Name: 인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 환자 유래 직교 이종이식 모델을 통해 비뇨기과 세포 암 및 대장암의 종양 성장과 자발적 전이를 연구하는 방법을. 림프절 기질 세포와의 상호작용을 분석하여 임상 관련성 높은 치료법을 개발할 수 있습니다.

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저자는 브라이언 로이터, 다니엘 베르토니, 피터 밀러, 섀넌 맥체스니에게 감사를 표하며, 뛰어난 기술 지원을 위해 이러한 연구를 시작하도록 도왔습니다. 저자는 또한 환자를 동의하고 종양 견본을 제공하는 것을 돕기 위하여 헤더 녹색 Matrana, 마가렛 Variano, Sunil Talwar 및 마리아 Latsis를 감사합니다.

이러한 동물 연구에 설명된 모든 방법은 Ochsner 건강 시스템의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인된 지침에 따라 동물 연구 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구를 위한 모든 참을성 있는 종양은 Ochsner 건강 시스템 조사 검토 위원회 및 인간에 기관 위원회의 윤리 기준에 따라 암 절제 수술을 겪고 있는 동의한 환자에게서 집합되었습니다 실험. Ochsner Health System의 보드 인증 병리학자는 종양 세포의 현미경 특징, 조직학적 유형 및 등급 수준에 따라 환자 표본의 병리학 적 진단을 결정했습니다.
참고: 다음 프로토콜은 두 개의 분리이식 모델, UCC 세포를 주입하기 위해 방광 벽의 전기 캐터삽입을 통한 UCC 모델 및 CRC 모델에서의 연구를 위한 CRC 세포의 직장 내 주사에 대한 단계를 설명합니다. 실험을 준비하고 모니터링하는 모든 단계는 두 모델 모두에 대해 동일하며, 섹션 7과 8은 UCC 점안 및 CRC 주입 절차를 각각 구체적으로 설명합니다.
1. 세포주 배양
<ol><li>완전한 RPMI-1640 배지에서 10% 태아 소 혈청, 2 nM 글루타민, 100 U/mL 페니실린 G, 그리고 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 100 mg/mL 스트렙토마이신을 보충합니다. 참고: HK 세포는 정상적인 인간 여포 수지상 세포이며 시험관 내 15개의항대에서 ≤ 16에 대해 성장하고 확장될 수 있다.</li>
	<li>실험을 준비하려면 세포를 시도하십시오.<ol>
<li>용지를 제거하고 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에 1% 트립신 2mL를 세포에 추가합니다. 세포를 5% CO2 가습 인큐베이터에 37°C에서 4분 동안 다시 놓습니다.</li>
		<li>10 mL 의 혈청학적 파이펫이 부착된 핸드헬드 파이펫 보조기를 사용하여 접시에서 15 mL 튜브로 세포를 수집합니다. 전체 RPMI-1640 매질의 8mL를 추가합니다.</li>
		<li>40 μL의 세포와 40 μL의 트라이판 블루를 96웰 플레이트의 단일 웰에 결합합니다. 혈세포계에 혼합물 10 μL을 추가하고 살아있는 세포를 계산합니다. 25 mL 완전 RPMI-1640 배지에 100만 개의 세포를 추가하여 150 mm 멸균 조직 배양 처리 접시에 추가하여 세포를 계속 성장시다. 참고: 이 단계에서 제조된 HK 세포 현탁액은 주사를 위해 종양 세포와 혼합하기 위하여 1 시간 안에 이용되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 환자 표본 수집
<ol><li>절제 수술시 동의된 환자 15(BlCaPt15, pT3b N1 M0) 및 37(BlCaPt37, pT3b pN0 M0)으로부터 UCC 종양을 수집한다.</li>
	<li>절제 수술시 동의된 환자 155(CoCaPt155, T1 N0 M0) 및 302(CoCaPt302, T1 N0 M0)로부터 CRC 종양을 수집합니다.</li>
</ol>3. 환자 종양의 확장
<ol><li>페니실린 G (500 U / mL) 및 연쇄상 구균 (500 mg / mL)을 포함하는 차가운 멸균 맥코이의 배지에서 수술시 종양을 수집합니다.</li>
	<li>임플란트 종양은 6-8 주 된 여성 NOD / SCID 마우스의 왼쪽과 오른쪽 측면에 직접.<ol>
<li>작은 수술 가위를 사용하여 작은 조각(~ 1mm 3)에 조직을 기계적으로 다진다.</li>
		<li>임플란트 조직은 13 G 골수 흡인 생검 바늘을 사용하여 좌우 측면에 피하. 참고: 총 부피는 8mm3으로 측면 양쪽에 고르게 분배됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 태그 및 luciferase 표시 종양의 농축
<ol><li>디지털 캘리퍼스를 사용하여 매주 종양 성장을 측정합니다.</li>
	<li>직경이 1cm에서 종양을 변환합니다. Luc/red 형광 단백질(RFP)-렌티바이러스(50 μL/종양, 농축된 고역자 렌티바이러스 스톡에서 1:30 희석)를 27 G 바늘로 1 cc 주사기로 사용하여 종양에 직접 주입합니다. 참고 : 환자 종양은 전형적으로 1-2 개월 직경 1cm에 도달합니다. 그러나, 성장 속도는 매우 가변적이며 종양 등급 및 유형을 포함한 다수의 인자에 기초한다.</li>
	<li>살아있는 동물에서 생물 발광 화상 진찰 (BLI)에 의해 매주 종양을 감시하십시오.<ol>
<li>마우스의 무게를 측정합니다. 150 mg/kg 의자 내 루시페린으로 의식이 있는 마우스를 주입하고 기판이 마우스 의 몸체에서 순환할 때까지 5분 동안 기다립니다.</li>
		<li>유도 챔버에서 100 % 산소, 1 L / 분에 2.5 % 이소플루란으로 마우스를 마취.</li>
		<li>이소플루란이 흐르고 이미지가 있는 BLI 이미징 머신에 마우스를 위에 놓습니다. 순차적 이미지를 사용하여 Luc/RFP 양성 종양 영역(가색 바이오 발광 이미지)의 존재를 확인합니다. 이미징이 완료된 후 마우스를 케이지로 되돌리.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 효소 소화를 위한 종양의 적당한 부분을 선택하십시오
<ol><li>UCC 또는 CRC 시술당일, 4.3.1-4.3.3 단계와 같이 루시퍼라아제 태그종양을 가진 이미지 마우스. 참고: 피하 종양이 성장하는 시간의 길이는 종양 성장 속도 및 실험에서 주입될 동물의 계획된 수에 따라 달라집니다.</li>
	<li>마우스 측면 및 이미지에서 종양을 수확합니다.<ol>
<li>화상 진찰 후에 CO2 흡입에 의하여 마우스를 안락사합니다. CO2 챔버에 마우스를 놓고, 호흡이 정지 될 때까지 1.4 L / 분에서 가스를 켜고 3 분 동안 둡니다.</li>
		<li>70% 에탄올로 깨끗한 피부. 종양 바로 위에 텐트 피부. 외과 용 가위로 피부에 작은 절개를합니다. 가위로 종양에서 피부를 분리하십시오.</li>
		<li>종양을 제거하고 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 이미징 기계에서 전체 접시를 이미지화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균 가위 또는 메스를 사용하여 종양의 루시퍼라제 양성 섹션에서 루시퍼라제 음성 섹션을 분리하고 다시 이미지하십시오.</li>
	<li>가장 매우 긍정적 인 종양 조각만 남아있을 때까지 반복하십시오.</li>
</ol>6. 종양의 효소 소화
<ol><li>층류 후드 하에서, 루시퍼라제 양성 종양 조각(단계 5.4)을 멸균 수술 용 가위를 사용하여 가능한 가장 작은 조각으로 넣고 멸균 50 mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 참고 : 종양을 가능한 가장 작은 조각으로 다듬면 더 많은 개별 세포를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>콜라게나아제 IV 10 mL(1.5 mg/mL), 히알루로니다아제 80 μL(20 mg/mL), 데옥시리보누클리스 I(0.1 mg/mL)을 HBSS 40 mL에 160 μL을 첨가하여 다이제스트 솔루션을 준비합니다. 반전하여 용액을 혼합합니다.</li>
	<li>다진 종양에 다이제스트 용액35-40 mL을 추가하십시오. 37 °C에서 2 시간 동안 연속 회전하여 배양하십시오. 참고: 종양 조직이 응집되는 것을 방지하기 위해 잠복기 내내 정기적으로 튜브를 활발하게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>멸균 100 μm 세포 스트레이너를 통해 전체 소화를 걸레로 한 다음 40 μm 세포 스트레이너를 통해 이물질을 제거합니다. 흐름을 저장하고 파편을 버립니다.</li>
	<li>329 x g에서 329 x g에 20 mL의 HBSS및 원심분리기를 추가하여 프리 셀을 세척합니다.</li>
	<li>10 μL의 셀 용액과 90 μL의 트라이판 블루를 96 웰 플레이트의 단일 웰에 결합합니다. 혈수계를 사용하여 라이브 셀을 계산합니다.</li>
	<li>마우스 당 1 x 104 ~ 1 x 106 개의 종양 세포를 멸균 된 15 mL 원점 튜브로 옮김. 마우스 당 1.2.3 단계에서 3 x 105 HK 세포를 종양 세포가있는 동일한 튜브에 추가하십시오. 참고: 총 부피가 15mL를 초과하는 경우 멸균 50mL 원엽 튜브를 사용하십시오. 항상 주사기 사용 중 유체의 손실을 설명하기 위해 연구 그룹 당 추가 동물에 대한 더 많은 용량을 계산합니다. 예를 들어, 그룹에 5개의 마우스가 포함되어 있는 경우 6개 또는 7개의 마우스에 대해 충분한 세포를 만듭니다.</li>
	<li>329 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. 흡입 또는 파이펫팅으로 상급을 폐기하십시오.</li>
	<li>UCC 모델의 경우 마우스당 50 μL 또는 완전한 RPMI 미디어에서 CRC 모델의 경우 마우스당 10 μL로 셀을 다시 일시 중단합니다. 사용할 준비가 될 때까지 셀 서스펜션을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>7. UCC 마우스 모델
<ol><li>절차를 위한 마우스의 준비<ol>
<li>6~8주 된 암컷 NOD/SCID 마우스를 구하십시오. 제모 크림을 사용하여 마우스의 허리를 면도하십시오. 이소플루란 (100 % 산소 2.5 %, 1 L / 분)으로 유도 챔버에서 마우스를 마취시.</li>
		<li>일단 진정되면, 이소플루란 코 콘에 주둥이와 함께 supine 위치에 마우스를 놓고 분산 전극에 단단히 접지 된 맨뒤로. 참고: 발가락 핀치에 반응하지 않으면 마우스가 완전히 진정됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6.9단계에서 제조된 UCC 세포를 협심증기를 사용하여 방광에 주입한다(도1Aa,Ab).<ol>
<li>단극 일렉트로카우터 기계를 설치하고 4 W. 윤활 젤리와 24G 멸균 앙지카테터를 윤활하고 암컷 마우스의 요도를 통해 삽입하는 힘으로 설정합니다. 참고: 약간의 저항이 느껴질 수 있습니다. 부드럽게 앞으로 밀거나 협심증을 제거하고 반복합니다. 강제하지 마십시오. 카테터가 입구에서 구부러지면 안정성을 제공하기 위해 멸균 가이드 와이어(7.2.2 참조)를 카테터 중간에 삽입합니다.</li>
		<li>0.025" 고정 코어 직선 가이드 와이어를 angiocatheter 의 끝을 지나 1mm 지나서 완전히 삽입하십시오. 참고: 와이어는 1mm 정지점을 나타내고 일관성을 보장하기 위해 절차 전에 테이프로 표시됩니다.</li>
		<li>단극성 핀을 가이드 와이어에 1s로 잡고 방광 점막의 전기 자극을 허용합니다.</li>
		<li>신선한 멸균 앙지오카테터를 1 cc 루어록 주사기에 부착하고 6.9단계에서 수집된 세포의 200 μL을 뽑는다. 참고 : 적어도 100 μL은 협심증에서 주사기로 손실됩니다. 필요한 셀 현탁액의 양을 계산할 때 손실 량을 보상합니다.</li>
		<li>마우스 요도에서 가이드 와이어와 항양항을 제거하십시오. 요도에 부착 된 세포의 주사기로 협심증을 삽입하십시오. 참고: 발전은 이전보다 쉬워야 합니다.</li>
		<li>마우스 방광에 세포의 50 μL을 주입하십시오. 세포가 방광 벽에 부착 될 수 있도록 angiocatheter를 제거하기 전에 몇 초 기다립니다. 참고 : 세포는 방광에 남아 원발성 종양으로 발전합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이소플루란 코 콘과 접지 패드에서 마우스를 제거합니다. 다음 절차에 대 한 마우스를 관찰. 고민의 징후를 찾아보십시오, 즉, 뒤로 구부리고, 수고한 호흡, 등등.</li>
</ol>8. CRC 마우스 모델
<ol><li>유도 챔버에서 이소플루란 (100 % 산소 2.5 %, 1 L / 분)으로 6 - 8 주 된 남성 NOD / SCID 마우스를 마취시면 됩니다. 발가락 핀치로 소동을 확인합니다.</li>
	<li>해부 현미경 의 밑에 supine 위치에 마취된 마우스를 놓고, 이소플루란 노콘에 그들의 주전자를 단단히 하고 안정성을 위한 테이프로 그들의 앞다리를 단단히 지키기 위하여 확인하십시오. 참고: 루프는 해부 현미경 대신 사용할 수 있습니다. 작은 물체를 사용하여 항문 높이를 높이면서 꼬리 밑 아래에 배치할 때 가시성과 각도를 개선할 수 있습니다. 일반적으로 거즈의 작은 부분은 1 인치 직경의 실린더 모양으로 압연됩니다.</li>
	<li>곡선 윤활 무딘 팁 집게와 항문 운하를 넓혀 말단 항문 및 직장 점막을 노출합니다. 대변을 제거합니다.</li>
	<li>50 μL 유리 주사기에 멸균 30G 이동식 바늘을 사용하여 10 μL의 종양 및 HK 세포 (단계 6.9에서)를 항문 운하 위의 말단 후방 직장 소점막사에 1 ~ 2mm를 주입하십시오. 바늘의 경사는 점막으로 덮여 있어야합니다. 골반 구멍에 전달되지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>이소플루란 코 콘에서 마우스를 제거합니다. 다음 절차에 대 한 마우스를 관찰. 고민의 징후를 찾아보십시오, 즉, 뒤로 구부리고, 수고한 호흡, 등등.</li>
</ol>9. 생물 발광 이미징
<ol><li>루시퍼라아제 활성을 위한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 1차 종양, 간 및 폐 전이성 부담을 매주 모니터링합니다.<ol>
<li>UCC 또는 CRC 실험에서 마우스를 구하고 계량합니다. 150 mg/kg 의 루시페린을 복강 내 주사하고 기판이 마우스 몸에서 순환할 때까지 5분 간 기다립니다.</li>
		<li>유도 챔버에서 100 % 산소, 1 L / 분에 2.5 % 이소플루란으로 마우스를 마취.</li>
		<li>노코콘에 코가 고정된 BLI 이미징 기계에 마우스를 놓습니다. 이미지에 노출될 때 관심 영역이 카메라를 향하고 있는지 확인합니다. UCC 및 CRC 주입의 경우 복부 측이 각 이미지에 대해 카메라를 향해야 합니다. 이미지 마우스를 척추 위치에 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. 수확 기관 및 종양
<ol><li>1 차적인 종양 발광 광도가 1 x 1011 광자에 도달하거나 마우스가 조난의 징후를 나타내는 경우 (즉, 체중 감소, 뒤로 구부리기, 가혹한 / 노동 호흡 등),CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사 (단계 5.2.1에서와 같이) 루시페린 후 주사 및 전신 이미징.</li>
	<li>간과 폐를 제거하고 페트리 접시와 이미지에 배치하여 전이를 식별하십시오. 종양, 무게 및 이미지를 제거합니다. 주변 온도에서 48 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린에서 장기와 종양을 수정하십시오. 참고: 조직의 전달을 피하기 위해 각 장기 사이에 가위와 집게를 청소/닦아줍니다.</li>
</ol>11. 조직학적 평가
<ol><li>파라핀에 포르말린 고정 조직을 포함하고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 면역 조직 화학 (IHC) 염색을위한 마이크로 토임에 5 μm 두께로 조직을 슬라이스. 참고: 파라핀 슬라이드의 모든 H&E 염색은 Ochsner Health System의 병리학 실험실에서 수행되었으며, 이 논문의 모든 IHC 염색은 Ki67을 사용한 고온 항원 회수 후 Ochsner Health System의 연구 실험실에서 수행되었으며, 시토케라틴 20항체, 바이오티닐화된 이차 항체, 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체가 제조사 지침13,17에따른다.</li>
</ol>

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</ol>

이 연구는 부분적으로 Ochsner 번역 의학 연구 이니셔티브 교부금에 의해 지원 되었다 2014. 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

전이성 질병은 대부분의 암 환자 사망에 대한 책임이 있습니다. 전 임상 치료 시험에서, 자발적인 먼 기관 전이를 가진 인간 적인 종양 성장을 가장 밀접하게 에뮬레이트하는 마우스 모형을 설치하는 것이 중요합니다. 이식된 환자 종양 유래 암세포(xenografts)를 이용한 뮤린 모델을 사용하면 종양 생물학 및 예측 바이오마커에 대한 더 나은 이해뿐만 아니라 새로운 치료법의 항종양 효과의 테스트 및 예측을 가능하게한다 18. 많은 모형은 폐 질병19또는 종양 세포 또는 종양 단편의 피하 이식을 일으키기 위하여 능력을 보여주는 정맥 꼬리 정맥 주사와 같은 뮤린 실험에서 UCC 와 CRC 전이를 보여주기 위하여 이용되었습니다 국소화 종양 성장20,21. 한 실험실은 이전에 염산 처리를 사용하여 종양 종양 포착을 성공적으로 승진시키기 에 의하여 방광...

림프절(LN) 전이는 방광 및 대장암(CRC)의 고급 비뇨기과 세포 암종(UCC)을 포함한 많은 고체 장기 악성 종양에서 불량한 예후 지표임을 나타내었다1,2. 근육 침습성 UCC (MIUCC)를 가진 환자의 반 이상은, 임상적으로 국소화한 질병을 위한 치료 치료에도 불구하고, 전이를 개발하고 5 년 안에 정지할 것입니다. 전이성 CRC는 미국에 있는 암 관련 죽음의 주요한 원인입니다.
약 81,190명의 새로운 환자 및 17,240의 암 특정 죽음은 방광의 UCC 때문에 미국에서2018년에 생길 것으로 예상됩니다 3,4. 환자가 우세하게 (70%) 비 근육 침략적인 질병으로 존재하는, 30%는MIUCC 5가 있을 것입니다. 임상적으로 국소화 된 질병에 대한 치료 요법 (전신 화학 요법유무에 관계없이 급진적 인 방광 절제술 [RC]에도 불구하고 방광의 MIUCC 환자의절반은 여전히 전이를 개발하고 5 년 이내에 사망합니다 3. 림프절침범은 RC6,7,8을겪은 환자의 약 20 %-25 %에서 발견됩니다. LN 양성 환자에 있는 5 년 생존율은 UCC 환자에 있는 예후에 대한 결정적인 음성 예측자로 LN 관련을 건의하는 RC 후에도 35% 미만입니다.
Colorectal 암은 미국에 있는 남자와 여자 둘 다에서 진단된 세 번째로 일반적인 암입니다. 환자 결과는 침략의 깊이, LN 관련 및 먼 기관 전이와 같은 종양 특성 및 종양 미세 환경에 크게 달려 있습니다. CRC에 있는 사망률은 검열과 효과적인 수술 때문에 마지막 십년간에서 감소하더라도, CRC 환자의 거의 50%가 전이또는 재발하는 질병을 개발할 것이라는 점을 추정됩니다 9.
작은 동물 모델은 종양 진행과 다른 전이성 패턴을 연구하기 위해 신속하고 재현 가능하며 수정 가능한 플랫폼을 제공합니다. 환자에서 볼 수 있는 CRC 및 UCC 전이를 일관되게 모방하는 설명된 이종이식 모델은 현재 없습니다. 암 먼 전이의 1 차적인 경로는 림프 퍼짐을 통해서입니다. 새로운 연구는 LN이 독특한 미세 환경으로 종양을 제공하고, 단순히 암세포가 일시적으로 통과하는 고정 표적일 뿐만 아니라 전이성 과정에서 암세포와 상호 작용하여 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 실제로, 우리의 연구 결과는 종양 진행 및 전이를 교육하고 승진시키는 이외에, LN 기질 미세 환경이 또한 CRC10,11에있는 약 저항에 책임 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리 연구실은 최근 환자 유래 정형외 이종이식(PDOX) 마우스 모델12,13을이용하여 CRC 및 UCC에 대한 LN 기질 세포(LNSC)의 종양성 효과를 확인하였다.

PDOX 모델 개발은 번역암 연구14,15를위한 중요한 플랫폼을 제공한다. 그들의 기증자 종양의 주요 조직학 및 유전적 특성을 유지함으로써, PDOX 모델은 통로전반에 걸쳐 안정적으로 유지되고 번역암 연구를 위한 좋은 플랫폼을 만든다12,15. PDOX 모델은 임상 결과 예측을 가능하게 하는 개인화된 의학 전략의 전임상 약물 평가, 바이오마커 식별 및 전임상 평가에 사용되고 있습니다. 현재, LN 관련의 중요성을 고려하고 CRC와 UCC에 있는 1 차적인 종양 및 먼 기관 전이를 일관되게 재생할 수 있는 기술된 이종이식 모형이 없습니다. 이 연구에서는, 우리는 LNSC 관련으로 전이성 CRC 및 UCC 질병의 재생산을 가진 NOD/SCID 마우스에 있는 PDOX 모형의 발달을 기술합니다.

<table><tbody><tr><td>Avidin-biotin-peroxidase</td><td>Vector Labs Inc</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated secondary antibody</td><td>Vector Labs Inc</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV (1.5 mg/mL)</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin (150 mg/kg)</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>122796</tr><tr><td>포르말린 (10% 중성 완충)</td><td>라이카</td><td>46129</td><td></td></tr><tr><td>글루타민 (2 nM)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Church & Dwight Co., Inc</td><td>1 (800) 248-8820</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30016.02</td><td></td></tr><tr><td>히알루로니다아제(20mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>108333</td><td></td></tr><tr><td>Luc/RFP-렌티바이러스</td><td>공동 작업자로부터. 참고 문헌 13 참조: Gills, J. et al. 방광 종양 이식, 성장, 혈관 신생 및 전이의 인간 고급 요로 상피 세포 암종을 가능하게 하는 환자 유래 orthotopic 이종 이식 모델. 종양 표적. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>맥코이' s medium</td><td>Life Technologies</td><td>110862</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100 mL (100 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>American Type Culture Collection</td><td>110636</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Gas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Oxygen</td><td>Airgas Inc</td><td>OX USP200</td><td></td></tr><tr><td>100% CO2</td><td>Airgas Inc</td><td>CD USPE</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-8 weeks old NOD/SCID Mice (수컷)</td><td>Jackson Lab</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>6-8 weeks old NOD/SCID Mice (female)</td><td>Jackson Lab</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Rabbit Monoclonal 항체</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>11799</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>15762</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 조직 배양 접시</td><td>USA Scientific Inc</td><td>CC7682-3614</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>USA Scientific Inc</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>겸</td>자 <td>대칭 수술 Inc</td><td>06-0011</td><td></td></tr><tr><td>수술 용 가위</td><td>대칭 외과 Inc02-2011</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Name </td> <td> Company </td> <td>카탈로그 번호 </td> <td>Comments</td></tr> <tr><td> Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 % CO2 가습 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>생물 발광(BLI) 이미징 머신</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>BLI 이미징 머신 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman</td><td>366830</td><td></td></tr><tr><td>디콘볼루션 현미경</td><td>지능형 이미징 혁신</td><td>Marianas</td><td></td></tr><tr><td>디콘볼루션 현미경 이미징 소프트웨어</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td>+1 (303) 607-9429 x1</td><td></td></tr><tr><td>디지털 캘리퍼스</td><td>Fowler 도구 및 기기</td><td>54-115-330</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Precision Instruments LLC</td><td>(504) 228-0076</td><td></td></tr><tr><td>전기수술 발전기</td><td>ValleyLab</td><td>FORCE1C20</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 유도 챔버</td><td>Perkin Elmer</td><td>119038</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>American Optical Corporation</td><td>829</td><td></td></tr><tr><td>피펫 에이드</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-681-15E</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫(10mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

암 환자는 림프절 (LN) 침범이 방광과 대장암 (CRC)의 고급 비뇨기과 세포 암종 (HG-UCC)에 존재할 때 나쁜 예후를 가지고 있습니다. 근육 침습성 UCC를 가진 환자의 50% 이상은, 임상으로 현지화한 질병을 위한 치료 치료에도 불구하고, 전이를 개발하고 5 년 안에 정지할 것이고, 전이성 CRC는 미국에 있는 암 관련 죽음의 주요한 원인입니다. 환자에서 볼 수 있는 UCC 및 CRC 전이를 일관되게 모방하는 이종이식 모델이 필요합니다. 본 연구는 약물 스크리닝을 위한 인간 전이성 질환의 진행을 모방한 LN 기질 세포의 영향하에 1차 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 UCC 및 CRC의 환자 유래 직교 이종이식(PDOX) 모델을 생성하는 것을 목표로 한다. 신선한 UCC 및 CRC 종양은 각각 HG-UCC 및 대장 선암에 대한 절제술을 받는 동의된 환자로부터 얻어졌습니다. LN 기질 세포 (LNSC) 아날로그 HK 세포와 병용 접종, 루시페라아제 태그 UCC 세포는 여성 비만 당뇨병 / 심한 결합 면역 결핍 (NOD / SCID) 마우스로 주입 된 내 정맥 (IB) 및 CRC 세포는 내-직장 (IR)으로 주입되었다 남성 NOD / SCID 마우스. 종양 성장 및 전이를 생물 발광 이미징(BLI)을 사용하여 매주 모니터링하였다. 희생시, 1 차적인 종양 및 마우스 기관은 헤마톡실린및 에오신 및 면역히스토화학 염색을 위해 수확, 칭량 및 포르말린 고정되었습니다. 우리의 독특한 PDOX 모형에서는, 이종이식 종양은 환자 전 이식 종양을 유사합니다. HK 세포의 존재에서, 두 모형은 BLI와 종양 무게에 의해 측정된 높은 종양 이식 비율이, UCC를 위한 83.3% 및 CRC를 위한 96.9%, 및 높은 먼 기관 전이 비율 (UCC를 위한 33.3% 검출된 간 또는 폐 전이 및 CRC를 위한 53.1%). 또한, 두 모델 모두 절차에서 사망률이 0입니다. 우리는 종양 형성, 성장 및 전이 연구를 허용하는 인간 HG-UCC 및 CRC를 위한 독특하고 재현 가능한 PDOX 모형을 설치했습니다. 이러한 모델을 통해 새로운 치료 약물의 테스트는 임상적으로 모방된 방식으로 효율적이고 수행될 수 있습니다.

UCC PDOX 모델에서, UCC 환자의 BlCaPt15 또는 BlCaPt37 세포는 HK 세포의 존재 내 존재에 주입된 내-VED/SCID마우스 방광(그림 1A). 30명 중 25명(83.3%) 동물은 주간 BLI에 기초하여 원발성 종양을 생성하고 시간 의존적 1 차 종양 성장을 표시하였다(도1B,C 및 표1). 마찬가지로 CRC PDOX 모델에서 32명 중 31명(96.9%)이 마우스는 환자의 CoCaPt155 또는 CoCaPt302 세포와 HK 세포를 더하여 주사할 때 1차 종양을 성장시켰습니다(도1D-F 및 표1). 환자 종양에 따라, 마우스 종양 성장은 환자의 임상적 특성의 차이를 반...

이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

모델은 림프절과의 상호 작용을 통해 암 전이를 모방하는 데 일관되게 필요합니다. 방광의 대장암과 비뇨기과세포암 환자. 이 논문에 설명된 당사의 직교 성 신장 제뇨 모델은 이러한 중요한 생물학적 질문에 답하고 임상적으로 관련된 방식으로 새로운 치료법을 효율적이고 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.마우스에서 생성된 우리의 치열토성 이종이이식 종양은 환자의 종양과 유사합니다. 림프절 기질 세포의 존재에서 두 모델 모두 더 높은 종양 이식 및 먼 장기 전이 속도 및 인간의 전이성 패턴을 모방 하는 위치. 또한 두 동물 모델 모두 절차 관련 사망률이 전혀 없습니다.안락사 된 마우스에서 환자 파생 된 종양을 제거 한 후, 라미나르 흐름 후드 아래 페트리 접시에서 가능한 한 작은 루시포라기 루시포제균균 수술 가위를 사용합니다. 종양 조각을 멸균 50mL 원문 튜브로 옮기다. 다이제스트 용액을 준비하려면 콜라게나아제 형 4형 10mL, 히알루로니다제 80마이크로리터, 디옥시리보누셀리스 타입 1~40mL의 160마이크로리터를 HBSS의 1~40mL로 넣고 반전하여 혼합한다.다진 종양에 35-40mL의 다이제스트 용액을 추가하고 주기적인 격렬한 흔들림으로 2 시간 동안 연속 회전으로 섭씨 37도에서 배양하십시오. 소화 후 이물질을 제거하기 위해, 멸균 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 소화된 종양을 걸러내고 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하여 매번 50mL 튜브로 흐름을 절약하고 이물질을 폐기한다. 무료 셀을 세척하려면 20mL의 HBSS를 329배의 중력으로 5분간 유량및 원심분리기에 추가합니다.슈퍼나탈을 흡인시키고 30mL의 HBSS에서 펠릿을 재보아보세요. 멸균 15mL 원칼 튜브에 100, 000 종양 세포를 전송하고 이전에 준비된 신선한 HK 세포를 300, 000을 추가한다. 세포를 329배의 중력으로 5분간 원심분리하고 포부로 상퍼를 폐기한다.완전한 RPMI 배지에서 세포를 다시 중단하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음을 유지합니다. UCC 세포 주입에 대 한 동물을 준비 하려면 6-8 주 된 여성 NOD-SCID 마우스의 허리를 면도 하는 제 모 제 크림을 사용 하 여. UCC 세포를 방광으로 투여하려면 먼저 단극성 전기 코스터리 기계를 4와트의 전력으로 설정합니다.마우스를 마취한 후, 주둥이가 이소플루란 코 콘에 주둥이로 스핀 위치에 놓고 분산된 전극에 단단히 접지된 맨뒤로 놓습니다. 윤

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Research

연구

JoVE Journal

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인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

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