Name: 공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 포르말데하이드 교차결합과 면역침전을 활용한 포유류 세포 주기 동안 PKR RNA 상호작용체를 전장유전체적으로 식별하는 방법을. 이 기술은 RNA 결합 단백질에 의한 유전자 발현의 전사후 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 교육부의 과학 및 ICT (NRF-2016R1C1B2009886)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 및 세포 준비
<ol><li>솔루션 준비<ol>
<li>세포 배양에 대 한 준비 매체 헬러 세포 배양에 대 한 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL를 추가 하 여 500 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의. 참고: 항생제는 세포 배양에 추가 될 수 있지만 우리는 항생제를 사용 하지 않습니다.</li>
		<li>0.1 %paraformaldehyde 대 1에서 4% (w/v) paraformaldehyde 분해 x Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 난방 및 희석 뜨거운 접시에 1 x PBS를 추가 하 여 0.1% (v/v) paraformaldehyde 30 mL를 만들려고. 주의: 증기 두건에서 모든 단계를 수행 하 고 paraformaldehyde 솔루션 비등 하지 않도록 주의 하십시오. 빛에서 0.1%의 솔루션을 보호 하 고 4 ° c.에 저장 솔루션을 사용 하 여 1 개월 이내. 참고: 마지막 0.1% (v/v) paraformaldehyde 해결책의 pH는 약 7 이어야 한다.</li>
		<li>FCLIP 세포의 용 해 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100 0.1% (v/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 및 0.1% (w/v) 나트륨 deoxycholate. 트리플 증류수 (TDW) 40 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 게</li>
		<li>FCLIP 워시 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 m m NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% (v/v) NP-40, 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100, 0.1% (v/v) SDS, 및 0.1% (w/v) 나트륨 deoxycholate. TDW 40 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 게</li>
		<li>PK 버퍼 x 4 준비: 400 mM Tris HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 m m EDTA, 그리고 4% (v/v) SDS. TDW 40 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 상점.</li>
		<li>FCLIP 차입 버퍼 준비: PK 버퍼, 우 레 아의 21 g 및 TDW 8.5 mL x 4의 20 mL. 신선한 준비.</li>
		<li>RNA 차입 버퍼 준비: 0.3 M NaOAc와 2% (w/v) SDS. 실내 온도에 상점.</li>
		<li>RNA 로드 염료 x 2 준비: 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol, 5 mM EDTA, 0.05% (w/v) SDS, 및 95% (v/v) formamide. -20 ° c.에 게</li>
		<li>1 x TBE 버퍼 준비: 0.089 M Tris-붕 산 염 및 0.002 M EDTA. TBE 버퍼의 500 mL를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S 또는 M 단계 체포 셀의 준비<ol>
<li>씨앗 ~ 750000 또는 ~ 1000000 헬러 각각 S 또는 M 단계 체포 샘플에 대 한 세포. 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 세포 성장.</li>
		<li>2mm 티 미 딘 셀 하 고 37 ° c.에 18 h에 대 한 품 어</li>
		<li>두 번 PBS로 세포 세척. 신선한 미디어를 추가 하 고 37 ° c.에 9 h에 대 한 품 어</li>
		<li>S 단계 체포 셀, 셀 2mm 티 미 딘을 취급 합니다. M 단계 체포 셀, 셀 100 ng/mL nocodazole 취급 합니다. 15 h 37 ° C와 수확 셀에서 품 어. 참고: 세포 주기 샘플의 동질성 확인할 수 있습니다 FACS를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 포름알데히드 cross-linking 및 immunoprecipitation
<ol><li>셀 수확<ol>
<li>S 단계 샘플에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 세포 스 크레이 퍼와 전송 셀을 수집 합니다. M 단계 샘플, M 단계 체포 세포를 분리 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송 셀 문화 접시의 측면을 누릅니다. 참고: M 단계 체포 셀의 동질성을 늘리려면 셀 스 크레이 퍼를 사용 하지 마십시오.</li>
		<li>원심 380 x g 3 분 제거에 대 한 실내 온도에서 세포는 상쾌한 고 다시 차가운 PBS와 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송의 1 mL와 함께 일시 중단.</li>
		<li>원심 4 ° C에서 10000 x g 에서 셀 30 미 제거에는 상쾌한 완전히.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포름알데히드 가교<ol>
<li>세포를 해결 하기 위해 실 온에서 10 분 동안 0.1 %paraformaldehyde 750 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>250 μ 1 M 글리신의 추가 하 고 반응을 풀기 위해 상 온에서 추가 10 분을 품 어. 원심 4 ° C에서 10000 x g 에서 셀 30 미 제거에는 상쾌한 완전히.</li>
		<li>다시 1 mL의 PBS로 일시 중단 합니다. 10, 000에서 세포를 원심 30 s 및 제거는 상쾌한 4 ° C에서 g x.</li>
		<li>다시 0.2% (v/v) protease 억제제와 2% (v/v) RNase 억제제 보충 하는 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ와 일시 중단 합니다. 10 분 동안 얼음에 incubate 고 sonicate는 ultrasonicator를 사용 하 여.</li>
		<li>~ 150 m m NaCl 농도 조정 하려면 5 M NaCl의 11 μ를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 및 15 분에 대 한 21,130 x g 4 ° C에서 원심 분리기는 상쾌한 미리 냉장된 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송. 참고: 입력된 샘플으로 상쾌한 새로운 원심 분리기 튜브에서의 40 μ를 유지 합니다. 4 ° c.에 입력된 샘플 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunoprecipitation<ol>
<li>1.5 mL microcentrifuge 관으로 단백질 A 구슬의 20 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>워시 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ와 구슬. 원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ를 신중 하 게 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.</li>
		<li>세 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.</li>
		<li>다시 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 300 μ에 비즈를 일시 중단 합니다. ~ 150 m m NaCl 농도 조정 하려면 5 M NaCl의 8.3 μ를 추가 합니다. PKR 항 체의 10 μ를 추가 하 고 3 h 4 ° c.에 회전에 대 한 품 어</li>
		<li>원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 워시 버퍼의 400 μ를 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.</li>
		<li>두 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다. 참고: 소용돌이 믹서를 사용 하지 마십시오. 손으로 부드럽게 튜브를 반전.</li>
		<li>Lysate의 300 μ를 추가 하 고는 회전에 4 ° C에서 3 시간 품 어. 참고: 더 이상 보육 시간 증가 배경 바인딩을 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 워시 버퍼의 400 μ를 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.</li>
		<li>세 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.</li>
		<li>FCLIP 차입 버퍼의 300 μ를 추가 합니다. 구슬에서 PKR elute를 25 ° C에서 3 h thermomixer에서 품 어. 참고: fCLIP 차입 버퍼 신선한 준비.</li>
		<li>실 온에서 1000 x g 에서 centrifuge 하 고 깨끗 한 시 관에는 상쾌한 전송. 참고: microcentrifuge 관은 또한 좋다, 하지만 시 튜브 드 가교 단계 (단계 2.3.12) 증발을 방지 하기 위해 선호 된다.</li>
		<li>가수분해 K의 300 μ (20 mg/mL)을 추가 하 고 65 ° c.에서 밤새 품 어 참고: 온수 커버는 thermomixer를 사용 하 여 증발을 피하기 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 추출<ol>
<li>1 시간 동안 37 ° C에서 30 미 품 대 산 페 놀 클로 프롬 및 소용돌이의 580 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>30 s와 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 원심 분리기와 동.</li>
		<li>Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3m NaOAc, coprecipitant (예: Glycoblue)의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>1 시간에 4 ° C에서 최대 속도로 centrifuging 여 펠 릿을 침전. 참고: 경우 RNA/DNA 펠 릿 했다 하지, RNA/DNA 펠 릿은 관찰 될 때까지 coprecipitant와 추가 1 h. 계속이이 단계에 대 한 원심 분리기의 추가적인 0.5 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 75% 에틸 알코올의 1 mL를 추가 합니다. 5 분에 4 ° C에서 12000 x g 에서 원심 분리기에서 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다. 상쾌한을 완전히 제거 하 고 건조 한 실 온에서 펠 릿.</li>
		<li>1 시간 동안 37 ° C에서 TDW, DNase 나 버퍼의 5 μ, RNase 억제제의 1 μ DNase I. 품 어의 2 μ의 42 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>TDW의 150 μ와 200 μ 산 페 놀 클로 프롬의 추가 합니다. 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 30 s. 원심 분리기에 대 한 소용돌이.</li>
		<li>Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3 M NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ 그리고 100% 에틸 알코올의 1 mL의 20 μ를 추가 합니다. 밤새-80 ° c.에 품 어</li>
		<li>펠 릿을 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.</li>
		<li>다시 TDW의 적절 한 금액에서을 일시 중단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 시퀀싱 라이브러리 준비
<ol><li>rRNA 제거<ol>
<li>다시 단계 2.4.10 TDW의 28 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 합니다. 참고: 총 RNA의 최대 금액 미만 5 μ g 이어야 한다.</li>
		<li>RRNA를 제거 하는 rRNA 제거 키트의 참조 가이드에서 제공 하는 절차를 따릅니다.</li>
		<li>RRNA 청소 자석 구슬의 160 μ를 추가 하 여 RNAs를 고갈.<ol>
<li>~ 15 회를 pipetting으로 혼합 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
			<li>마그네틱 바에 튜브를 부착 하 고 제거는 상쾌한.</li>
			<li>구슬과 마그네틱 바에 여전히 연결 되어 30 품 어 하는 동안 추가할 수 80% 에틸 알코올의 300 μ s.</li>
			<li>신선한 300 μ 솔루션에 에틸 알코올 바꿉니다. 공기 건조 실 온에서 12 분 동안 자기 바에 구슬.</li>
			<li>다시 일시 중단 구슬 TDW와 섞어 12 μ에 15 번 pipetting으로.</li>
			<li>마그네틱 바에 비즈를 연결 하 고 깨끗 한 PCR 튜브에는 상쾌한 이동.</li>
		</ol>
</li>
		<li>고갈 고갈 키트 rRNA에서 제공 하는 절차를 따라 조각난된 리보솜 RNAs (rRNAs) 합니다.</li>
		<li>마그네틱 구슬 및 반복 단계 3.1.3.1 3.1.3.6의 110 μ를 추가 하 여는 RNAs를 정리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 라벨 및 어댑터 결 찰<ol>
<li>RRNA 고갈 RNAs에 10 x CIAP 버퍼의 2 μ, RNase 억제제의 1 μ 그리고 남극 알칼리 성 인산 가수분해 효소의 2 μ를 추가 합니다. 그리고 5 분은 인산 가수분해 효소 비활성화 65 ° C에서 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>추가 10 x PNK 버퍼의 3 μ, RNase 억제제의 1.5 μ, T4 PNK 효소, r-ATP의 0.8 μ 그리고 TDW의 1.7 μ의 1.5 μ. 50 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>10mm ATP의 1.5 μ를 추가 하 고 추가 40 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>RNA 차입 버퍼의 170 μ를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
		<li>10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 30 s. 원심 분리기에 대 한 산 페 놀 클로 프롬 및 소용돌이의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3 M NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ 그리고 100% 에틸 알코올의 1 mL의 20 μ를 추가 합니다. 밤새-80 ° c.에 품 어</li>
		<li>펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어. TDW의 4.5 μ에서 다시 중단 하십시오 고 RNA 로드 염료 x 2의 9 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>95 ° C 5 분 및 10% 우 레 아-페이지 젤에 부하에서 샘플을 열.</li>
		<li>370 V 40 분에 젤을 실행 합니다. 참고: 미리 샘플을 로드 하기 전에 370 V 90 분에 젤을 실행 합니다.</li>
		<li>~ 100-500 뉴클레오티드 지역에서 젤 고 젤을 휴식.</li>
		<li>0.3 M NaCl의 700 μ를 추가 하 고는 회전에 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>열을 5 분 동안 실 온에서 최고 속도로 원심 분리기 솔루션을 전송 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 전송. 3m NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>3' 어댑터 결 찰<ol>
<li>펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.</li>
		<li>다시 TDW의 6.5 μ에 RNA 알 약을 중단 하 고 10 μ M 3' 어댑터의 1 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>PCR 튜브에 솔루션을 전송 하 고 2 분 동안 70 ° C에서 품 어.</li>
		<li>10 x 결 찰 버퍼 1 μ, RNase 억제제의 0.5 μ 그리고 T4 RNA 리가 2의 1 μ를 추가 합니다. 1 시간, 6 시간, 25 ° C 그리고 22 ° C 6 h 28 ° C에서 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 95 ° C에서 RNA 로딩 염색과 열 x 2의 12 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>젤 정화 3' 어댑터 출혈 RNAs 3.2.9 3.2.13에 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5' 어댑터 결 찰<ol>
<li>펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.</li>
		<li>다시 TDW의 4.2 μ에 RNA 알 약을 중단 하 고 5 μ M 5' 어댑터의 1 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>PCR 튜브에 솔루션을 전송 하 고 2 분 동안 70 ° C에서 품 어.</li>
		<li>10 x 리가 버퍼, RNase 억제제, 10mm ATP, T4 RNA 리가 1의 0.8 μ의 0.8 μ의 0.4 μ의 0.8 μ를 추가 합니다. 1 시간, 6 시간, 25 ° C 그리고 22 ° C 6 h 28 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>반전 녹음 방송 및 PCR 증폭<ol>
<li>5' 어댑터에 합자 RNAs는 4 μ M 반전 녹음 방송 뇌관의 1 μ를 추가 합니다. 2 분 동안 70 ° C에서 품 어 고 즉시 4 ° c</li>
		<li>5 x FS 버퍼 4 μ, 2.5 m m dNTP의 4 μ, 0.1 m M DTT, RNase 억제제의 1 μ 및 역전사의 1 μ 1 μ를 추가 합니다. 50 ° C 1 시간 및 15 분 동안 70 ° C에서 품 어.</li>
		<li>PCR 확대 준비<ol>
<li>RT 제품의 믹스 1 μ, 25 μ M RPI 뇌관의 1 μ, 25 μ M RP1 뇌관의 1 μ, HF 버퍼, 2.5 m m dNTP의 4 μ, TDW, 32.5 μ x 5 10 μ 그리고 높은 중 합 효소의 0.5 μ.</li>
			<li>PCR 프로그램 11 실행 ~ 13 주기. 참고: PCR에 대 한 프로그램은: 98 ° C 30에 대 한 뜨거운 시작, 98 ° C 10 s s, 60 ° C 30에 대 한 s와 45 72 ° C 확대, 그리고 5 분 동안 72 ° C에 대 한 s. 증폭 단계 11-13 사이클 반복 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>마그네틱 구슬과 다음 단계 3.1.3.1 3.1.3.6의 40 μ를 사용 하 여 하지만 TDW의 10 μ elute DNA를 사용 하 여 PCR 제품을 청소.</li>
		<li>10 x DNA 로드 염료의 2 μ를 추가 합니다. 6% 아크릴 아 미드 젤에 샘플을 로드 하 고 200 V 30 분 실행 합니다.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 Sybr 골드 (0.01% (v/v) 1 x TBE 버퍼에) 얼룩.</li>
		<li>드 실 온에서 5 분 동안 1 x TBE 버퍼에 얼룩.</li>
		<li>~ 200-700 뉴클레오티드 지역에서 젤 고 젤을 휴식.</li>
		<li>0.3 M NaCl의 700 μ를 추가 하 고 밤새 elute DNA를 실 온에서 품 어.</li>
		<li>열 및 5 분 동안 실 온에서 최고 속도로 원심 분리기에 모든 것을 로드 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 전송. 3m NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>펠 릿 DNA를 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어. TDW의 20 μ에서 다시 일시 중단 합니다.</li>
		<li>시퀀서를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. qRT-PCR를 사용 하 여 상호 작용 하는 PKR RNAs의 분석
<ol><li>방법 1: 임의의 hexamer 반전 녹음 방송<ol>
<li>다시 단계 2.4.10 TDW의 8.5 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 하 고 PCR 튜브에 솔루션을 전송.</li>
		<li>100 μ M 임의의 hexamers의 0.5 μ와 2.5 m m dNTP 혼합의 4 μ 추가 합니다.</li>
		<li>열에서 65 ° C 5 분 하 고 즉시 솔루션 적어도 1 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>혼합 반응 확인: 5 x SSIV 버퍼 4 μ, 100 m DTT, RNase 억제제의 1 μ 그리고 역전사 (200 U/μ)의 1 μ m의 1 μ. 반응 혼합 RNA 솔루션에 추가 합니다.</li>
		<li>23 ° C 10 분, 10 분, 50 ° C에서 혼합물을 품 어와 10 분 동안 80 ° C.</li>
		<li>실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 cDNA를 분석 합니다. 참고: 실시간 PCR 위한 프로그램은: 뜨거운 시작, 5 95 ° C에 대 일 분 동안 95 ° C s와 60 ° C 10에 대 한 확대, 그리고 95 ° C 30에 대 한 s s, 30 위한 65 ° C s, 그리고 95 ° C 30에 대 한 용융에 대 한 s. 증폭 단계 40 주기 반복 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>방법 2: 물가 관련 반전 녹음 방송<ol>
<li>반전 뇌관의 마스터 믹스 준비: ~ 20 뉴클레오티드 유전자 특정 시퀀스의 뒤에 동일한 양의 유전자 특정 반전 녹음 방송 뇌관 CMV 발기인 순서를 포함 하는 혼합. 참고: 모든 유전자 특정 RT 뇌관의 결합된 농도 4 μ M.</li>
		<li>다시 단계 2.4.10 TDW의 8.5 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 하 고 PCR 튜브에 솔루션을 전송.</li>
		<li>반전 녹음 방송 뇌관의 4 μ M 마스터 믹스와 2.5 m m dNTP 혼합의 4 μ의 0.5 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>열에서 65 ° C 5 분 하 고 즉시 솔루션 적어도 1 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>5 x SSIV 버퍼 4 μ, 100 m DTT, RNase 억제제의 1 μ 그리고 역전사 (200 U/μ)의 1 μ m의 1 μ를 혼합 하 여 반응 솔루션을 준비 합니다. RNA 뇌관 혼합 반응 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>50 ° C 10 분 및 10 분 동안 80 ° C에서 솔루션을 품 어.</li>
		<li>실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 cDNA를 분석 합니다. 참고: 실시간 PCR 위한 프로그램은 방법 1에 설명 된 것과 동일 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li>
<li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li>
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<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

S 또는 M 단계 체포 샘플을 준비 하는 과정은 그림 1에 나와 있습니다. S 단계에서 셀을 체포, 우리 어디 우리가 두 번 높은 체포 효율 (그림 1A)를 보장 하기 위해 사이 9 h 출시와 함께 티 미 딘과 세포 치료 티 미 딘 더블 블록 메서드를 사용 합니다. M 단계 체포, 우리 한번 티 미 딘과 세포 치료 9 h 릴리스 및 nocodazole prometaphase (그림 1B)에 블록 셀에 적용. 세포 주기 샘플 준비에서 하나의 핵심적인 단계 첫 번째 티 미 딘 블록 후 릴리스 단계가입니다. 티 미 딘을 완전히 제거 하려면 적어도 두 번 신선한 PBS로 세포 세척에 중대 하다. 부적절 한 세척 및 잔여 티 미 딘 증가 고 감소 세포 생존 능력에 발생할 수 있습니다. M 단계 체포의 성공 라운드 모양의 셀 (그림 2A</st...

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR), 일컬어 진 핵 개시 요인 2 알파 니 2 (EIF2AK2), RNAs에 의해 제공 된 정보를 전송 하는 특징이 잘 단백질 키 니 아가입니다. 그것은 진 핵 번역 개시 2 소 단위 알파 (eIF2α)에 속하는 키 가족 고 떠들고 51 글로벌 번역1을 억제 하는 감염에 대 한 응답에서에서 eIF2α phosphorylates. 이러한 맥락에서 PKR PKR 이합체 화 및 autophosphorylation2에 대 한 플랫폼을 제공 하는 바이러스 성 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)에 의해 활성화 됩니다. EIF2α, 외 PKR 수 phosphorylate 또한 p53, 인슐린 수용 체 기질 1, 억제 물 κB, 및 c 6 월 N 맨끝 키 니 아 제 (설립) 수많은 신호 변환 통로3,,45의 활동을 규제 하 6.
PKR 원래 소아마비의 dsRNAs7,8를 인식 하 여 소아마비 감염 시 eIF2α phosphorylated 키로 확인 되었다. PKR은 점점 면역 반응을 넘어 다각적인 역할을 발견 하 고 그것의 탈 선 활성화 또는 오작동 수많은 인간의 질병에서 함축 된다. 활성화/Phosphorylated PKR (pPKR) 자주 apoptosis 동안 관찰 하 고 퇴행 성 질환, 헌팅턴의 같은 특히 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병의, 그리고 알 츠 하이 머 병9 환자의 일반적인 특성은 ,,1011,,1213. 또한, PKR 대사 스트레스와 열 충격14,15,,1617등 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 됩니다. 다른 한편으로, PKR의 금지 증가 세포 증식에도 악성 변환18,19결과입니다. PKR 함수는 또한 정상적인 뇌 기능에 중요 한 이며 pPKR의 수준으로 세포 주기 동안 높은 M 단계20,,2122동안. 이러한 맥락에서 pPKR와 글로벌 번역을 억제 키 mitotic 신호 시스템에 적절 한 세포 분열20에 필요한 단서를 제공 합니다. 또한, PKR의 장기간된 활성화 G2/M 단계에 중국 햄스터 난소 세포 주기 검거 세포23에서 결과. 따라서, PKR 인 산화는 M/g 1 전환21동안 빠른 비활성화 되도록 부정적인 피드백 루프에 의해 통제 된다.
PKR의 넓은 범위 기능에도 불구 하 고 PKR 활성화에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 활성화할 수 있는 식별 표준화 높은 처리량 실험적인 접근의 부족으로 인해 제한 됩니다. 이전 학문은 보여주었다 PKR dsRNAs 두 거꾸로 Alu 반복 (IRAlus)20,24, 그러나 세포 주기 동안 또는 PKR을 활성화할 수 있는 추가 셀룰러 dsRNAs의 존재의 가능성에 의해 형성 된와 상호 작용할 수 있습니다. 인간 세포에 스트레스 조건 탐험 되지 않았습니다. RNA-인터 RNA 의무적인 단백질 (RBP)의 식별에 기존의 접근 crosslink RNA RBP 단지25,,2627에 UV 빛을 사용 합니다. 최근 연구 마우스 시스템에 자외선 가교 이렇게 적용 하 고 확인 작은 nucleolar RNAs 대사 스트레스16동안 PKR 활성화를 조절할 수 있습니다. 활용 하 여 포름알데히드의 높은 가교 효율, 우리는 HeLa 세포28에서 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 식별 하는 대체 방법 제시. 비슷한 접근 방식은 공부 스타 우 펜 및 Drosha29,,3031같은 다른 dsRBPs에 적용 되었습니다. 우리와 같은 짧은 산재 된 핵 성분 (사인), 긴 interspersed 핵 요소 (선), 내 인 성 레트로 바이러스 요소 (ERV), 그리고 심지어 알파 위성 RNAs PKR noncoding RNAs의 다양 한 종류 상호 작용 수 있습니다 발견. 또한, 우리는 PKR 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 어떤 양식을 intermolecular dsRNAs 무거운 물가 빛 사이의 상호 보완 작용을 통해 물가 RNAs28와 상호 작용할 수 있습니다 보였다. 최근 간행물은 더 일부 mtRNAs 이중 형태로 존재 하 고 흑색 종 분화 관련 단백질 5 interferons32유도 등 dsRNA 센서를 활성화할 수 있습니다 우리의 데이터 지원. 더 중요 한 것은, 식 및 mtRNAs의 subcellular 지 방화는 변조와 다양 한 스트레스에 의해 세포 주기 동안는 PKR 활성화28을 조절 하는 기능에 중요 한 있을 수 있습니다.
이 문서에서는 최근에 개발 된 포름알데히드 가교 및 immunoprecipitation (fCLIP)에 대 한 자세한 프로토콜 소개 캡처 및 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 분석 하는 방법. 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 세포 주기 검거 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 다음 PKR 바인딩된 RNAs 및 방법 이러한 RNAs를 식별 하기 위해 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 준비 하 분리 fCLIP 프로세스를 제시. 또한, 우리는 PKR 바인딩된 RNAs qRT-PCR를 사용 하 여 분석 하는 자세한 절차를 나타냅니다. 특히, 우리는 mtRNAs의 strandedness를 분석 하는 물가 관련 반전 녹음 방송 절차 제시. 설명된 프로토콜은 HeLa 세포 및 PKR, 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 공부 하거나 다른 dsRBPs의 RNA 인터 식별 키 단계의 세포 주기 샘플, fCLIP, 및 물가 관련 qRT-PCR 분석 준비 쉽게 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 7.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td><td>Biosolution</td><td>BN015</td><td></td></tr><tr><td>10X DNA 로딩 버퍼</td><td>TaKaRa</td><td>9157</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3' 어댑터</td><td></td><td></td><td>5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3</td></tr> <tr><td>M 아세트산나트륨 pH 5.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' 어댑터</td><td></td><td></td><td>5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>산-페놀 클로로포름, pH 4.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>마그네틱 비드 DNA/RNA 클린</td></tr>업 <tr><td>남극 알칼리 포스파타제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DGCR8</td><td></td><td></td><td>Made</td></tr><tr><td>in house Anti-PKR (D7F7)</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKR (Milli)</td><td>Millipore EMD</td><td>07-151</td><td></td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-2056-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue sodium salt</td><td>Sigma-aldrich</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td><td>TaKaRa</td><td>2250A</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼 25cm 2위치</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>CMV 프로모터 서열</td><td></td><td></td><td>5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco</td></tr><tr><td>의 변형 독수리 배지</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 혼합물(2.5mM)</td><td>TaKaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 앱솔루트, ACS 등급</td><td>Alfa-Aesar</td><td>A9951</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Merck</td><td>M-TMS-013-BKR</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>Merck</td><td>104008</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>바이오 베이직</td><td>GB0235</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue 코프레시피탄트(15mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Merck</td><td>8.18766.1000</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext rRNA 고갈 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E6318</td><td>rRNA 고갈 키트</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit IgG</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>PCR 전방 프라이머 (RP1)</td><td></td><td></td><td>5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'</td></tr><tr><td>PCR 인덱스 리버스 프라이머(RPI)</td><td></td><td></td><td>5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'</td></tr><tr><td>플랫 캡이 있는 PCR 튜브, 0.2mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>인산염 경화수(PBS) 정제</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Phusion high-fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>High-fidelity polymerase</td></tr><tr><td>스윙 아웃 로터가 있는 PlateFuge 마이크로 원심분리기</td><td>벤치마크</td><td>c2000</td><td></td></tr><tr><td>폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K, 재조합, PCR 등급</td><td>시그마-알드리치</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CO1 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CO1 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CO2 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CO2 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CO3 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CO3 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CYTB 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-CAATTATACCCTAGCCCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: CYTB 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: GAPDH</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND1 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND1 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND4 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND4 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND5 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND5 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND6 헤비</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머 서열: ND6 광</td><td></td><td></td><td>정방향/역방향: 5&prime;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>무작위 헥사머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>재조합 Dnase I(Rnase-free)(5 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>재조합 Rnase 억제제(40 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero rRNA 제거 키트</td><td>Illumina</td><td>MRZH116</td><td>rRNA 제거 키트</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FINEPCR, ROTATOR AG</td><td>D1.5-32</td><td></td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: CO1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTGTGTGTTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: CO1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: CO2 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: CO2 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: CO3 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열 : CO3 Light</td><td></td><td></td><td>5 &prime; -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: CYTB Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: GAPDH</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: ND1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열 : ND1 Light</td><td></td><td></td><td>5 &prime; -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: ND4 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: ND4 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: ND5 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: ND5 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: ND6 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT 프라이머 서열: ND6 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>실리콘화 폴리프로필렌 1.5mL G-tube</td><td>Bio Plas</td><td>4167SLS50</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dedecyl sulfate</td><td>Biosesang</td><td>S1010</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase In Rnase inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080093</td><td>라이브러리 준비를 위한 역전사 효소</td></tr><tr><td>SuperScript IV 역 전사 효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR 금 핵산 gl 염색</td>용 역전사 효소 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 1 (ssRNA 리가제)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 2, 절단된 KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tris-borate-EDTA buffer (TBE)</td><td>TaKara</td><td>T9122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink 단백질 A 세파로스 비드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22810</td><td>단백질 A 비드</td></tr><tr><td>초음파기</td><td>바이오 파열</td><td></td><td></td></tr> 우<tr><td>레아</td><td>바이오 베이직</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>자일렌 시안올</td><td>시그마-알드리치</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>&감마;-32P-ATP (10 &mu; 씨/&무; L, 3.3 &mu; M)</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A100UC</td><td></td></tr></tbody></table>

공부 하는 단백질 키 니 아 제 rna 포유류 세포 주기 동안 활성의 rna 인터

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR) 타고 난 면역 반응 단백질의 회원 이며, 바이러스 성 RNAs의 더블-좌초 이차 구조를 인식 합니다. 때 바이러스 이중 가닥 RNAs (dsRNAs)에 바인딩된, PKR는 이합체 화 및 후속 autophosphorylation를 겪 습. Phosphorylated PKR (pPKR) 활성화 되 고 진 핵 개시 요인 2 (eIF2α) 글로벌 번역 억제의 알파 소 단위의 인 산화를 유도 한다. PKR 세포 주기 동안과 같은 생리 적인 조건 하에서 또는 감염 없이 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 될 수 있다 제안 증거를 증가. 그러나, PKR의 RNA 활성 제에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 상호 작용 분석 표준화 된 실험 방법의 부족으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리는 실험 현재 구체적으로 풍부 하 고 PKR 분석 프로토콜 바인딩된 RNAs HeLa 세포를 사용 하 여 세포 주기 동안. 우리는 PKR RNA 복합물을 수정 하 고 immunoprecipitation를 통해 그들을 격리 포름알데히드의 효율적인 가교 활동을 활용 합니다. PKR 공동 immunoprecipitated RNAs 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 생성 하기 위해 추가 처리 수 다음. 세포질 dsRNAs PKR 상호 작용의 1 개의 주요 클래스는 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 무거운 가닥 빛 가닥 RNAs는 보완 상호작용을 통해 intermolecular dsRNAs 존재할 수 있습니다. 공부 하 고 이러한 이중 mtRNAs의 strandedness, 또한 선물이 가닥 특정 qRT-PCR를 위한 프로토콜. PKR 바인딩된 RNAs의 분석을 위해 우리의 프로토콜 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 또는 다른 dsRNA 바인딩 단백질의 RNA 인터 공부를 쉽게 수정할 수 있습니다.

HeLa 세포의 세포 주기 S 또는 M 단계에서 체포 하는 과정에 대 한 개략도 그림 1에 표시 됩니다. M 단계 체포 샘플, 우리 명확 하 게 둥근 모양의 세포 (그림 2A) 현미경을 시각화할 수 있습니다. 세포 주기 검거의 효율성 검토, FACS (그림 2B)를 사용 하 여 셀의 핵 콘텐츠를 분석 수 있습니다. 그림 3 은 D7F7 항 체 immunoprecipitate PKR에 뛰어난 능력을 보여준다 immunoprecipitation 효율 테스트에 대 한 대표적인 데이터를 보여준다. Immunoprecipitation 효율에이 차이 두 다른 PKR 항 체 (그림 4)를 사용 하 여 준비 하는 높 처리량 연속 라이브러리의 클래스 분포에 불일치에 반영 수 있습니다. D7F7 항 체의 특이성은 더 PKR immunopr...

우리는 HeLa 세포를 사용 하 여 포유류 세포 주기 동안 이중 가닥 RNA 바인딩 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)의 공부 RNA-인터에 대 한 실험적인 접근을 제시. 이 방법은 포름알데히드 crosslink RNA PKR 단지 및 PKR 바인딩된 RNAs를 풍부 하 게 하는 immunoprecipitation를 사용 합니다. 이러한 RNAs는 더 높은 처리량 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 통해 분석할 수 있습니다.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

이러한 프로토콜은 게놈 전체 방식으로 RNA 결합 단백질 PKR의 RNA 인터액터를 식별하는 방법을 제공한다. 그것은 우리가 RNA 결합 단백질에 의한 유전자 발현의 전사 후 조절을 더 잘 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 포름알데히드의 효율적인 교차 연결을 활용하여 RNA 결합 단백질에 결합된 RNase를 고치고 면역 침전을 통해 이를 풍부하게 한다는 것입니다.활성화된 PKR는 파킨슨병과 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환 환자에서 관찰된다. PKR 상호 작용 이중 좌초 RNase를 확인하면 이러한 퇴행성 질환의 발병을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 RNA 결합 단백질의 RNA 인터액터를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.특히, 우리는 이 방법이 이중 좌초 RNase와 같은 구조화된 RNase를 인식하는 단백질을 연구하는 데 유용하다고 믿습니다. 세포를 수확하기 전에 주기 체포 된 샘플의 균질성을 확인하십시오. 또한, 사용 가능한 최상의 항체를 사용하여 면역 침전 효율을 최적화하는 것이 중요합니다.시작하려면, S-또는 M 상 체포 견본을 위한 750, 000 또는 백만 HeLa 세포를 각각 종자합니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 증가합니다. 2 밀리머 티미딘으로 세포를 치료하고 18 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 신선한 미디어를 추가하고 9 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. S 상 체포 세포의 경우, 2 밀리머 리 미딘으로 세포를 치료하십시오.M-위상 체포 세포의 경우, 노코다졸의 밀리리터 당 100 나노그램으로 세포를 치료하십시오. 15시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. S-phase 샘플의 경우 세포 스크레이퍼로 세포를 수집하고 15밀리리터 원문 튜브로 이송합니다.M-위상 샘플의 경우 세포 배양 접시의 측면을 탭하여 M 상 체포 세포를 분리하고 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨냅니다. 다음으로 실온에서 380g의 세포를 3분간 원심분리합니다. 상체를 제거하고 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다.세포를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 이송합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리하고 수퍼나티를 완전히 제거합니다. 포름알데히드 교차 연결을 수행하기 위해 먼저 세포에 0.1 % 파라 포름 알데히드의 750 마이크로 리터를 추가하고 세포를 해결하기 위해 10 분 동안 실온에서 배양합니다.그런 다음, 1-어금니 글리신 250 마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 반응을 담금질합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리합니다. 수퍼네이너트는 완전히 제거합니다.다음으로, PBS의 1 밀리리터로 다시 일시 중단. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다. 0.2 부피 % 프로테아제 억제제와 2 부피 퍼센트 RNase 억제제로 보충 fCLIP 용해 버퍼의 400 마이크로 리터로 다시 중단.10 분 동안 얼음에 배양하고 초음파 를 사용하여 초음파 처리합니다. 다음으로 염화나트륨 농도를 150밀리알로 조정하고, 소용돌이를 짧게 조절하기 위해 염화나트륨 5음류 11마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 15 분 동안 섭씨 4도에서 21, 130 g의 원심분리기.초나타제를 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮춥니다. 면역 침전을 수행하기 위해 먼저 단백질 A 비드 20 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 추가하십시오. 그런 다음, 400 마이크로 리터의 fCLIP 리시스 버퍼로 구슬을 씻는다.1분 동안 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 다음으로, 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 리시스 버퍼를 신중하게 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보냅니다. 세면단계를 세 번 반복합니다.마지막 세척 후, 슈퍼 네이넌트는 완전히 제거합니다. 구슬을 fCLIP 리시스 버퍼300 마이크로리터로 재연합니다. 염화나트륨 농도를 150밀리알로 조정하기 위해 염화나트륨 5마리의 마이크로리터 8.3마이크로리터를 첨가합니다.단백질 키나아제 RNA 활성화 항체의 10 마이크로리터를 추가하고, 3시간 동안 섭씨 4도에서 회전자에 배양한다. 다음으로, 1분 동안 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 세척 버퍼를 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보페킹합니다.워시 스텝을 두 번 반복합니다. 마지막 세척 후, 슈퍼 네이넌트는 완전히 제거합니다. 다음으로 300마이크로리터의 용액을 추가하고 회전자에 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다.그런 다음 1 분간 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 세척 버퍼를 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보페킹합니다. 세면단계를 세 번 반복합니다.마지막 세척 후, 상체를 완전히 제거합니다. 다음으로 fCLIP 용출 버퍼 300 마이크로리터를 추가합니다. 25도의 ThermoMixer에서 3시간 동안 온도25도의 인큐베이션을 사용하여 구슬에서 활성을 사용하는 단백질 키나제 RNA를 엘ute합니다.상온에서 1, 000g의 원심분리기와 수퍼네이츠를 깨끗한 실리콘 튜브로 옮긴다. 마지막으로, 300 마이크로리터의 Proteinase K를 추가하고 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 배양합니다. S 또는 M 상에서 HeLa 세포의 세포 주기 체포의 효율은 FACS를 사용하여 검토되었다.D7F7 항체는 면역 침전 단백질 키나아제 RNA 활성화에 우수한 능력을 보였다. PKR 면역 침전 또는 총 HeLa lysate의 서양 얼룩 분석은 PKR의 크기에 대응하는 단 하나의 강한 밴드를 보여주었으며, 이는 D7F7 항체가 PKR을 인식하는 데 매우 특이적임을 나타낸다. 다른 면역 강수 효율을 가진 다른 PKR 항체를 사용하여, 지도 시퀀싱 읽기의 상이한 클래스 분포귀착됩니다.PKR 공동 면역 침전RNase에 대한 방사성 동위원소 신호의 감소는 성공적인 rRNA 제거 시 관찰되었다. PKR 공동 면역 침전 RNA 샘플은 부정적인 대조군과 비교하여 미토콘드리아 RNase의 강한 농축을 보였다. 가닥 특이적 역전사는 S 또는 M상 체포 세포를 위해 PKR과 공동 면역침전된 중경량 가닥 미토콘드리아 RNase를 구별하기 위해 사용되었다.세포 주기 체포 견본을 준비하는 에서 가장 중요한 단계는 PBS로 세포를 두 번 세척해야 하고 균질성을 위해 세포 파스텔만 수집해야 하거나 샘플이 손상될 것입니다. 윤리적으로 공정을 위해 가장 중요한 단계는 포름알데히드 교차 연결 및 수량입니다. 이 절차 후 에로테드 된 RNA는 북부 블로팅, qRT PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석 될 수 있습니다.이러한 실험은 PKR에 바인딩된 RNase의 유형 및 상대적 양을 식별할 수 있습니다. 이 기술은 RNA 결합 단백질에 의해 중재된 유전자 발현의 포스트 전사 조절에 대한 우리의 이해를 향상시키는 RNA 결합 단백질의 RNA 인터액터를 연구하고 확인하기 위하여 적용될 수 있습니다. 포름알데히드는 위험하므로 고정, 용액 및 초기 세척 버퍼를 신중하게 처리해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

배우세요 포르말데하이드 교차결합과 면역침전을 활용한 포유류 세포 주기 동안 PKR RNA 상호작용체를 전장유전체적으로 식별하는 방법을. 이 기술은 RNA 결합 단백질에 의한 유전자 발현의 전사후 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

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