Name: 성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 학습하세요 성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 방법을 통해 신경회로 자극이 성인 신경발생에 미치는 영향을 분석하는 기법입니다. 이 프로토콜은 정밀한 회로 조작과 동물 스트레스 감소를 통해 신경줄기세포 증식을 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.J.Q.는 다양성 보충 R01MH11773뿐만 아니라 T32 훈련 교부금 T32NS007431-20에서 건강의 국립 연구소의 정신 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 이 프로젝트는 NIH(MH111773, AG058160 및 NS104530)로부터 J.S.에게 수여된 보조금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132 (4), 645-660 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hippocampal+neurogenesis+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans.</a> Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).</li>
<li>Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+is+Sufficient+to+Reduce+Anxiety+and+Depression-Like+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors.</a> Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, (2009).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).</li>
<li>Anacker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+confers+stress+resilience+by+inhibiting+the+ventral+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus.</a> Nature. , 1(2018).</li>
<li>Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Phenotypic+Characterization+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+Multiple+Labeling+with+Antibodies+from+the+Same+Host+Species+to+Study+Adult+Hippocampal+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).</li>
<li>Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+S-Phase+Labeling+of+Dividing+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+Paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optogenetic+Stimulation+of+the+Rodent+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+Optogenetics+in+Neural+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer Optogenetics in Neural Systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+Cells+Control+Adult+Neural+Stem+Cell+Quiescence+and+Maintenance+through+a+Dynamic+Balance+between+Direct+and+Indirect+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways.</a> Neuron. , 1-18 (2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+Stereotaxic+Surgery+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+5-ethynyl-2+%E2%80%B2+-deoxyuridine+staining+as+a+sensitive+and+reliable+method+for+studying+cell+proliferation+in+the+adult+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system.</a> Brain Research. 1319, 21-32 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).</li>
<li>Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Thompson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadd+Agonist+21+%28C21%29+Is+an+Effective+Agonist+for+Muscarnic-Based+Dreadds+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacology+%26+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo.</a> ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜의 목표는 특정 신경 회로를 조작하는 것이 일련의 면역 조직 화학 기술을 사용하여 생체 내에서 성인 해마 신경 발생을 조절하는 방법을 평가하는 것입니다. 특정 신경 회로에 의해 매개된 성인 신경 발생의 활성 의존적 조절을 분석하는 것은 다양한 범위의 신경 회로를 연구하기 위한 수정가능성이 큰 귀중한 기술이다. 이러한 유형의 실험의 성공은 정확한 바이러스 전달, 원하는 조작을 위한 적절한 바이러스 선택, 티미딘 유사체의 적절한 전달, 동물 연령, 면역 염색 효율, 성공 등 여러 요인에 따라 달라집니다. 수화 관류, 그리고 이미지의 편견 정량화. 예를 들어, 부정확한 바이러스 전달은 문제의 회로와 관련이 없는 표현형을 초래하는 표적 효과를 초래할 수 있다. 추가적으로, 낮은 품질의 면역형광 기술은 현재 세포의 실제 수를 숨길 수 있고 따라서 생물학적으로 관련이 없는 표현형을 생성할 수 있다. 대조를 이하는 또 다른 매우 중요한 요소는 실험을 수행할 때 마우스의 나이이며, 성인 신경발생이연령...

성체 신경 발생은 새로운 뉴런이 성인에서 태어나 기존 신경망에통합되는 생물학적 과정입니다 1. 인간에서는, 이 프로세스는 해마의 치과 gyrus (DG)에서, 대략 1,400의새로운 세포가 매일 2 에서 태어난 곳에 생깁니다. 이 세포는 신경성 틈새 시장을 품고 있는 DG의 안쪽 부분에, 상체 지역 (SGZ)에게 불려 있습니다. 여기서, 해마 성인 신경 줄기 세포 (NSC)는 학습 및 기억, 기분 조절 및 스트레스 반응을 포함하여 특정 뇌 기능의 조절에 기여하는 완전한 기능의 뉴런이되기 위한 복잡한 발달 과정을 거칩니다3 ,4,5,6. 행동에 영향을 미치기 위하여는, 성숙한 CSCs는 현지 및 원위 화학 단서의 배열에 반응하여 활동 의존적인 방식으로 각종 외부 자극에 의해 높게 통제됩니다. 이러한 화학 단서 신경 전달 물질 및 신경 변조기 를 포함 하 고 다양 한 뇌 영역에서 회로 특정 방식으로 행동. 중요한 것은, NSC에 이러한 화학 큐의 회로 넓은 수렴은 줄기 세포 활성화, 분화 및 운명 결정의 독특하고 정확한 조절을 허용합니다.
생체 내에서 성인 NSC의 회로 조절을 심문하는 가장 효과적인 방법 중 하나는 면역 형광 분석을 회로 폭 넓은 조작과 페어링하는 것입니다. 성인 신경전의 면역 형광 분석은 일반적으로 이용되는 기술입니다, 여기서 특정 분자 마커에 대하여 항체는 성인 신경침판의 발달 단계를 표시하기 위하여 이용됩니다. 이들 마커는 다음을 포함한다: 방사형 신경교세포 및 초기 신경 전구 마커로서 네스테인, 중간 전구 마커로서 Tbr2, 및 뉴라블라스트 및 미성숙 뉴런 마커로서 dcx7. 부가적으로, BrdU, CidU, Idu 및 Edu와 같은 티미딘 유사체를 투여함으로써, S상을 겪고 있는세포 집단은 개별적으로 표지되고 가시화될 수 있다 8,9,10. 이 두 접근을 결합하여, 각종 단서가 NSC 분화 및 신경 발생에 어떻게 영향을 미치는지에, 특정 발달 단계에서 증식이 어떻게 통제되는지에 이르기까지 광범위한 질문을 조사할 수 있습니다.
전기 자극, 광유전학 및 화학 유전학을 포함하여 신경 회로를 효과적으로 조작하기 위해 여러 가지 옵션이 존재하며, 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 전기 자극은 전극이 나중에 표적으로 한 두뇌 지구를 조절하기 위하여 전기 신호를 전송하기 위하여 이용되는 특정 두뇌 지구에 이식되는 광대한 수술을 관련시킵니다. 그러나, 이 접근은 세포와 회로 특이성이 둘 다 결여합니다. 광유전학은 이식된 광섬유를 통해 방출되는 레이저에 의해 자극되는 광 활성화 수용체를 인코딩하는 바이러스 입자의 전달을 수반하지만, 광범위한 조작, 큰 비용 및 복잡한 수술이 필요하다11. 화학 유전학은 디자이너 약물 또는 DREADDs에 의해 독점적으로 활성화 된 디자이너 수용체를 인코딩하는 바이러스 입자의 전달을 포함하며, 이는 클로자핀 N-산화물 (CNO)12로 알려진 특정 및 생물학적 불활성 리간드에 의해 이후에 활성화됩니다. . DREADDs를 활용하여 성인 NSC를 조절하는 로컬 신경 회로를 조작하는 장점은 CNO 관리의 용이성과 다양한 경로에 있습니다. 이를 통해 동물 취급이 감소되어 시간이 덜 소요되는 접근 방식을 사용할 수 있으며, 이는 신경 회로를 조절하기 위한 장기 연구에 쉽게 적용 가능합니다.
이 프로토콜에 기술된 접근법은 면역형광 기술과 회로 조작을 모두 결합한 성인 해마 신경 발생의 회로 조절을 성공적으로 심문하는 데 필요한 다양한 프로토콜의 포괄적인 모음입니다. 화학 유전학을 사용하여. 다음 프로토콜에 기재된 방법은 성인 신경 발생에 대한 그들의 조절 기능을 결정하기 위해 생체 내에서 동시에 하나 또는 다중 회로를 자극하거나 억제하는 데 적합하다. 이 방법은 질문에 높은 수준의 시간적 해상도가 필요하지 않은 경우에 가장 적합합니다. 특정 주파수에서 자극 /억제의 정확한 시간적 제어를 필요로하는 질문은 광유전학13,14를사용하여 더 잘 해결할 수 있습니다. 여기에 설명된 접근법은 스트레스가 주요 관심사인 특히 최소한의 동물 취급으로 장기적인 연구에 쉽게 적용됩니다.

<table><tbody><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>48 웰 플레이트</td><td>Denville Scientific</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (Edu)</td><td>카보신스</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>알코올 70% 이소프로필</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Azide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>안티-치킨 네스틴</td><td>Aves</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>안티 염소 DCX</td><td>산타 크루즈</td><td>고양이# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Tbr2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>베타딘 용액(포비돈-요오드)</td><td>아마존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시트르산 스톡 [.1M] 구연산(21g/L 구연산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>클로자핀 N-산화물 시</td><td>그마-알드리치</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 소프트웨어(젠 블랙)</td><td>자이스 현미경 Zen</td><td>2.3 SP1 FP1(검정색)</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 펜타하이드레이트</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>AC197722500</td><td></td></tr>면 <tr><td>면봉</td><td>아마존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>덴빌 사이언티픽</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 작업 와이프 Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>드릴 비트 0.5mm</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 바늘 2 인치</td><td>Hmailton Company</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 5 &mu; L 모델 75 RN</td><td>Hmailton Company</td><td>참조: 87931</td><td></td></tr><tr><td>고속 드릴</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>주입 펌프</td><td>Harvard 장치</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>주사 가능한 식염수 산</td><td>허리 건강 관리</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD 초미세 인슐린 주사기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>헨리 Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax For Small Animal</td><td>KOPF Instruments</td><td>Model 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair (제모 제품)</td> <td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldahyde 4 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>158127</tr><tr><td>Plus Charged Slide</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 연고</td><td>Puralube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Rack 20 슬라이드 유닛</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 랙 홀더</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>작은 동물 난방 패드</td><td>K& H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 펜 4mm 팁</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>외과용 메스</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 용액(TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 트리소듐 스톡[0.1M] 시트르산 트리소듐(29.4g/L 시트르산 트리나트륨)</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>아마존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수의사 본드 조직 접착제</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

성체 신경 발생은 치과 자이러스 (DG)의 하부 영역 (SGZ)에서 새로 활성화 된 신경 줄기 세포 (NSC)가 새로운 뉴런을 생성하는 동적 과정으로, 이는 기존 신경 회로에 통합되어 특정 해마 기능에 기여합니다. . 중요한 것은, 성인 신경 발생은 환경 자극에 매우 취약, 다양 한 인지 기능의 활동에 의존 하는 규칙에 대 한 허용. 다양 한 뇌 영역에서 신경 회로의 광대 한 범위는 이러한 복잡 한 인지 기능을 조율. 따라서 특정 신경 회로가 성인 신경 발생을 조절하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 여기에서는 설치류에서 NSC와 신생아 자손을 조절하는 디자이너 약물(DREADDs) 기술에 의해 독점적으로 활성화된 디자이너 수용체를 사용하여 신경 회로 활동을 조작하는 프로토콜을 설명합니다. 이 포괄적인 프로토콜에는 바이러스 입자의 입체 주입, 특정 신경 회로의 화학 유전적 자극, 티미딘 아날로그 투여, 조직 처리, 면역 형광 라벨링, 공초점 이미징 및 이미징이 포함됩니다. 신경 전구체 세포의 다양한 단계의 분석. 이 프로토콜은 NSC와 그들의 자손을 시각화하는 데 사용되는 항원 검색 기술에 대한 자세한 지침을 제공하고 클로자핀 N-산화물 (CNO) 또는 CNO 함유 식수를 사용하여 뇌 회로를 조절하는 간단하면서도 효과적인 방법을 설명하고 공포 표현 바이러스. 이 프로토콜의 강도는 신경 세포에서 파생 된 성인 신경 발생에 영향을 미치는 신경 회로의 다양 한 범위를 연구 하는 적응성에 있다.

위에서 설명한 실험 절차에 따라 (도1A,B),우리는 해마 내의 신경성 틈새에 대한 반대 이끼 세포 프로젝션을 자극하는 효과를 결정할 수 있었다. 5-HT2A Cre-line을 표기하는 이끼 세포와 결합된 Cre 의존적 Gq 결합 자극 DREADD 바이러스를 활용하여, 우리는 이끼 세포에서 경진 DG로 의 흥분성 투영을 선택적으로 활성화할 수 있었고 강한 이끼 세포를 결정했습니다. 자극 촉진 줄기 세포 정지 (그림1C). 우리는 조직의 분석 전에 정확한 바이러스 전달을 확인하였다 (도2A,B). 추가적으로, 우리는 c-fos 면역성 화학 실험을 통해 이끼 세포의 활성화를 확인했습니다 (데이터는 도시되지 않음). 부적절한 바이러스 성 주사의 경우 동물을 추가 분석에서 제외하십시오. 부적절한 주입은 원하는 좌표를 ...

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

이 프로토콜은 뇌의 다양한 회로가 성인 신경 발생을 조절하는 방법과 특히 신경 회로를 자극하거나 억제하는 것이 성인 신경 줄기 세포의 증식에 미치는 영향에 대해 대답 할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 원하는 신경 회로를 구체적으로 표적으로 삼을 수 있을 뿐만 아니라 동물에게 유입되는 응력의 양을 줄일 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 뇌 회로가 성인 신경 발생을 조절하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, 특히, 특정 신경 전달 물질을 해제 하는 특정 세포 유형 성인 신경 줄기 세포 증식을 조절 하는 방법.이 절차를 시작하려면, PBS에 조직 섹션을 배치하고 전방에서 후방에 직렬 순서로 양전하 슬라이드에 5 ~ 8 개의 섹션을 마운트. 티슈 섹션이 실온에서 2~5분 동안 건조하고 슬라이드를 완전히 부착하십시오. 그런 다음 컨테이너에서 타일산 버퍼를 준비합니다.용액이 끓을 때까지 5 분간 전자 레인지에 구연산 버퍼를 가열합니다. 한편, 장착 된 섹션을 유리 슬라이드 홀더에 놓습니다. 5분 후, 슬라이드 홀더에 섹션이 있는 파이펫 상자에 조심스럽게 넣습니다.전자 레인지 전원을 50 %로 설정하고 요리 시간을 7 분으로 설정합니다. 타이머를 7분 동안 시작하고 솔루션을 모니터링합니다. 용액이 끓기 시작하면 전자 레인지를 멈추고 끓인 후에도 전자 레인지를 계속하십시오.전자레인지의 조리 시간이 끝나지 않아도 타이머가 다 떨어지면 멈춥시다. 이 단계의 목표는 물을 지나치게 끓이지 않고 물을 끓는 온도 바로 아래에 유지하는 것입니다. 너무 많은 끓는 슬라이드에서 조직 섹션을 제거합니다.그런 다음, 식염수 버퍼와 티슈 슬라이드와 함께 따뜻한 상자를 얼음 양동이로 옮겨 냉각시냉각시다. 상자를 덮고 약 30 분 동안 또는 용액이 터치에 식힐 때까지 기다렸다가 티미딘 아날로그 염색을 진행하십시오. 티미딘 아날로그로 조직 섹션을 염색하려면 구연산 완충에서 조직 섹션을 제거하십시오.소수성 펜으로 테두리를 그리기 전에 조직 섹션이 건조하고 슬라이드를 완전히 부착하십시오. 다음으로, 20~30분 동안 투과화 버퍼로 섹션을 충마화합니다. TBS 트리톤을 사용하여 매번 5분간 섹션을 두 번 세척합니다.그런 다음 Edu 반응 솔루션을 준비합니다. 에듀 반응 용액의 섹션을 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, TBS 트리톤에서 매번 5분간 세 번 씻는다.슬라이드를 알루미늄 호일로 덮거나 빛으로 보호되는 챔버에 배치하여 이

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

신경 줄기 세포는 성인이 아닌 최대 절전 모드 예알링 북극 그라운드 다람쥐 (AGS)의 해마에서 준비되었다. 이러한 신경 줄기 세포는 여러 통로를 통해 확장 차별과 glial 문화에 거의 신경 50:50로 유지하실 수 있습니다.

성인 Hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화

이 동영상은 EdU incorpion을 사용하여 뇌 조직 절편에서 새로 증식한 신경 줄기 세포를 염색한 다음 면역 형광을 통해 특정 단백질을 시각화하여 세포 역학 및 증식에 대한 이해를 높이는 절차를 보여줍니다.

마우스 뇌 절편에서 증식된 신경 줄기세포를 시각화하기 위한 면역형광 염색

성체 해마 신경 발생 동안, 정지된 신경 줄기 세포가 순차적으로 진행하고 회로에서 기능적으로 통합된 뉴런으로 발달할 때 뚜렷한 유전적 마커 세트가 발현됩니다. 열 유도 항원 회수를 사용하면 다른 방법으로는 검출하기 어려운 전구 세포 유형을 향상된 효과로 식별할 수 있습니다.

열 유도 항원 검색: 성체 해마 신경 발생 중 전구 세포 유형을 감지하고 식별하는 효과적인 방법

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

우리는 성체 쥐 뇌의 뇌실하부(SVZ)에서 신경줄기세포(NSC)와 그 자손을 분리하기 위한 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorting) 기반 방법을 보고합니다. FUCCI(Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) 형질전환 마우스에 적용되어 라이브 이미징을 통한 세포 주기 진행을 연구할 수 있습니다.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

송곳니 뇌는 성인 신경 연구에 귀중한 모델입니다. 분리 및 기본 뇌 조직에서 성인 개 해마 신경 전구 세포 확장을위한 프로토콜은 여기에 표시됩니다.

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

크릴로 단부-해부는 깊은 정량적 프로테오메 분석을 위해 뮤린 뇌에서 가장 큰 신경 성 틈새 시장을 신선하고 냉동 준비 할 수 있습니다. 이 방법은 정확하고 효율적이며 최소한의 조직 혼란을 일으킵니다. 따라서, 그것은 이상적으로이 틈새 시장, 뿐만 아니라 다른 장기, 지역 및 종의 분자 미세 환경을 공부에 적합.

정확하고 심도 있는 정량적 프로테아메 분석을 위한 성인 Subependymal 영역의 극저온 단면 해부

여기에 제시된 것은 형광 활성화 핵 (FAN) 분류를 통해 대부분의 뉴런을 배제하는 마우스 치아 이랑에서 분리 된 단일 핵을 서열화하는 방법입니다. 이 접근법은 고품질 발현 프로필을 생성하고 신경 줄기 세포와 같은 희소 한 집단을 포함하여 틈새 시장에서 대표되는 대부분의 다른 세포 유형에 대한 연구를 용이하게합니다.

해마 신경인성 틈새를 연구하기 위해 단일 핵 RNA 시퀀싱과 결합된 뉴런의 형광 활성화 핵 음성 분류

여기에서는 화학적으로 재프로그래밍된 줄기세포를 엔지니어링하여 이러한 세포를 도파민성 전구세포로 분화하고, 파킨슨병의 마우스 모델에 이식하고, 이식된 세포의 성공적인 통합 및 기능적 효과를 확인하기 위해 행동 및 전기생리학적 결과를 평가함으로써 정확한 신경 조절을 달성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경퇴행성 질환 치료에서 재프로그래밍된 줄기세포 유래 전구세포의 화학유전학적 조절

학습하세요 성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 방법을 통해 신경회로 자극이 성인 신경발생에 미치는 영향을 분석하는 기법입니다. 이 프로토콜은 정밀한 회로 조작과 동물 스트레스 감소를 통해 신경줄기세포 증식을 평가합니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

더 많은 동영상 탐색