해 대 퇴 골에서 경골 앞으로 배치 합니다. 엉덩이의 약간의 납치를 제공, 사 타 구니 지역에서 반투명 스폰지 (약 15 m m 두께)을 배치 합니다. 그런 다음 대 퇴 골의 앞쪽 후부 (두개골 꼬리) 이미지를 얻을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>바로 수술, 4 주, 12 주 뒤이 AP 대 퇴 골 방사선 보기를 반복 합니다. 거 즈와 테이프를 사용 하 여 적절 하 게 품질과 일관 된 이미징에 대 한 동물의 말단 위치.</li>
	<li>코 콘에서 쥐를 제거 하 고 쥐 지속적으로 직 립 자세를 유지할 수 있게 될 때까지 지속적으로 모니터링 합니다. 다음으로 다시 장소입니다.</li>
</ol>9. 조직학 절차
<ol><li>AVMA 윤리 기준16에 따라 흡입 공동2 챔버에 쥐 안락사</li>
	<li>다음 안락사는 hindlimb를 면도, 요원 말단에서 피부를 제거 하 고 disarticulate 엉덩이에 대 퇴 골. 조심 스럽게 수술 대 퇴 골 (를 포함 하 여 모든 근육, 힘 줄, 인 대)에서 모든 연 조직 제거. 만 해 부 동안 실수로 손상에서 치유 영역을 보호 하기 위해 결함 사이트를 둘러싼 근육의 얇은 레이어를 남겨 주세요.</li>
	<li>10%는 대 퇴 골 에서도 중립 버퍼링 말린 3-4 일 동안 실내 온도에 고정을 위한 수 있도록. 조직 볼륨 비율 15:1 포 르 말린을 유지. 일단 정착 과정을 통해 중간 솔루션을 변경 합니다.</li>
	<li>3-4 주 동안 15 %Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 6.5 솔루션에서 대 퇴 골을 알려줍니다. Decalcification 끝점을 확인 하기 위해 직렬 검사를 수집 합니다.</li>
	<li>중반-화살 평면에서 후부 앞쪽에서 커트로 경도 대 퇴 골 이등분 조직 표준 파라핀 포함 되며 고 오신 (H & E) 얼룩에 대 한 제출.</li>
	<li>조직학 평가 대 한 병리학 자 H & E 슬라이드 보내기.</li>
</ol>

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완전 한 뼈 골절 등 정형 외과 상해의 작은 동물 모델 바이오20의 치료 가능성을 평가 하 고 골의 메커니즘을 탐구 하는 연구를 사용 합니다. 이 연구에서는 쥐 단편 결함 모델 연구소와 생명 공학 팀 로드 베어링 osteosynthetic 뼈 수리의 추가 연구에 대 한 쉽게 재현할 수 있는 사용자 지정 외부 fixator에 의해 안정.
일반적으로 쥐 모델에서 중요 한 크기의 결함을 사용 하 여 이전 연구는 내부 고정 플레이트21,,2223,24에 의존 합니다. 외부 고정 적은 연 조직 장애 및 혈액 손실, 세균성 식민을 위한 기회를 최소화 하기 위해 총 이식된 면적 감소를 일으키는 원인이 되기의 뚜렷한 장점이 ...

정형 외과 외상 수술은 다양 한 복잡 한 골절 치료에 중점을 둡니다. 결함의 실패 뿐만 아니라 주변 근육과 감소 재생 능력 때문에 임상 치료 하기 어려운 입증 했다 중요 한 diaphyseal 단편 뼈 지역화 신생1. 현대 치료 기법으로 뼈 접목 수술 고정, 지연 (Masquelet) 뼈 접목, 뼈 전송, 융합, 또는 절단2,,34. 잘 작동 원심 사지와 그들의 외상 후 보존 하는 보 행 기능 대부분의 환자에서 다리 구조는 명확 하 게 더 나은 치료 옵션5입니다. 이러한 구조 치료는 종종 긴 치료 과정을 통해 단계적된 수술 개입을 필요합니다. 몇몇 저자는 외부 고정은의 증가 수술 후 조정와 내부 고정 감소 조직 손상으로 인해 이러한 응용 프로그램에 대 한 감소 하는 이식 시 이식 표면적, 우수한 제안 fixator6. 그러나, 장래 무작위로 고른된 통제 되는 예는 현재 진행이 논쟁의 경골7의 심각한 오픈 골절 외부 고정 대 내부를 명확히입니다. 불행히도, 어느 치료 선택, 중요 한 합병증 및 실패 속도 유지8,9. 단편 뼈 손실에 관하여 치료 방법 중 하나는 외과 의사 해야 합니다 중요 한 과제가 단편 diaphyseal 결함으로 다 투 다. 단편 결함의 수정 뼈 안정화를 극대화 하 고 동시에 osteogenic 과정10,11을 강화 해야 합니다.
임상 중요성, 아직 중요 한 크기 diaphyseal 단편 결함의 낮은 볼륨으로 인해 효과적, 재현할 수 동물 모델은 사전 처리 기술 및 궁극적으로 임상 결과 개선 연구 팀을 활성화 하는 데 필요한. 연구원은 생체 내에서 생리 치료 메커니즘 포유류 동물 모델에서 공부 해야 합니다. 외부 고정 이미의 같은 모델12,13,,1415존재, 비-조합 치료 동물의 선택을 통해 감소 비용에 대 한 더 신뢰할 수 있는 방법을 제공 하겠습니다. 저렴 한 fixator 자료, 그리고 미래의 연구를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 간단한 수술 프로토콜 개요. 이 프로토콜의 주요 목표 쥐에서 중요 한 diaphyseal 결함의 안정적이 고 재현 가능한 모델을 확립 하는 것입니다. 절차는 안정화 및 뼈 쥐 화관에서 12 주 이상 치료를 평가 하 여 평가 되었습니다. 포함 하는 보조 목표: 윤리적인 동물 들 외과 접근 및 안정화, 단순화 하 고, 효과적인 비용으로 저렴 한 모델을 만들기. 저자와 연구 팀 다른 생체 재료 및이 단편 결함에서 치유 개선에 잠재적인 재생 치료의 범위와 예비 실험을 실시.

<table><tbody><tr><td>0.9% 멸균 식염수</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>상처 및 재수화 세척에 사용</td></tr><tr><td>10% 요오드/포비돈</td><td>케어퓨전</td><td>1215016</td><td>피부 준비에 사용</td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>VWR</td><td>89370094</td><td>고정제로 사용</td></tr><tr><td>1mm 나사산이 없는 kirschner 와이어</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1003.15</td><td>멸균, 가장 근접한 핀</td></tr><tr><td>에 사용1mm 스레드 kirschner 와이어</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1005.15</td><td>멸균, 3 개의 가장 말단 핀 슬롯에 사용</td></tr><tr><td>2x2 거즈</td><td>Covidien</td><td>4006130</td><td>멸균, 피부를 준비하고 혈액을 흡수하는 데 사용</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl Suture</td><td>Ethicon</td><td>4015304</td><td>근육과 피부 층을 닫는 데 사용</td></tr><tr><td>4-40 x 0.25 ", 18-8 스테인레스 스틸 버튼 헤드 캡 나사</td><td>일반</td><td></td><td>외부 고정 장치 조립</td></tr><tr><td>4200 무선 드라이버</td><td>스트라이커</td><td>OR-S-4200</td><td>kirschner 와이어 드릴링에 사용</td></tr><tr><td>4x4 거즈</td><td>Covidien</td><td>1219158</td><td>멸균, 혈액 흡수에 사용</td></tr><tr><td>70 % 에탄올</td><td></td><td></td><td>피부 준비에 사용</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer Healthcare LLC, 동물 보건 부서</td><td>312.10010.3</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Hikma로 물에 첨가 의약품</td><td>8917156</td><td>수술 전 항생제</td></tr><tr><td>CleanCap 가우시아 루시페라제 mRNA (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7205</td><td>가우시아 루시페라아제에 대한 변형된 mRNA 인코딩, 사용 중 얼음에 보관</td></tr><tr><td>코엘렌테라진 네이티브</td><td>NanoLight Technology</td><td>303</td><td>구시아 루시페라아제용 기판, 생체 내 루시페라제 활성을 평가하는 데 사용</td></tr><tr><td>이중 항생제 연고</td><td>Johnson & Johnson consumer Inc</td><td>8975432</td><td>상처 치료로 수술 후 핀 부위에 적용</td></tr><tr><td>Dual Cut Microblade</td><td>Stryker</td><td>5400-003-410</td><td>대퇴골에 5mm 결함을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td>조직학을 준비하기 위해 뼈를 석회질화하는 데 사용</td></tr><tr><td>Extended Release Buprenorphine</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>3일 통증 완화로 사용</td></tr><tr><td>Fenestrated 드레이프</td><td>3M</td><td>1204025</td><td>TPS</td></tr><tr><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-4N</td><td>용 멸균 필드 핸드피스 코드를</td> 설정하는 데 <td>사용 대퇴골</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>K&에 5mm 결함을 만드는 데 사용됩니다. H Pet Products</td><td>121239</td><td>쥐 체온 유지</td></tr><tr><td>육각 헤드 스크루 드라이버</td><td>Wiha</td><td>263/1/16 "X 50</td><td>외부 고정 장치 조임</td></tr><tr><td>유도 챔버</td><td>쥐 용 일반</td><td></td><td>마취</td></tr><tr><td>콜라겐 스폰지에 재조합 인간 뼈 형태 생성 단백질 -2</td><td>주입 Medtronic</td><td>7510200</td><td>양성 대조군으로 사용되는 임상 관련 치료</td></tr><tr><td>쥐를 위한</td> <td>Isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td> 마취</tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Bioluminescence 이미징 양식</td></tr><tr><td>Jig</td><td>Custom</td><td></td><td>바이코르티칼 핀을 배치하는 데 사용</td></tr><tr><td>Lipofectamine MessengerMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>LMRNA003</td><td>mRNA 전달을 가능하게 하는 mRNA 복합화 에이전트</td></tr><tr><td>Sensorcaine-MPF(Bupivicane (0.25%) 및 Epinephrine) (1:200,000))</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>NDC 63323-468-37</td><td>통증 완화 및 혈관 수축을 위해 수술 부위에 적용</td></tr><tr><td>멸균수</td><td>Hospira</td><td>8904653</td><td>세파졸린 분말의 용매로 사용</td></tr><tr><td>티타늄 외부 고정 플레이트</td><td>스크랩 티타늄 및 밀링 머신으로 집에서 맞춤</td><td></td><td></td> 준비</tr><tr><td>TPS(Total Performance System) 콘솔</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-1</td><td>대퇴골에 5mm 결함을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>TPS MicroSaggital Saw</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-34</td><td>대퇴골에 5mm 결함을 만드는 데 사용</td></tr><tr>DXA <td>Faxitron</td> 고해상도 방사선 촬영 방식을<td>사용한 Ultrafocus Faxitron</td><td></td><td>고해상도 방사선 촬영 방식</td></tr><tr><td>Uniprim 쥐 다이어트</td><td>Envigo</td><td>TD.06596</td> TPS Stryker OR-S-5100-9용 <td>약용 쥐 다이어트</td></tr><tr><td>범용 핸드스위치</td><td></td><td></td><td>5mm를 만드는 데 사용 대퇴골 결함</td></tr><tr><td>Vetbond 조직 접착제</td><td>3M</td><td>1469</td><td>피부 폐쇄</td></tr></tbody></table>

사용자 지정 외부 fixator를 안정화 하는 쥐에서 안정적이 고 재현 가능한 크기의 중요 한 단편 대 퇴 결함 모델

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

정형 외과 연구 vivo에서 치유 하는 뼈의 메커니즘을 연구 하 고 새로운 치료 기술을 조사 동물 모델에 크게 의존 합니다. 임계 크기 단편 결함 임상, 치료를 도전 그리고 연구 노력 단편 대 퇴 결함의 안정적이 고 외래 작은 동물 모델에서 혜택을 받을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 외부 fixator를 안정화 하는 쥐 대 퇴 골에 5mm 중요 한 diaphyseal 결함의 일관 되 고 재현 가능한 창조에 대 한 최적화 된 수술 프로토콜을 제시. Diaphyseal ostectomy 4 Kirschner 전선을 bicortically를 사용자 정의 지 그를 사용 하 여 어떤 적응된 외부 fixator 장치와 안정 되었다 수행 되었다. 진동 뼈 톱 결함을 만드는 데 사용 되었다. 혼자 콜라겐 스폰지 또는 rhBMP-2에 배어 콜라겐 스폰지는 결함으로 이식 했다 하 고 치유 하는 뼈 검사를 사용 하 여 12 주 동안 모니터링 했습니다. 12 주 후 쥐 희생 했다, 그리고 조직학 분석 삭제 제어에 수행한 화관을 취급. RhBMP-2 치료 개장 periosteal 비정 하 고 새로운 뼈의 형성을 굴복 하는 동안 뼈 결함만 콜라겐 스폰지 포함 된 비-연합, 결과. 동물 이식, 후 잘 복구 하 고 외부 고정 안정화 대 퇴 결함 12 주 이상에서 성공 입증. 이 합리적인된 수술 모델 뼈 치유를 연구 하 고 새로운 정형 외과 바이오 소재 및 재생 치료 비보테스트를 쉽게 적용할 수 있습니다.

수술 한 조 수의 도움으로 한 외과 의사에 의해 약 1 시간에 수행 되었습니다. 수술 최적화 후 내부-수술 후 합병증 크게 최소화 했다 고 일관성 있는 크기 (5 x 3 x 3 m m) 및 대 퇴 결함의 지역화 보장 지 그 장치를 사용. 쥐 마 취에서 외래 즉시 다음 복구 되었고 어떤 변경 된 행동 패턴;는 나타나지 않았다 그들의 걸음 걸이, antalgic 되었고 그들은 외부 fixator에 의해 방해 하 고 나타나지 않았다.
비-스레드 k-전선 근 위 핀 때 스레드 와이어 사용 되었다 끊기의 위험을 했다 (그림 2B), 가장 근 위 핀에 대 한 선정 됐다. 어떤 경우에, 특히 컨트롤에서에서 rhBMP-2 또는 누구의 결함 보였다 치유/뼈 형성의 증거가 하나 이상의 k-와이어 팁 스펀지에서 본 약 8 주 후 ...

Vivo에서 포유류 모델의 중요 한 크기의 뼈 결함 치유 메커니즘 및 정형 외과 치료를 공부 하는 연구원을 위한 필수적입니다. 여기, 우리는 외부 고정을 사용 하 여 안정화 하는 쥐에 재현, 단편, 대 퇴 결함의 생성에 대 한 프로토콜을 소개 합니다.

사용자 지정 외부 Fixator를 안정화 하는 쥐에서 안정적이 고 재현 가능한 크기의 중요 한 단편 대 퇴 결함 모델

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. ...

이 수술 프로토콜은 뼈의 치유 메커니즘과 잠재적 인 재생 치료의 사용을 평가하기 위해 일관되고 재현 가능한 외부 고정 세그먼트 결함 모델을 사용합니다. 우리는 세로 치유 연구에 적합한 유지하면서 접근 가능하고 비용 효율적인 세그먼트 뼈 결함 모델의 생성 및 안정화를위한 도전적인 수술을 간소화했습니다. 이 기술은 모델이 추가 연구를 필요로하지만, 외부 고정안정화에서 혜택을 누릴 수있는 외상성 중요한 크기의 diaphysial 뼈 결함의 치료에 특히 번역할 수 있습니다.핀을 드릴링하는 동안 골절을 방지하려면 분당 높은 회전과 낮은 압력을 사용하여 측면 피질을 뚫은 다음 분당 회전을 줄여 진행합니다. 제조 자의 지시에 따라 뼈 형태 유전학 단백질 튜브 뼈 이식 키트에서 스캐폴드를 준비 한 후, 멸균 가위와 멸균 눈금자를 사용하여 콜라겐 스폰지를 5~ 3 mm 결점으로 조정합니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 골격 형태유전학 단백질-2 용액을 스폰지 표면 전체에 고르게 분배하고, 용액의 전체 부피가 흡수될 때까지 분배한다.다음으로, 13번째 리브, 뒷발, 등및 복부 미드라인을 사용하여 마취된 쥐의 뒷다리 주변을 여백으로 면도한 다음, 노출된 피부의 4개의 순차번질 스크럽을 10%의 포비도요오드와 70%에탄올에 담근 멸균 거즈로 닦아넣습니다. 대퇴골 결함을 유도하기 위해, 회향된 투명 끈적한 커튼을 통해 면도된 다리를 확장하고, 멸균 수건으로 수술용 벤치를 덮어 멸균 장을 만듭니다. 대퇴골을 찌르고 숫자 15 블레이드를 사용하여 슬개골에서 근해 대퇴골의 더 큰 트로챈터까지 이어지는 피부를 통해 전방 절개를 만듭니다.근육 간 중격을 따라 측면 다리 근막을 조심스럽게 절개하여 측면 대퇴골이 노출될 때까지 사두근의 광대한 측면 근육을 햄스트링과 앞쪽으로 분리합니다. 뼈 표면의 윤곽에 평행한 숫자 15 메스 블레이드를 유지, 부드럽게 신중을 수행하기 위해 기본 뼈에서 근육을 잘라, 외상성 외측 연조직 해부를 수행하고, 측면 표면에 시작, 중간 diaphysis에서 대퇴골을 노출. periosteal 엘리베이터를 사용하여 노출된 뼈에서 근육을 들어 올리고 중앙 당뇨병의 7~10밀리터가 모든 면에서 연조직을 지워질 때까지 대퇴샤프트 주위를 진행합니다.다음으로, 측면 에픽톤딜 의 수준에 핀 1개를 놓고, 측면 탈모대에게 지그 플러시를 배치하고, 1밀리미터 나사 팁 Kirschner 와이어 를 삽입합니다. 다음으로, 뼈에 지그의 위치를 유지, 가장 근접 핀이 지그 구멍에 따라 뼈를 입력 하는 위치를 식별 합니다. 근위 핀이 통과하는 조직에 작은 간격을 생성하여 힘줄에 대한 이단성 손상을 최소화하기 위해 필요에 따라 둔부 힘줄의 섬유와 평행을 신중하게 절개합니다.1밀리미터 비나사드 k-와이어를 틈새에 드릴링하고 드릴핀의 높이를 느슨한 핀과 비교하여 핀이 두 코르티스를 모두 관여하는지 확인합니다. 뼈와 접촉하는 지그의 위치를 유지하고 두 개의 1mm 나사 k-와이어를 드릴, 미래의 결함 부위의 양쪽에 하나, 핀이 두 코르티스를 모두 참여 보장하고, 외부 고정 기 바 수준을 피부 위에 1 센티미터 배치. 단단히 나사, 장소에 막대를 잠그고, 초과 핀 길이를 잘라.전방 및 후방 대퇴골 주위에 작은 곡선 리트랙터를 배치하여 주변 연조직, 근육 및 신경 혈관 번들을 보호하고 약 5mm 척진동 톱날과 빛, 심지어 압력을 사용하여 중간 투아질증을 통해 5밀리미터 세그먼트 결함을 매우 신중하게 생성합니다. 결함을 생성 한 후 0.9 %의 정상 식염수의 10 밀리리터로 상처를 플러시하고, 진통 및 혈관 수축기로 상처에 에피네프린과 0.25 %의 0.1 밀리리터를 투여합니다. 뼈 형태 유전학 단백질-2 젖은 스폰지 스캐폴드를 결함에 삽입하고 간단한 중단 패턴에 4-0 흡수성 봉합사를 사용하여 근육 평면을 닫습니다.그런 다음 달리는 피하 패턴에서 4-0 흡수 성 봉합사를 사용하여 피부 층을 닫은 다음 피부 접착제를 사용하여 돌출 핀 주위의 틈새를 닫고 대퇴골의 전방 후방 방사선 이미지를 즉시 얻고 수술 후 4 주 및 12 주를 얻습니다. 콜라겐 스폰지만 함유한 부정적인 제어 결함은 근해와 황실 뼈 가장자리 사이에 골발생을 연결하는 증거를 보여주지 않습니다. 소량의 새로운 뼈 리모델링은 절단 대퇴골 가장자리에 직접 인접하여 볼 수 있으며 결함 자체는 뼈 성 물질의 부족, 연골의 존재 및 일부 잔류 혈종의 존재를 보여줍니다.뼈 형태 유전학 단백질-2 젖은 스폰지를 포함 하는 결함 은 수술 후 4 주 일찍 중요 한 뼈 치유를 보여줍니다., 결함을 통해 방사성 냉담 브리징에 의해 입증. 12 주까지, 중요한 새로운 광물 증착은 결함 전반에 걸쳐 형성되었습니다. 중요한 새로운 periosteal 뼈는 절단 대퇴골 가장자리에서 연장 냉담에서 관찰 될 수 있으며 짠 및 라멜라 뼈의 스파이컬은 결함 전반에 걸쳐 개발되었습니다.또한 연골 증착은 보이지 않습니다. 외부 고정기의 제거 후에 생체 내 이미징 시스템을 통해 화상 진찰은 결함 내의 생물 발광 전도 세포의 시각화를 허용합니다. 예를 들어, 수질 공동의 세포는 가우시아 루시포라아를 위한 복잡한 mRNA 인코딩을 통한 트랜스펙트 후 발광하고, 치유 과정에서 관심 있는 유전자 또는 단백질의 발현에 있는 생물학적 변화를 측정하는 데 사용될 수 있었다.핀 배치는 안정적이고 지속적인 외부 고정을 보장하는 데 중요합니다. 핀은 파손과 감염을 최소화하기 위해 대퇴골에 직접 수직이고 서로 평행해야 합니다. 이 모델을 이용하여, 특정 단백질 발현과 같은 생물학적 메커니즘은 치유를 더 잘 이해하기 위해 모니터링될 수 있으며, 상이한 스캐폴드 생체 재료 또는 치료법은 또한 치료 효능을 시험할 수 있다.우리는 이 기술이 미래 연구원이 그들의 사실 인정이 향상된 임상 성공으로 번역될 수 있도록 외부 고정으로 정형 외과 치유를 보다 효율적이고 효과적으로 연구할 수 있기를 바랍니다. 마취 가스를 흡입하지 말고, 포르말린과 EDTA를 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 수술 기구, 특히 드릴 및 진동 뼈 톱을 다룰 때 주의하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

뼈 복구 분야에서 전임상 연구의 제약 조건 중 하나는 치유 뼈 병변 내의 국소 기계적 환경에 대한 실험적 통제가 부족하다는 것입니다. 우리는 생체 내에서 고정기 강성을 변화시킬 수 있는 능력을 가진 뼈 복구를 위한 외부 고정기의 설계 및 사용을 보고합니다.

조정 강성, 쥐 대퇴골 절골술 부위 별 뼈 결함 모델에 대한 외고정

동물 모델은 생물 의학 연구에서 심각한 뼈 손상을 모방하기 위해 자주 사용됩니다. 크기가 작기 때문에 생쥐에서 안정화된 뼈 병변을 확립하는 것은 대부분의 연구 그룹의 능력을 넘어섭니다. 여기에서는 마우스의 실험적 대퇴골 결함을 확인하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다.

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

마우스 모델은 뼈 조직 공학에 매우 유용한 도구이지만, 긴 뼈 결함 모델은 드뭅니다. 이러한 필요성은 4개의 나사가 있는 잠금 플레이트와 전용 지그를 사용하여 이환율이 낮고 재현 가능한 대퇴골 임계 크기 결함을 수행하고 안정화하는 현재 프로토콜의 개발에 동기를 부여했습니다.

마우스의 분절 대퇴 임계 크기 결함 모델의 설립은 플레이트 고정술에 의해 안정화

이 연구는 재현 하 고 상세한 프로토콜 사용 하 여 새로 개발된 된 외부 fixator 산만 골에 대 한 (할) 대 퇴 쥐에 모델 외부 fixator의 제거 후에 동물에 의해 체중 베어링 생리는 허가 설명 합니다.

주의 골 기능 재생성 된 대 퇴 골으로 이어지는 쥐 모델에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜

여기에서는 쥐의 대퇴골 이형성증 조직에서 box-cavity 결손을 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 모델은 생체역학적 스트레스 하에서 생체재료 성능을 평가하고 막내 골형성과 관련된 뼈 재생 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

Rat Fetora의 피질 뼈에서 Box-Cavity Defect 모델 생성

이 연구는 내고정 또는 외부 고정 없이 하중 지지 조건에서 뼈 대체 재료의 기계적 및 골형성적 성능을 평가하기 위해 쥐 대퇴골 반분절 결손 모델을 구축하였습니다.

하중 지지 부위에서 뼈 대체 성능 평가를 위한 쥐의 반분절 골단골 결손 모델

이 연구는 쥐 요골골절 모델에서 안정적인 내부 고정을 위해 봉합사와 티타늄 바늘을 혁신적으로 결합하였습니다. 골절 치유는 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 통해 평가되었고, 추가 연구를 위해 일차 등근 신경절(DRG) 신경세포를 분리하여 배양하였다.

쥐 요골골절에 대한 새로운 내부 고정 모델 개발: 골절 치유 평가 및 등근 신경절 분리

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

홈마이크로유체 채널을 통과하는 2개의 인접한 유체는 사전 중합체 코어 주위의 칼집을 형성하도록 지시될 수 있다; 따라서 모양과 단면을 모두 결정합니다. 티올 클릭 화학과 같은 광숙련 중합화는 코어 유체를 소정의 크기와 모양으로 미세화로 빠르게 고화시키는 데 적합합니다.

미리 설계된 크기와 모양의 중합체 및 바이오 하이브리드 섬유의 미세 유체 제조

혈관은 성공적인 조직 공학의 접근 방법의 핵심입니다. 따라서, 신뢰성있는 기술은 조직 구조에서의 혈관 망의 발달을 평가하기 위해 필요하다. 여기서 우리는 시각화 및 생체 내에서 혈관 생성을 정량화하기 위해 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시한다.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

배우세요 쥐에서 외부 고정기를 이용한 대퇴골 결함 모델 수술법을 통해 뼈 치유 메커니즘과 재생 치료법을 평가하는 방법을. 이 기법은 정형외과 연구에 효과적인 도구를 제공합니다.

사용자 지정 외부 Fixator를 안정화 하는 쥐에서 안정적이 고 재현 가능한 크기의 중요 한 단편 대 퇴 결함 모델

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