Name: 대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 대류 강화 전달(CED)을 이용한 비인간 영장류 뇌 내 광유전학 바이러스 벡터 전달 방법입니다. MRI 실시간 영상 유도 하에 피질 영역에 광유전학 발현을 효율적으로 유도하여 대규모 신경 활성 조작이 가능합니다.

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이 작품은 미국 심장 협회 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다 (AY), 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) 구조 조정 및 가소성 부상 복구를 가속화하기 위해 (수리; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, UCSF 신경 과학 이미징 센터에 의해. 이 작품은 또한 수상 번호 K12HD073945, 워싱턴 국립 영장류 연구 센터 (WaNPCR, P51 OD010425)에 따라 국립 보건원의 유니스 케네디 시버 국립 연구소및 인간 개발에 의해 지원되었다 신경 기술 센터 (CNT, 그랜트 EEC-1028725에서 국립 과학 재단 공학 연구 센터). 카밀로 디아즈 보티아, 팀 핸슨, 빅토르 카라지아, 다니엘 실버스미스, 카렌 J. 맥클리오드, 줄리아나 밀라니, 블레이클리 앤드류스가 실험과 난 티안, 지웨이 허, 피터 레도쇼이치, 미셸 마하르비즈, 토니 하운의 도움을 받아 준 것에 대해 감사드립니다.

모든 절차는 캘리포니아 대학, 샌프란시스코 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수합니다. 다음 의 절차는 각각 17.5 kg 및 16.5 kg (원숭이 G 및 원숭이 J)의 무게, 8 및 7 세의 성인 남성 rhesus 원숭이 2 개를 사용하여 수행되었다.
참고: 모든 수술에 표준 무균 기술을 사용하십시오.
1. 기준선 이미징
<ol><li>동물을 진정시키고 삽관하고 이소플루란 하에서 전신 마취를 유지하십시오 (호흡률 및 심박수와 같은 활력 징후에 따라 필요에 따라 농도가 0에서 5 % 사이로 변경됩니다). 절차 전반에 걸쳐 동물의 온도, 심박수, 산소 포화도, 심전도 반응 및 CO2의 말조 부분 압력을 모니터링합니다.</li>
	<li>동물을 MR 호환 입체 프레임(재료 표참조)에 놓고 이 프레임은 절차 전체에 걸쳐 유지됩니다. 동물을 휴대용 MR 호환 isoflurane 기계에 연결하고 MRI 스캐너 (3 T)로 운반하십시오.</li>
	<li>표준 T1(플립 각도 = 9°, 반복 시간/에코 시간 = 668.6, 매트릭스 크기 = 192 x 192 x 80, 슬라이스 두께 = 1mm) 및 T2(플립 각도 = 1mm), 반복 시간/에코 시간 = 52.5, 매트릭스 크기 = 256 x 256 x 45, 슬라이스 두께 = 1mm) 해부학 MR 이미지 참조 및 수술 계획에 대한.</li>
	<li>마취에서 동물을 복구하고 동물 수용 지역으로 수송.</li>
	<li>획득한 T1 및 T2 이미지를 사용하여 개두량의 배치를 결정합니다. 개두술의 위치는 마카크 뇌 아틀라스 (Paxinos, 황, 페트리드, 토가 2nd Edition)와 MR의 관심있는 피질 영역을 일치시킴으로써 정확하게 결정될 수 있습니다. 또한, 이들 기준선은 바이러스 주입의 위치에 대한 추정치를 제공할 수 있다. 여기서 입증된 피질 영역은 M1 및 S1입니다.</li>
</ol>2. MR 호환 챔버 이식
<ol><li>동물을 진정시키고 삽관하고 1.1에서와 같이 표준 마취 모니터링으로 전신 마취를 유지하십시오.</li>
	<li>동물을 MR 호환 입체 프레임에 놓고 챔버 이식 및 바이러스 벡터 전달 전반에 걸쳐 유지됩니다. 동물을 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 연결합니다.</li>
	<li>메스로 약 5cm의 길이로 중간선에서 약 2cm 의 시상 절개를 만듭니다.</li>
	<li>엘리베이터를 사용하여 두개골에서 기본 연조직을 제거합니다(재료 표참조).</li>
	<li>트레핀을 사용하여 주사를 위해 미리 계획된 궤적을 덮기 위해 원형 개두술(직경 2.5cm)을 만듭니다(재료 표참조).<ol>
<li>트레핀의 가장자리를 지나 트레핀의 중심점을 낮춥습니다. 계획된 두개골 절제술의 중심에 트레핀의 조정 가능한 중심점을 사용하여 트레핀을 고정시키기에 충분히 깊은 두개골의 중심에 들여쓰기를 만듭니다. 이 기본 신경 조직에 손상을 일으킬 수 있기 때문에 완전히 두개골의 깊이 통해 침투 하지 않도록 주의 운동.</li>
		<li>개두술 전반에 걸쳐 조직 수분을 유지하기 위해 필요에 따라 주기적으로 식염수로 영역을 세척하십시오.</li>
		<li>중심이 만들어지면, 트레핀을 두개골에 내리고 트레핀을 시계 방향으로 반시계 방향으로 돌리면서 뼈 캡을 집게로 제거할 수 있을 때까지 하향 압력을 가합니다. 트레핀으로 기본 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>개두술의 중심에있는 경막을 통해 미세 봉합사 (크기 6-0)를 스레드하고 개두량의 중심에 텐트를 만드는 뇌의 표면에서 봉합사를 부드럽게 당겨 dura를 들어 올립니다.</li>
	<li>다음으로, 뇌손상을 피하기 위해 미세한 안과 가위를 사용하여 텐트 중앙에 가까운 경막을 뚫습니다. 그런 다음 개두술의 가장자리중앙에서 경막경을 잘라 내고 미세한 옵티마이드 가위로 가장자리를 따라 계속합니다.</li>
	<li>원통형 맞춤형 CED MR 호환 챔버(도1참조, 생산 지침 섹션 4 참조)를 두개골 상단에 두개골 위에 장착하여 CED 주입 시 캐뉼라 지지대를 제공하여 챔버 플랜지의 곡률이 정렬되도록 합니다. 두개골의 곡률과 잘.</li>
	<li>플라스틱 나사와 치과 용 아크릴 또는 몇 개의 티타늄 나사를 사용하여 임플란트를 두개골에 고정하십시오.</li>
</ol>3. 바이러스 벡터 전달
<ol><li>MR 호환 챔버를 이식하고 캐뉼라 주사 그리드(그림1A-B, 보조 도1)를 챔버에 삽입한 직후, MR 해부학 적 이미지를 통해 주사 위치를 시각화하기 위한 식염수(0.9% NaCl)로 그리드를 채우고 뇌의 수분을 유지하기 위해 젖은 멸균 흡수 성 젤라틴으로 챔버 캐비티를 채웁니다 (그림1F).</li>
	<li>운반 및 MR 주입 중에 실린더의 멸균성을 유지하기 위해 멸균 항균 절개 드레이크로 피부와 실린더를 덮습니다. 양성 식별을 위해 사출 그리드의 상단을 표시하기 위해 비타민 E 캡슐을 놓습니다.</li>
	<li>동물이 삽관된 채로 남아 있는 동안, 마취 회로에서 endotracheal 관을 분리하고 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 다시 붙이고 MRI 스캐너에 동물을 수송합니다.</li>
	<li>T1 이미지(플립 각도 = 9°, 반복 시간/에코 시간 = 668.6, 매트릭스 크기 = 192 x 192, 슬라이스 두께 = 1mm, 80슬라이스)를 획득하여 사출 그리드와 피질 표면의 상단으로부터의 거리를 계산합니다. 비타민 E 캡슐은 T1 이미지에서 명확하게 볼 수 있으며 사출 그리드의상단에 대한 마커로 사용되어야합니다 (그림 2A). MR 이미징 소프트웨어의 눈금자 도구를 사용하여 사출 그리드의 상단과 피질 표면 사이의 거리를 측정합니다.</li>
	<li>T2 이미지(플립 각도 = 130°, 반복 시간/에코 시간 = 52.5, 매트릭스 크기 = 256 x 256, 슬라이스 두께 = 1mm, 45슬라이스)를 획득하여 대상 주입 부위를 기준으로 각 사이트에 대한 최적의 캐뉼라 가이드를 결정합니다(그림2B-C). 앞에서 언급했듯이 캐뉼라 그리드는 T2 이미지에서 가장 잘 보이는 식염수로 채워져 있습니다. MR 이미징 소프트웨어를 사용하여 관상 및 시상 평면을 스크롤하여 주입의 대상 위치를 찾습니다.</li>
	<li>실온에서 몇 시간 동안 바이러스 벡터를 해동한 후, 바이러스 벡터를 MR 조영제 가도테리돌(250:1; 2mM Gd-DTPA 의 비율, 재료표참조)과 파이펫 또는 와류 혼합에 의해 혼합한다. 참고: 제시된 기술은 EYFP에 융합된 C1V1의 캄키아 프로모터 구동 발현을 이용한 AAV 벡터에 대해 시험하였다(AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, 역가: 2.5 x 1012 바이러스 분자/mL; 물질표참조).</li>
	<li>혼합 바이러스를 0.2 mL 고압 IV 튜브에 로드합니다(재료 표참조).</li>
	<li>바이러스 주입 라인을 준비하기 위한 MR 스캐너 외부에 멸균 장을 설치합니다.</li>
	<li>고압 IV 튜브를 사용하여 MR 호환 3 mL 주사기와 식염수프라임에 긴 연장 라인 (MR 보어에 대한 주입 펌프의 위치에 따라 약 3-5 미터)을 연결합니다.</li>
	<li>바이러스가 로드된 0.2 mL IV 튜브의 근측 끝에 긴 연장 선의 말단을 연결하고 역류 방지 캐뉼라를 1 mm 스프팁(그림2D;캐뉼라 생산 지침의 섹션 5 참조)의 말단끝에 부착합니다. 클램프 스타일 카테터 커넥터가 있는 이 어셈블리(재료 표참조) (그림2E).</li>
	<li>마지막으로, MR 호환 펌프에 주사기를 설정합니다(재료 표참조). 펌프 컨트롤러는 MR과 호환되지 않기 때문에 스캐너 제어실에 놓습니다.</li>
	<li>이전에 얻은 기준선 해부학 MR 이미지를 사용하여 대상 주입 부위에 도달하는 데 필요한 캐뉼라 주입 그리드 위치와 삽입 깊이를 선택합니다. 멸균 테이프를 사용하여 캐뉼라에 삽입 깊이를 표시합니다.</li>
	<li>1 μL / min의 속도로 주입을 시작하고 캐뉼라 팁에서 유체의 배출을 관찰하여 주입 라인에서 유체의 흐름을 시각적으로 검증하십시오.</li>
	<li>주입 라인의 흐름을 유지하면서 주입 그리드를 통해 수동으로 주입 그리드를 삽입하면 침투 된 조직이 삽입 중에 캐뉼라를 막히는 것을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>바이러스 벡터 주입의 온라인 모니터링을 위해 빠른 (2 분) 플래시 T1 가중치 이미지 (플립 각도 = 30 °, 반복 시간 / 에코 시간 = 3.05, 매트릭스 크기 = 128 x 128, 슬라이스 두께 = 1mm, 64 슬라이스)를 획득하십시오.</li>
	<li>MR 스캐너에서 검출하기에 충분한 바이러스가 주입되도록 벡터의 ~10 μL을 주입한 후, MR 영상을 얻어 바이러스의 관찰된 확산에 의해 명백한 바와 같이 올바른 캐뉼라 배치를 확인한다. 삽입된 캐뉼라의 깊이가 올바르지 않으면 그에 따라 깊이를 조정하거나 캐뉼라를 천천히 제거하고 3.12에서와 같이 삽입을 다시 시도하십시오.</li>
	<li>온라인 MR 이미지의 안내를 통해 주입을 모니터링하고 (플래시 T1 가중) 주입 속도를 증가 5 μL /분 1 μL / 분 단계마다 몇 분 (그림 3A).</li>
	<li>바이러스 벡터의 약 40 μL을 주입 한 후 주입 속도를 1 μL / min 단계로 줄이기 시작하고 ~ 50 μL주입 후 주입을 중지하고 캐뉼라를 10 분 동안 제자리에 둡니다.</li>
	<li>천천히 뇌에서 캐뉼라를 제거하고 다음 위치로 이동합니다. 각 위치에 대해 3.9~3.19단계를 반복합니다.</li>
	<li>동물 수송 전에 주사 끝에 멸균 드레이프로 실린더를 덮습니다. 그런 다음 동물을 수술실로 다시 옮김시고.</li>
	<li>MR 호환 챔버를 이식하고 뼈 플랩과 겹쳐진 근육을 교체하고 표준 무균 기술을 사용하여 피부를 봉합하거나 챔버를 티타늄 실린더 및 인공 경루로 교체하여 수술 절개를 닫습니다(참조) 야즈단-샤모라드 외. 20169)신경 녹음 및 자극.</li>
</ol>4. MR 호환 챔버 생산
<ol><li>나일론 캐뉼라 사출 그리드 (그림1A-B)를지정된 치수에 따라 가공하여 제작합니다 (보충그림1).</li>
	<li>아크릴로니트리리리티엔 스티렌(ABS0 플라스틱(그림1C-E)에서MR 호환 실린더를 3D 인쇄합니다(추가 파일 1-3참조, 3D 프린터 및 재료용 재료 표 참조). 참고: 하나의 설계는 MR 호환 실린더(그림1C)내에서 고정 캐뉼라 사출 그리드를 유지하며, 다른 설계는 그리드의 회전을 허용하고 사출 영역을 확장합니다(그림1D-E).</li>
	<li>캐뉼라 사출 그리드를 스레드하고 두 조각이 동일한 스레딩을 나타내지 있도록 MR 호환 챔버의 해당 캐비티를 탭합니다. 참고: 두 구성 요소에 동일한 스레딩이 있는 경우 모든 유형의 스레딩을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>MR 호환 실린더의 탭된 구멍에 나사로 조여 나일론 캐뉼라 사출 그리드를 삽입합니다.</li>
</ol>5. 역류 내성 캐뉼라 생산13
<ol><li>면도날을 사용하여 내부 실리카 튜브(재료 표참조)에 대해 0.32 mm ID와 0.43 mm OD로 30cm 길이의 실리카 튜브를 자른다.</li>
	<li>7.5 cm 길이와 0.45 mm ID와 0.76 mm OD로 5cm 길이의 실리카 튜브를 자르면 외부 실리카 튜브가 있습니다(재료 표참조).</li>
	<li>7.5 cm 외부 튜브를 시아노아크릴레이트로 30cm 내부 튜브에 부착하여 내부 튜브가 외부 튜브를 넘어 1mm 연장되도록하여 역류 방지 단계를 만듭니다(그림 2D). 시아노아크릴레이트내부튜브의 내부로 들어가지 않도록 하기 위해, 캐뉼라 팁에서 멀리 떨어진 내부 튜브의 바깥쪽에 시아노아크릴레이를 놓습니다.</li>
	<li>클램프 스타일 카테터 커넥터에 부착하기 위해 내부 튜브의 다른 쪽 끝에 5cm 길이의 실리카 튜브를 붙여 넣습니다(단계 3.10 참조).</li>
</ol>

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</ol>

PNS는 뇌 자극을 이용한 임상 치료를 개발하는 회사인 Neuralink Corp.에 재정적 관심을 가지고 있습니다.

여기에서, 우리는 MR 유도된 CED에 의하여 NHP 1 차 체감각 및 모터 피질에 있는 대규모 광유전학 표현을 달성하기위한 실행 가능하고 능률적인 기술을 개략적으로 설명합니다. MR 유도 CED의 사용은 NHP 두뇌에 있는 바이러스성 주입의 전통적인 방법에 비해 중요한 이점을 제시합니다. 이러한 장점 중 하나는 필요한 주입이 적은 넓은 영역에 대한 발현을 달성할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 종래의 방법으로, 2-3 mm 직경 영역 1,2,5,17에서벡터 항복 발현의 1-2 μL의 다중 주사. 대규모 벡터 확산을 달성하기위한 이전의 시도는 여러 주사18로약 10mm3의 발현 량을 산출했지만, 여기에서우리는 몇 가지 주입만으로 200 m...

광유전학은 신경 활동의 조작과 뇌의 네트워크 연결 연구를 허용하는 강력한 도구입니다. 비 인간 영장류에서이 기술을 구현 (NHPs) 대규모 신경 계산의 우리의 이해를 향상 시킬 가능성이 있다, 인식, 그리고 영장류 두뇌에 행동. 광유전학이 최근 몇 년 동안 NHP에서성공적으로 구현되었지만 1, 2,3,4,5,6,7, 연구원 얼굴은 이 동물에 있는 큰 두뇌 지역에 걸쳐 표현의 상부를 달성하고 있습니다. 여기에서, 우리는 원숭이에 있는 피질의 넓은 지역에 걸쳐 광유전학 표현의 상부를 달성하기 위하여 능률적이고 간단한 접근을 제공하고 있습니다. 이 기술은 최첨단 기록8,9 및 광학 자극10 기술과 함께 이러한 동물의 현재 광유전학 연구를 향상시킬 수있는 큰 잠재력을 가지고있다.
대류 강화 전달(CED)은 바이러스 벡터를 포함하는 약리작용제 및 기타 큰 분자를 중추신경계(11,12,13)로전달하는 확립된 방법이다. 기존의 전달 방법은 뇌의 작은 영역에 분산 된 여러 낮은 볼륨 주입을 포함하는 반면, CED는 적은 주입으로 더 광범위하고 균일 한 에이전트 분포를 달성 할 수 있습니다. 주입 중 압력 구동 벌크 유체 흐름 (대류)은 CED를 가진 바이러스 성 벡터를 전달할 때 표적 조직의 보다 광범위하고 균일하게 분포된 전달을 허용합니다. 최근 연구에서, 우리는 자기 공명 (MR) 유도 CED를 사용하여 1 차 모터 (M1) 및 체감각 (S1) 코르티즘9 및 시상14의 넓은 영역의 형질 전환 및 후속 광유전학 적 발현을 입증했다.
여기에서, 우리는 단지 몇몇 피질 주사를 가진 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적인 표현을 달성하기 위하여 CED의 사용을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 고압 IV 튜빙</td><td>Smiths Medical Inc., 더블린, 오하이오, 미국</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD 실리카 튜빙</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD 실리카 튜빙</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, 펜실베니아</td><td></td><td></td>대학교</tr><tr><td>ABS 플라스틱</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>항균 절개 드레이프</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>이오반 드레이프</td></tr><tr><td>치과 아크릴</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>아크릴 결합제</td></tr><tr><td>엘리베이터</td><td>VWR International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>Langenbeck 엘리베이터, 와이드 팁</td></tr><tr><td>미세 봉합사</td><td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>광 자극용 레이저</td><td>Omicron-Laserage, 독일</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR 호환 3cc 주사기</td><td>Harvard 장치, Holliston, MA, USA</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>MR 이미징 소프트웨어</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>MR 호환 펌프</td><td>하버드 장치, 홀리스턴, 매사추세츠, 미국</td><td>Harvard PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>MR 호환 입위 프레임</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>페리픽스 클램프 스타일 카테터 커넥터</td><td>B-Braun, 베들레헴, 펜실베니아, 미국</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 나사</td><td>플라스틱 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>나일론 나사</td></tr><tr><td>티타늄 나사</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>셀프 태핑 뼈 나사</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,SKU</td><td>:GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE 3D 프린터</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin E Capsule</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>습식 멸균 흡수성 젤라틴</td><td>Pfizer Inc.</td><td>AZL0009034201</td><td>젤폼</td></tr></tbody></table>

대류 온라인 mri 이미지의 지도하에 rhesus macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

비 인간 영장류 (NHP) 광유전학에서, 바이러스 성 벡터로 큰 피질 영역을 감염하는 것은 종종 어렵고 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 여기에서, 우리는 1 차적인 체감각 (S1) 및 모터 (M1) 원숭이의 피질 피질 로 광유전학 적 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도 대류 강화 전달 (CED)의 사용을 입증하여 효율적이고 광범위한 피질 발현을 얻습니다. 빛에 민감한 이온 채널. 황색 형광 단백질(EYFP)에 융합된 적색 이동 opsin C1V1을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 MR-유도 CED 하에서 코막강 마카크의 피질내로 주입되었다. 3개월 후 주입 후, 에피인광 이미징은 2개의 원숭이에서 M1 및S1에서 광유전학적 발현(>130 mm2)의 큰 영역을 확인하였다. 또한, 마이크로 전기 코르티코그래피 어레이를 사용하여 표현 영역에서 신뢰할 수 있는 빛을 불러일으킨 전기 생리학적 반응을 기록할 수 있었습니다. 나중에 리포터에 대한 조직학적 분석 및 면역 염색은 후피광성 이미징에 의해 지시된 분포에 대응하는 M1 및 S1에서 광범위하고 조밀한 광유전학적 발현을 밝혀냈다. 이 기술은 우리가 전통적인 기술에 비해 최소한의 손상으로 시간의 짧은 기간 내에 피질의 넓은 영역에 걸쳐 발현을 얻을 수 있게 하고 NHPs와 같은 큰 동물에 있는 광유전학 바이러스성 납품을 위한 최적 접근일 수 있습니다. 이 접근법은 인간과 진화적으로 가까운 동물 모델에서 세포 유형 특이성을 가진 신경 회로의 네트워크 수준 조작에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.

MRI 지침에 따라 대류 향상된 전달 (CED)
바이러스 벡터의 확산은 온라인 MR 이미지의 지도하에 CED 주입동안 모니터링되었다(도 3A). 본 연구에서는, 두 마리의 원숭이의 S1및 M1을 표적으로 하였다(도 3B). 3차원 분포량은 Yazdan-Shahmorad 등 에서 설명한 바와 같이 MR 이미지(그림3C)의사후 분석에서 추정되었으며, 2016년 9월 9일, 피질의 넓은 영역의 커버리지를 확인하였다. 원숭이 G에 대한 M1 주입은 시간 제약으로 인해 MR 안내없이 수행되었습니다.
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여기에서, 우리는 마카크 두뇌에 있는 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적 표현을 달성하기 위한 효율적이고 간단한 접근으로 피질로 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도된 대류 강화한 납품 (CED)를 보여줍니다.

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

비 인간 영장류에 있는 광유전학 바이러스 벡터의 대류 향상한 납품, 또는 CED는 연구원이 복잡한 신경 계산 및 행동을 이해하기 위하여 대규모로 신경 활동을 조작하는 것을 가능하게 할 것입니다. CED를 사용하면 전통적인 방법에 비해 짧은 시간에 몇 번의 주사만으로 영장류 뇌의 큰 영역에 걸쳐 높은 광유전학 적 발현을 달성 할 수 있습니다. 자기 공명 또는 MR 호환 챔버 이식은 비 인간 영장류 수술에서 표준 관행을 사용하여 수행되며, 절차는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 이 비디오에서 간략하게 설명된다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 동물 진정, 위치 지정 및 초기 절개에 따라, 트레핀을 사용하여 주사에 대한 미리 계획된 궤적을 커버하는 원형 두개통절제술을 생성한다. 트레핀의 조절 가능한 중심점을 사용하여 트레핀을 고정하기 위해 두개골 깊숙이 계획된 두개골 절제술의 중심에 들여쓰기를 만듭니다. 센터가 만들어지면 트레핀을 두개골에 내리고 트레핀을 시계 반대 방향으로 회전시키면서 골격 캡을 집게로 제거할 수 있을 때까지 하방 압력을 가합니다.텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 두라를 들어 올린 후 두라를 중앙에서 두개골 절제술의 가장자리로 자르고 미세한 안과 가위로 가장자리를 따라 계속합니다. 원통형 관습을 탑재하여 두개골 위에 있는 두개골에 전달 MR 호환 챔버를 강화하여 챔버 플랜지의 곡률이 두개골곡과 잘 정렬되는 주입은 주포 중에 캐뉼라 지원을 제공합니다. 플라스틱 나사와 치과 아크릴 또는 몇 티타늄 나사를 사용하여 두개골에 임플란트를 고정하십시오.MR 호환 챔버를 이식하고 챔버에 캐뉼라 주입 그리드를 삽입한 직후, MR 해부학 적 이미지를 통해 주입 위치를 시각화하기위한 0.9 % 식염수로 그리드를 채웁니다. 또한 뇌의 수분을 유지하기 위해 젖은 멸균 흡수성 젤 폼으로 챔버 구멍을 채웁니다. 수송 및 MR 주입 시 실린더의 멸균성을 유지하기 위해 멸균 항균 절개 드레이프로 피부와 실린더를 덮습니다.비타민 E 캡슐을 배치하여 주사 그리드의 상단을 표시하여 긍정적인 식별을 합니다. 동물이 삽관된 상태로 남아 있는 동안 마취 회로에서 내트라큐리 튜브를 분리하고 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 다시 부착합니다. 동물을 MRI 스캐너로 운반합니다.T1 이미지를 획득하여 사출 그리드와 피질 표면의 상단에서의 거리를 계산합니다. 비타민 E 캡슐은 T1 이미지에서 명확하게 볼 수 있으며 사출 그리드의 상단에 대한 마커로 사용해야합니다. T2 이미지를 획득하여 주입 대상 부위를 기반으로 각 부위에 대한 최적의 캐뉼라 가이드를 결정합니다.캐뉼라 그리드는 T2 이미지에서 가장 잘 볼 수 있는 식염수로 채워져 있습니다. MR 이미징 소프트웨어를 사용하여 관상 및 좌활 평면을 스크롤하여 주입의 대상 위치를 찾습니다. 실온에서 몇 시간 동안 바이러스 벡터를 해동한 후, 피펫 또는 소용돌이 혼합에 의해 MR 조영제 가도테돌과 바이러스 벡터를 혼합한다.혼합 바이러스를 0.2 밀리리터 고압 IV 튜브에 적재합니다. 고압 IV 튜브를 사용하여 긴 연장 라인을 MR 호환 3 밀리리터 주사기에 연결하고 식염수와 프라임하십시오. 바이러스가로드 된 0.2 밀리리터 IV 튜브에 긴 확장 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다.그런 다음 1 밀리리터 스노단 팁으로 역류 저항 캐뉼라를 클램프 스타일 카테터 커넥터로 이 어셈블리의 단부 끝에 부착합니다. 마지막으로 MR 호환 펌프에 주사기를 설정합니다. 얻어진 기준선 해부학 MR 이미지를 사용하여 대상 주입 부위에 도달하는 데 필요한 캐뉼라 사출 그리드 위치 및 삽입 깊이를 선택합니다.멸균 테이프를 사용하여 캐뉼라의 삽입 깊이를 표시합니다. 분당 1마이크로리터의 속도로 주입을 시작하고 캐뉼라 팁에서 유체의 배출을 관찰하여 주입 라인에서 유체의 흐름을 시각적으로 검증합니다. 주입 라인의 흐름을 유지하면서 주입 그리드를 통해 수동으로 캐뉼라를 삽입하여 삽입 중에 침투된 조직이 캐뉼라를 막히는 것을 방지할 수 있습니다.이제 바이러스 벡터 주입의 온라인 모니터링을위한 빠른 플래시 T1 가중 이미지를 습득. MR 스캐너에서 검출하기에 충분한 바이러스가 주입되는 벡터의 약 10 마이크로리터를 주입한 후, 관찰된 바이러스 확산에 의해 명백한 정확한 캐뉼라 배치를 확인하기 위해 MR 이미지를 얻습니다. 삽입된 캐뉼라의 깊이가 올바르지 않으면 깊이를 적절히 조정하거나 캐뉼라를 천천히 제거하고 삽입을 다시 시도합니다.온라인 MR 이미지의 지침을 통해 주입을 모니터링합니다. 분당 마이크로리터를 분당 1단계로 분당 5마이크로리터로 늘리는 데 몇 분마다 주입 속도를 높입니다. 주입 속도를 천천히 높이고 높은 주입 속도가 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 분당 5 마이크로 리터를 초과하지 않는 것이 중요합니다.바이러스 벡터의 약 40 마이크로리터를 주입한 후 분당 1마이크로리터로 주입 속도를 감소시키기 시작합니다. 약 50 마이크로리터가 주입된 후 주입을 중단하십시오. 캐뉼라를 10분 동안 제자리에 둡니다.천천히 뇌에서 캐뉼라를 제거하고 다음 위치로 이동합니다. 동물 수송 전에 주사의 끝에 멸균 커튼으로 실린더를 덮고, 수술실로 다시 동물을 수송합니다. 직렬 관상 학문 섹션에 대한 조직학적 분석은 주입 부위 의 주위에 대규모 광유전학 적 발현을 드러낸다.여기에 표시된 기준관상 MR 이미지와 동일한 MR 코로나 슬라이스에 대한 주입 후 조영제의 확산이 도시되어 있다. 관상 조직 섹션은 거의 동일한 에서 표시됩니다. 과록시다제 염색은 황색 형광 단백질 또는 EYFP 리포터의 발현을 반영한다.좋은 정렬은 EYFP 발현의 영역 사이 관찰되며, 표면 에피플루오레스향과 조직학적 염색으로 측정됩니다. 여기에는 MR 이미지에서 추정된 벡터 스프레드 영역이 포함됩니다. 흰색 점은 주입 부위를 나타내고 전체 검은 색 영역은 두개골 절제술에 의해 노출 된 영역을 나타냅니다.여기에 도시된 관상부 단면도의 낮은 배율 이미지는 색소 감각 피질에서 YFP 발현의 내측 측면 측면을 나타내는 항GFP 항체로 염색된다. 검은색 화살표헤드는 캐뉼라 트랙의 위치를 나타냅니다. 인접한 조직은 YFP 양성 세포의 라미나르 분포를 보여주기 위해 더 큰 배율로 나타난다.YFP 양성 세포의 인구 밀도가 높은 영역은 주로 2~3층과 5층에서 6층으로 위치하고 있다. 추가 확대는 2층에서 3층, 층 5층 및 층 6층에서 전형적인 피라미드 세포를 드러낸다. 흐름이 중지된 후 10분 동안 캐뉼라를 제자리에 두는 것이 중요합니다.이것은 바이러스가 주변 표적 신경 조직으로 침투했다는 것을 보장할 것입니다. CED는 포유류의 큰 뇌 영역에서 균일하게 높은 발현 수준을 달성하기 위한 효율적인 접근법입니다. 그것은 신경 회로와 연결에 대한 우리의 이해를 확장 할 수있는 잠재력을 가지고.CED에 의한 바이러스 성 트랜스듀션 후, 후속 광유전학 자극 실험은 전기 기록 및 행동 에세이와 결합하여 뇌 내의 복잡한 회로 역학을 드러낼 수 있습니다. 이 기술은 이전에 야즈단 샤모라드와 동료에 의해 사용되었습니다 2018 있는 광유전학 신경 변조는 감각 모터 피질에 있는 네트워크 넓은 연결 변경을 유도하기 위하여 이용되었습니다.

convection-enhanced-delivery-optogenetic-adeno-associated-viral

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 시각 피질의 뉴런과 glia의 형광 라벨에 대한 AAV 벡터의 intracranial 주사를 제시한다.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

이 프로토콜은 광유전학적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 성공적으로 수행하는 데 필요한 단계와 데이터 분석을 설명합니다. ofMRI는 고자기장 fMRI 판독과 광유전학적 자극을 결합한 새로운 기술로, 살아있는 뇌 전체에 걸쳐 기능적 신경 회로와 그 역학의 세포 유형별 매핑을 가능하게 합니다.

Optogenetic 기능 MRI

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

현재 시행 된 바와 같이, 인간이 아닌 영장류의 광유전학은 바이러스 벡터를 뇌에 주입해야합니다. 최적의 주입 방법은 신뢰할 수 있어야 하며 많은 응용 분야에서 사후 조직학에서 쉽고 명확하게 식별되는 임의의 깊이의 개별 부위를 표적으로 삼을 수 있어야 합니다. 이러한 특성을 갖는 주입 방법이 제시된다.

마취 및 깨어 있는 행동하는 비인간 영장류 뇌에서 광유전학을 위한 AAV 벡터 주사

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

지주막하 바이러스 주입을 사용하는 아데노 관련 바이러스의 광범위한 전달을 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 이 방법은 표재층에서 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장할 뿐만 아니라 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 5층 피라미드 뉴런에서 전이유전자의 선택적 발현을 초래합니다.

AAV2의 지주막하 주입에 의한 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입

이 프로토콜은 바이러스 전달, 광혈전 이식, 광혈전 유도, 성상교세포 및 신경세포 활동의 동시 기록, 성상교세포의 광유전학적 자극을 포함하는 통합 방법을 제공합니다. 이 통합 방법은 허혈성 뇌졸중의 급성기부터 만성기까지의 성상교세포-뉴런 관계를 동시 조사하는 것을 목표로 합니다.

광혈전성 뇌졸중 모델링과 행동하는 쥐의 신경 및 성상세포 활동의 생체 내 옵트로드 기록을 위한 통합 방법

절차는 뇌파, electromyogram, 그리고 뇌성 젖산 농도를 모니터링하는 동안 optogenetically 뇌성 대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 활동을 조작하기위한 설명되어 있습니다. 사람들이 자연 수면 / 웨이크주기를 받아야 동안 실험 녹음 케이블 테 더링 마우스에 수행됩니다. Optogenetic 장비는 우리의 실험실에서 조립, 녹화 장비는 상업적으로 사용할 수 있습니다.

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

배우세요 대류 강화 전달(CED)을 이용한 비인간 영장류 뇌 내 광유전학 바이러스 벡터 전달 방법입니다. MRI 실시간 영상 유도 하에 피질 영역에 광유전학 발현을 효율적으로 유도하여 대규모 신경 활성 조작이 가능합니다.

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

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