Name: 매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 학습하세요 중간처리량 분석법을 통해 인간 정자의 칼슘 신호 및 아크로솜 반응을 평가하는 방법을. 형광 염색과 이미지 세포측정을 활용하여 화합물 효과를 신속하게 선별하고 생식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자 그의 실험실에서 그들의 체류 동안 아칸소 DLE의 감독을 위한 티 Strünker의 실험실을 인정 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 부의 성장 및 재생산, 코펜하겐 대학 병원, Rigshospitalet 그들의 도움으로이 두 분석 실험 설정에 대 한 우리의 동료를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 혁신 기금 덴마크 (부여 번호 005-2010-3-14-2013-4)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

저자는 공개 없다.

중간 처리량 캘리포니아2 + 신호 분석 결과 단일 microwells에서 형광의 측정에 따라 약 250000 정자 세포를 포함 하는. 캡처된 신호는 잘에서 모든 개별 정자 세포에서 평균입니다. 분석 결과 [캘리포니아2 +]i 에 변화 소요, 또는 어떻게 다른 유형의 응답은 정자 세포의 크기 비율에는 정자 세포 [캘리포니아2 +]내가 구체적으로 어디에 대 한 공간 정보가 없는 변경 제공 개별 셀 사이. 정보를 얻기 위해 같은, 단일 셀 해상도 실험 (예를 들어,50,52에서 설명)으로 사용 해야 합니다 수 있습니다. 기술은의 또 다른 단점은 초 순서는 시간적 해상도입니다. 25 때 50 µ L 정자 샘플은 잘 혼합 측정 후 다 잘 플레이트 서랍 형광 플레이트 리더 안에 다시 시작 될 수 있다 먼저 솔루션의 µ L 추가 됩니다. 더...

여기에 설명 된 두 개의 분석 실험의 목적은 캘리포니아2 +에서 효과 검사-신호 및 acrosome 반응 인간의 정자에 대 한 표시 된 것 처럼 이러한 채용 여러 출판물에 여러 화합물 분석 실험1,2, 3,,45,,67. 캘리포니아2 +-신호 및 acrosome 반응은 모두 정상으로 중요 한 인간의 정자 세포 기능 및 남성 불 임.
인간의 정자 세포의 전반적인 목표는 계란을 기름 지 게. 수 성공적으로 하 고 자연스럽 게 계란을 기름 지 게, 정자 세포의 기능 여성 재생산 지역8,9정자 세포의 여행 동안 긴밀 하 게 규제 되어야 합니다. 대부분의 정자 세포 함수는 세포내 캘리포니아2 +를 통해 통제 된다-농도 [캘리포니아2 +]나 (예를 들어, 정자 운동 성, chemotaxis, 및 acrosome 반응)10. 또한, 정자 세포의 계란을 비 옥 수 있는 렌더링, capacitation 라는 성숙 과정 [캘리포니아2 +]에 의해 부분적으로 규제나10이다. 캘리포니아2 +-압출 캘리포니아2 +-ATPase 펌프11 유지는 대략 20.000 배 캘리포니아2 +-는 휴식 [캘리포니아2 +]나 50-100 nM의와 인간의 정자 세포 막에 그라데이션. 만약 캘리포니아2 + 수 교차 하는 세포 막 (예를 들어, 캘리포니아2 +의 오프닝을 통해-채널), 캘리포니아2 + 의 상당한 유입을 발생을 야 기한 [캘리포니아2 +]나의 상승. 그러나, 정자 세포 또한 운반 세포내 캘리포니아2 +-캘리포니아2 + 풀어 놓을 수 있는 상점, 및, 따라서, 또한 줄 [캘리포니아2 +]나12의 상승 상승. 흥미롭게도, 모든 채널 중재 캘리포니아2 +-인간의 정자 세포에 유입은 지금까지 발견 되었습니다 CatSper ( Sperm의고양이이온 채널), 정자 세포11표현만 통해 발생. 인간의 정자 세포에서 CatSper에 의해 활성화 되는 내 인 성 ligands 황 체 호르몬 및 다른 ligand 바인딩 사이트13,,1415, 통해 prostaglandins 선도 하는 급속 한 캘리포니아2 +-로 유입 정자 세포입니다. 두 가지 주요 소스 계란 근처이 내 인 성 ligands의 높은 수준을 제공합니다. 소 낭 모양 액체 progesterone16의 높은 수준을 포함 하는 하나입니다. 소 낭 모양 액체가 배 란 및 oviducts17내 액체와 함께 혼합에 달걀 함께 성숙 난 포에서 나온다. 다른 주요 소스 계란을 포위 하 고 황 체 호르몬과 prostaglandins의 높은 수준을 출시 적 운 세포 이다. 황 체 호르몬 유도 캘리포니아2 +-정자 세포에 유입 계란9,18향해 chemotaxis 중재, 정자 운동 성19,20 제어는 acrosome 자극을 보였다 반응21. 이러한 개별 [캘리포니아2 +]나의-규제 정자 기능 올바른 순서로, 올바른 시점에 달걀8의 수정에 대 한 중요 하다. 이 차선 황 체 호르몬 유도 된 Ca2 +라인-유입 발견 되었습니다 관련 된 남성 불 임22,23,,2425,26 감소 ,27,,2829 및 기능 CatSper 남성 불 임26,30,,3132를 위해 근본적 이다 33,,3435,36.
정자 세포에 도달 계란, 이벤트의 시퀀스 일어나 야 한다 발생을 수정에 대 한: 1)는 정자 세포 해야 합니다 주변 적 운 세포 층에 침투, 2)에 zona pellucida, 3) exocytose acrosomal 콘텐츠, 소위 acrosome 반응 37, 4) 침투 zona pellucida, 및 5) 수정38완료 계란 막으로 융합. 이러한 단계를 통해가 서 계란을 기름 지 게 하 수, 정자 세포 먼저 받아야 capacitation11, 정자 세포 "decapacitating" 요인39 를 포함 하는 정액 액체 두고 여성의 체액에 수영으로 시작 중 탄산염과 알 부 민37의 높은 수준의 생식 요로. Capacitation 렌더링 정자 세포 hyperactivation, 운동 편, 그리고 acrosome 반응37의 활발 한 매 질으로의 형태를 받을 수 있게 합니다. Hyperactivated 운동 zona pellucida40의 침투에 대 한 필수 이며는 acrosome 포함41이 침투 과정 원조 하는 각종 가수분해 효소. 또한, acrosome 반응 렌더링 정자 세포 정자 계란 퓨전42에 필요한 정자 표면에 특정 막 단백질을 노출 하 여 계란으로 융합의 수 있습니다. 따라서, hyperactivation 및 acrosome 반응을 받 다 수는 모두42달걀40,성공적인 수정에 필요한. 무슨 마우스 정자 세포43,,4445볼 수 있다, 반대로 acrosome 그대로 인간의 정자 셀 zona pellucida46에 바인딩할 수 있습니다. 인간의 정자 세포 zona pellucida에 바인딩되면 받아야 acrosome 반응 zona pellucida41 침투와 계란38와 융합에 필요한 특정 막 단백질을 노출 해야 합니다. 인간의 정자에서 acrosome 반응의 타이밍은 따라서 수정 발생 하는 것 중요 합니다.
위에서 설명한 대로, 캘리포니아2 +-정상적인 정자 세포 기능8, 그리고 그것은, 따라서, 캘리포니아2 +에서 효과 대 한 화합물의 스크린 다 수 수 큰 관심의 신호 하는 것은 매우 중요-인간의 정자 세포에 신호. 마찬가지로, acrosome 반응에 적절 한 시기와 장소를 받을 인간의 정자 세포 zona pellucida 침투 수 계란46,47을 거 름으로 그것은 또한 테스트를 그들의 능력에 대 한 화합물 수 큰 관심 인간의 정자에서 acrosome 반응을 영향을 줍니다. 이 위해, 2 개의 중간 처리량 심사 분석 설명: 1)에 캘리포니아2 +효과 대 한 분석 결과-인간 정자 세포, 및 2) 인간의 정자 세포에 acrosome 반응을 유도 하는 기능에 대 한 분석 결과에 신호.
분석 결과 1은 중간 처리량 캘리포니아2 +-신호 분석 결과. 이 형광 플레이트 리더 기반 기술은 여러 우물에서 동시에 시간의 기능으로 형광에 변화를 모니터링합니다. 캘리포니아2 +-민감한 형광 염료, Fluo-4는 캘리포니아2 +≈ 335 Kd nM 오전 (acetoxymethyl) 에스테 르 형태로 셀 permeant입니다. Fluo-4를 사용 하 여, 시간이 지남에 그리고 정자 세포에 대 한 관심의 화합물의 추가 후 [캘리포니아2 +]i 에 변화를 측정 가능 하다. 분석 결과 201113 티 Strünker의 연구소에 의해 개발 되었다 이후 사용 되 고 있습니다 화면 화합물을 여러 연구에 대 한 효과에 캘리포니아2 +-인간의 정자1,2,3, 신호 4,5. 또한 유사한 방법 여러 약물 후보48에 사용 되었습니다. 또한,이 분석 결과 또한 행동1,2,3,,45, 복용량 응답 곡선1, 약리학 모드를 평가 하는 데 유용 2,3,,45, 경쟁력 저해1,2, 가산1,2및의 성분3 화합물 관심의.
분석 결과 2 중간 처리량 acrosome 반응 분석 결과가 이다. 이 이미지 cytometer 기반 기술 측정 가능한 양의 acrosome 반응 3 형광 염료를 사용 하 여 샘플에서 정자 세포: propidium 요오드 화물 (PI), Pisum sativum FITC-PSA (), 및 Hoechst 33342 lectin FITC 결합. 분석 결과 Zoppino 외.49 에 의해 유사한 흐름 cytometry 기반 방법에서 수정 하 고 여러 연구6,7에 사용 되었습니다. 캘리포니아2 +에 관해서는-이 acrosome 반응 분석 결과 수 또한 사용 평가 복용량 응답 곡선, 억제, 가산, 그리고 관심의 화합물의 성분 분석 결과, 신호.

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; m 기공 필터</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>296-4545</td><td></td></tr><tr><td>1 L 측정 실린더</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>3662-1000</td><td></td></tr><tr><td>1, 4, 2 mL 플라스틱 튜브</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>30120086 및 0030120094</td><td></td></tr><tr><td>12채널 피펫</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>4861000813</td><td></td></tr><tr><td>384 멀티웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One, 독일</td><td>781096</td><td></td></tr><tr><td>15 및 50 mL platic tube</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>0030122151 및 30122178</td><td></td></tr><tr><td>A2-slide</td><td>ChemoMetec, 덴마크</td><td>942-0001</td><td></td></tr><tr><td>자동 리피터 피펫</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>4987000010</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clean, wide-mouth 정액 샘플</td><td></td><td></td><td></td>용 플라스틱 용기</tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pisum sativum (FITC-PSA)의 FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)</td> <td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>L0770</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar OMEGA 형광 마이크로플레이트 리더</td><td>BMG Labtech, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당 무수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>910-3015</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민 (HSA)</td> <td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr> <tr>증류수에 <td></td><td></td><td></td><td>0.6 M NaHCO3 및 0.37 % (v / v) 포름 알데히드를 함유 한 HTF + Immobilizing 용액</td></tr> 추가 <tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자성 교반기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na-젖산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NC-3000 이미지 세포분석기</td><td>ChemoMetec, 덴마크</td><td>970-3003</td><td></td></tr><tr><td>피펫 및 피펫팅 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 (PI)</td><td>ChemoMetec, 덴마크</td><td>910-3002</td><td></td></tr><tr><td>50</td> mL 플라스틱 튜브를 45도 각도로 배치하기 위한 정제수 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>랙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S100 버퍼</td><td>ChemoMetec, 덴마크</td><td>910-0101</td><td></td></tr><tr><td>SP1-cassette</td><td>ChemoMetec, 덴마크</td><td>941-0006</td><td></td></tr><tr><td>적절한 크기의</td><td></td><td></td><td></td>부피 플라스크</tr><tr><td>Vortexer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 acrosome 반응

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

캘리포니아2 +-신호 하는 것은 정상적인 정자 세포 기능 및 남성 불 임에 필수적 이다. 마찬가지로, acrosome 반응 zona pellucida 관통 하 고 계란을 기름 지 게 하는 인간의 정자 세포의 능력에 대 한 생명 이다. 따라서 화합물 (예: 환경 화학 물질 또는 약물 후보)에 캘리포니아2 +그들의 효과 대 한 테스트를 큰 관심-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 인간의 정자 세포 기능에 잠재적인 악영향을 검사 하거나 또는 피임약으로 가능한 역할 조사 여기, 두 매체 처리량 분석 설명: 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 형광 기반 분석 결과 1)를-인간의 정자에 2) 이미지 cytometric 분석 결과 인간의 정자에서 acrosome 반응의 평가 대 한 신호. 이러한 분석 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 많은 수를 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응. 개별 화합물의 매우 구체적인 복용량 응답 곡선 생성, 두 개 이상의 화합물에 대 한 잠재적인 가산/성분 확인 하 고 경쟁 저해를 통해 행동의 약리 모드를 공부 하는 분석 실험을 사용할 수 있습니다 또한, CatSper 억제제와 실험입니다.

대표는 매체 처리량 캘리포니아2 +를 사용 하 여 인간의 정자에 긍정적인 (progesterone) 및 네거티브 (버퍼) 컨트롤 [캘리포니아2 +]i 4 화합물 (A, B, C 및 D)의 효과 테스트 하는 실험에서 결과-신호 그림 4a에 분석 결과 볼 수 있습니다. 그림 4b, 황 체 호르몬의 복용량 응답 곡선 표시 됩니다, 피크 δ/F0 (%)에서 파생 했다 황 체 호르몬, 순차적으로 희석된 농도 의해 유도 된 데이터는 매체 처리량 캘리포니아2 +를 사용 하 여 다른 실험에서 테스트-신호 분석 결과. 캘리포니아2 +에서 데이터의 분석-분석 결과 대해서는 5 단계에서 설명 하는 신호. 부정적인 통제 (DMSO) 또는 두 긍정적인 컨트롤 (황 체 호르...

여기, 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 두 개의 중간 처리량 분석-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 같습니다. 이 분석 실험은 신속 하 고 쉽게 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 큰 금액을 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응.

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

우리의 assays는 인간 적인 정자 세포 기능에 그들의 효과 대 한 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 이러한 방법은 인간 정자 세포에서 칼슘 신호 및 곡예 반응에 미치는 영향에 대한 많은 화합물을 빠르고 쉽게 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모를 사용하면 다른 사용자가 자신의 실험실에서 유사한 실험을 쉽게 설정할 수 있습니다.먼저 원시 정액 샘플 1밀리리터당 50밀리리터 튜브를 45도 각도로 튜브 랙에 넣고 각 튜브에 섭씨 37도의 인간 투비액 또는 HTF 양성 배지의 4밀리리터를 추가하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 각 튜브의 바닥에 액화 정액 샘플 1 밀리리터를 조심스럽게 피펫하고 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 45도 각도로 유지되는 수정된 파이펫 팁을 사용하여 HTF 양성 배지를 함유하는 운동성 정자 세포의 상부 부분을 새로운 15 밀리리터 플라스틱 튜브로 부드럽게 전달합니다.수집된 정자 세포를 계산하기 위해, 예상 농도에 따라 라운드 하단 2 밀리리터 튜브에서 S100 완충체에서 20 마이크로리터 알리쿼트를 10, 20, 30, 50 또는 90의 계수로 희석한다. 분당 700 회전에서 10 초 동안 희석 된 정자 세포를 소용돌이. 다음으로, SP1 카세트를 샘플에 담그고 흰색 플런저를 완전히 우울하여 샘플의 알리쿼트를 카세트에 흡인시합니다.그런 다음 카세트를 영상 세포계 트레이에 놓고 적용된 희석계에 따라 PI 염색된 인간 정자 세포 분석법을 실행한다. 무료 세포내 칼슘 농도의 변화를 측정하기 위해 정자 샘플을 한 번 위아래로 부드럽게 피펫하고 자동 리피터 파이펫을 사용하여 불소 소로페스테드 정자 세포의 50 마이크로 리터를 384 마이크로 웰 플레이트의 1 열 24 우물로 알리쿼트합니다. 형광판 판독기에 마이크로 웰 플레이트를 섭씨 30도에 놓고 형광소에 적합한 프로토콜을 선택합니다.정자 세포의 행에서 잘 선택하고 20 %의 목표 값으로 게인을 조정한 다음 측정을 시작합니다. 10개의 기준선 주기 후에 실험을 일시 중지하고 마이크로 웰 플레이트로 서랍을 배출합니다. 12 채널 파이펫을 사용하여, 신속하게 12 개의 중복 우물에 화합물 및 관심 제어의 준비 된 솔루션의 25 마이크로 리터를 추가하고 즉시 판독기에게 플레이트를 반환하여 가능한 한 빨리 측정을 계속합니다.화합물 또는 컨트롤의 첨가에 대한 응답으로 형광의 모든 변화는 기기에 의해 포착됩니다. 곡예 반응 분석을 위해, 적절한 형광 염료, 화합물 또는 컨트롤로 커패시티드 정자 세포를 배양 한 후, 파이프팅하여 샘플을 혼합하고 고정 용액의 100 마이크로 리터에 각 테스트 샘플의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 샘플을 다시 혼합하고 챔버 당 샘플의 약 30 마이크로 리터와 샘플 당 하나의 A2 슬라이드의 챔버를로드합니다.그런 다음 첫 번째 로드된 슬라이드를 이미지 사이토미터의 트레이에 놓습니다. FlexiCyte 프로토콜을 선택하고 실행을 누릅니다. 여기서 는 4개의 화합물의 효과를 시험하는 실험에서 대표적인 결과를, 양성 프로게스테론 제어 및 배지 처리량 칼슘 신호 분석서를 이용한 음의 완충제어가 입증된 바와 같이 관찰될 수 있다.본 그래프에서, 프로게스테론의 연속희석 농도에 의해 유도된 세포내 자유 칼슘 농도의 피크 퍼센트 변화로부터 유래된 프로게스테론의 투여반응 곡선이 나타난다. 이 데이터는 중간 처리량 곡자 곡자 반응 분석에서 커패시케이트 된 인간 정자 세포에 있는 곡어 반응의 유도에 1개의 부정적인 또는 2개의 긍정적인 통제의 1개의 효력을 보여줍니다. 유도된 신호의 피크를 놓치지 않으려면 복제 우물에 화학 물질을 신속하게 추가하고 그 후 즉시 측정을 계속하는 것이 중요합니다.형광과 염료의 유형을 변경함으로써, 우리의 연구는 쉽게 다른 과학적 질문에 대답하기 위해 수정 할 수 있습니다. 이러한 assays이미 인간의 정자 기능에 그들의 효과 대 한 화합물의 큰 그룹을 테스트 하는 여러 연구에서 사용 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

여기, 우리는 spermatozoan 막 무결성, 정자의 수정 능력와 관련 된 세포 기능을 평가 하는 방법론을 제시. 우리 정자 세포 막의 fluorimetric 평가 대 한 세 가지 기술에 설명: 특정 형광 프로브, 형광 현미경 검사 법, 그리고 고급 정자 전용 cytometry 동시 얼룩. 방법론을 결합의 예제도 제공 됩니다.

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세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

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