Name: 인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 배우세요 CRISPR-dCas9-DNMT3A를 활용한 표적 DNA 에피게놈 편집을 위한 올인원 렌티바이러스 벡터 생산 및 정화 방법을. 이 기술은 인간 유도 만능 줄기세포 유래 신경세포에서 유전자 발현을 미세 조정하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 칸 Neurotechnology 개발 상 (O.C.)을 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 일부 자금 O.C. (R01 NS085011).

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<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
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<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li>
<li>Holtzman, L., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+the+Epigenome%3A+Reshaping+the+Genomic+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+tunable+human+gene+activation+by+combinations+of+synthetic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
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<li>McDonald, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammable+CRISPR%2FCas9-based+system+for+inducing+site-specific+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation.</a> Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).</li>
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<li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+SNCA+Expression+by+Targeted+Editing+of+DNA+Methylation%3A+A+Potential+Strategy+for+Precision+Therapy+in+PD%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD.</a> Molecular Therapy. , (2018).</li>
<li>Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+regulates+alpha-synuclein+expression+and+is+decreased+in+Parkinson%27s+disease+patients%27+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+methyltransferase+inhibitor%2C+5-aza-2%27-deoxycytidine%2C+exacerbates+neurotoxicity+and+upregulates+Parkinson%27s+disease-related+genes+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).</li>
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<li>Desplats, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+sequesters+Dnmt1+from+the+nucleus%3A+a+novel+mechanism+for+epigenetic+alterations+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).</li>
<li>Ai, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomethylation+of+SNCA+in+blood+of+patients+with+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease.</a> Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).</li>
<li>Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+SNCA+gene+expression%3A+implications+to+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies.</a> Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).</li>
<li>Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+alpha-synuclein+3%27+untranslated+region+and+its+corresponding+microRNAs+in+relation+to+Parkinson%27s+disease+compared+to+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies.</a> Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+the+SNCA+locus+exacerbates+neuronal+nuclear+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging.</a> Human Molecular Genetics. , (2018).</li>
<li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+involving+CNS+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical applications involving CNS gene transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li>
<li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).</li>
<li>Vijayraghavan, S., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Production+of+Integrase-deficient+Lentiviral+Vectors+for+CRISPR%2FCas9-mediated+Gene+Knockout+in+Dividing+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56915(2017).</li>
<li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li>
<li>Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bisulfite pyrosequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).</li>
<li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9.</a> Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li>
<li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li>
<li>Goffin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+in+the+pol+gene+intragenic+regulatory+region+of+HIV-1+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted%2C+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).</li>
</ol>

듀크 대학이이 연구에 관련 된 임시 특허 출원을 제기 했다.

LVs 유전 질병의 맥락에서 특히 epigenome 편집을 위한 선택의 차량으로 등장 하기 시작 했습니다, (i) 수용 하기 위해 그들의 능력 때문에 주로 큰 DNA 페이로드 및 (ii) 효율적으로 transduce 다양 한 분할 및 nondividing 셀. 정 맥 주사의 큰 포장 효능은 특히 대형은 CRISPR/dCas9 시스템의 포장을 포함 하는 응용 프로그램에 대 한 유용 합니다. 이 관점에서 정 맥 주사 모두 한 CRISPR/Cas9 시스템의 배달에 대 한 선택의 플랫폼을 나타냅니다. 실제로, 일반적으로 전 임상 및 임상 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 고용, AAV 플랫폼, 완전히 dCas9 이펙터 시스템의 큰 포장 크기에 맞게 수는 없습니다. 사실, AAV 벡터의 엄격한 포장 요구 사항 CRISPR/dCas9 부품의 납품에 대 한 그들의 사용을 금지 됩니다. AAV 포장 기능을 개선 하기 위해, 여러 가지 새로운 AAV 기반 플랫폼 개발 되었습니다. 예를 들어 두 AAV 카세트로 시스템 최근 되었습니다 Cas9를...

여러 epigenome 편집 플랫폼 최근 유전자 식1,2를 제어 하는 지역에서 어떤 DNA 시퀀스를 대상으로 개발 되었습니다. 만든된 epigenome 편집 도구는 (i) 전사 조절, (ii) 변경 posttranslational 히스톤 수정, (iii) 수정 DNA 메 틸 화, (iv) 규제 요소 상호 작용을 조절 하는 설계 되었습니다. 비활성화 (죽은) Cas9에 전사/chromatin 한정자를 접근 (dCas9) 발생 이전에서 아연 등 개발된 epigenome 편집 플랫폼, 단백질 (ZFPs) 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 (이야기), 손가락 은닉 강력한 transcriptional 이펙터 도메인 (ED) 디자인 DNA 바인딩 도메인 (DBD)3융합. 활성화 또는 억제 등 원하는 표현 형의 결과 생 loci (그림 1)에 고정 효과 기 분자에 의해 정의 됩니다. 프로그래밍 가능한 transcriptional 활성 제를 만들려면 dCas9/gRNA 모듈은 VP164,,56 (그림 1A), 폴 II 및 일반 전사 기계 신병 바이러스 활성화 도메인에 연결 됩니다. 이 시스템의 수정 VP64, VP16 도메인의 tetramer 제공 하는 더욱 강력한 활성화 속도5,6을 포함 했다. 시스템은 발기인 및 규정 요소를 대상으로 코딩 noncoding 지역 활성화를 성공적으로 고용 되었다. 중요 한 것은, VP64 분자 대상 지역에 염색 질 구조를 직접 수정 하지 않습니다, 비록 그것은 chromatin 한정자 액티브 (euchromatin) 마크, H3/H4 acetylation와 H3-K4 디 등의 증 착에 결과 묶는 신병 / 트라이-메 틸 화5,6. VP64, 뿐만 아니라 인간의 NF κB 복잡 한 p65 소 단위 dCas9/gRNA 모듈7에 닿는 되었습니다. 흥미롭게도, 상류 녹음 방송 시작 위치 (TSSs)과 발기인 내의 지역에 이러한 이펙터의 tethering 강한 유전자 유도 결과. 그럼에도 불구 하 고, VP64 및 p65 이펙터 있으며 하류 TSSs의 원심 강화7,8시 지역에 연결 되는 동안 activatory 효과 발휘 또한 수 있습니다. 더 강력한 transcriptional 응답을 유도, 여러 dCas9 VP64 또는 dCas9-p65 융해 단일 대상 로커 스9,10에 채용 될 필요가 있다. 따라서, 다음-세대 활성 제, 노, 등 단일 dCas9 gRNA 복잡 한에 의해 여러 이펙터 도메인 모집의 최근 개발 귀착되는 강한 활성화 기능 비교 dCas9 VP64 융합 대응11 , 12. 향상 된 transcriptional 활성화 VP64, p65, 및 Rta (VPR), 감마-herpesviruses에서 dCas913 (그림 1A)의 C-말단의 transactivation 도메인의 융합을 통해 얻은 되었습니다. 유사한 CRISPR/dCas9 시스템 대상별 억압 (그림 1B)에 대 한 개발 되었습니다.
내 생 유전자 억압 메커니즘 (그림 1B)의 다양 한 설계 진압 융해와 함께 얻을 수 있습니다. CRISPR/dCas9 시스템, (effector 도메인/s), 없이 진압 DBD에 연결 된 유전자 발현 발기인 또는 업스트림/다운스트림-TSS 지역3,6 에 곁에 하는 동안 침묵 효율적으로 수 있습니다 입증 되었습니다. 14. 녹음 방송에 영향 전사 인자 바인딩 및 RNA 중 합 효소 처리의 입체 장애에 의해 발생 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 보다 포괄적인 접근 필요, 입체 방해 혼자 여 진 억압은 종종 강력한 입을 위한 충분 합니다. CRISPR/dCas9 시스템 transcriptional 진압 도메인 (TRDs), 히스톤 한정자를 기반으로 하는 달 았 죠의 다음 세대의 최근 개발 (H3-K9 디-/ 트라이-메 틸 화, H3 K27 디-/ 트라이-메 틸 화; H3-K36 디-/ 트라이-메 틸 화, H3/H4 deacetylation), 그리고 DNA (CpG) 메 틸 보다 강력한 효과4,5,,1516, 입을 수 있도록 하는 후 성적인 도구 건설에 17,18,,1920. 그것은 DNA에 이러한 epigenetic 한정자의 모집 일반적으로는 더 강력한 입을 결과21,22를 생성 하는 더 많은 폐쇄 하 고 압축 된 chromatin의 형성으로 이어질 수 있습니다 입증 되었습니다. DBDs와 함께 사용 하는 가장 일반적으로 입을 도메인 Krüppel 관련 상자 (리아)4,5입니다. 요인의 모집 chromatin 변경; 해당 입증 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 개조의 메커니즘은 아직 해명된16,,1718수 있습니다. 최근에, 그것은 보였다 DNA에 리아의 지역화가 이러한 상호 작용 중재의 형성 가능성을 제안 하는 히스톤 methyltransferase SETDB1 및 히스톤 deacetylation (HDAC) NuRD 단지의 어셈블리를 홍보할 수 있습니다. chromatin 응축 그리고 transcriptional 입을3,13. 다른 접근 방법으로 이펙터 도메인 사용자 지정 후 입을 단백질을 만드는 DBDs에 융합 수 있습니다. 이 시스템은 직접 억압 적인 DNA 부호 또는 히스톤 수정 catalyzes.
최근, 곁에 DNMT3A 효소 합성 CRISPR/dCas9 시스템의 사용 transcriptional 비활성화 용도가 변경 했습니다. DNMT3A catalyzes DNA 메 틸 화 내 생 유전자 발기인 및 다른 규제 영역 (그림 1B)18,20에 섬으로의 형성을 통해 transcriptional 억제 한다. 맥도날드 외.18 Vojta 외20 했다 보고 epigenome 유전자 침묵 또는 억압, 플라스 미드 배달 dCas9-DNMT3A 퓨전 시스템 향상 potently 수 보여주는 DNA 메 틸 화를 사용할 수 있는 첫 번째 저자 TSS18,20주위 시 토 신 메 틸 화. 맥도날드와 동료 증명 고용 전략의 중요 한 감소 (약 40%)에서 발생할 수 있습니다. 종양 억제기 유전자에서 CDKN2A mRNA 레벨18. 마찬가지로, 바흐 또는 IL6ST 유전자의 unmethylated 발기인 지역 타겟팅 증가 CpG 메 틸을 유전자 식20두 감소와 상관 관계를 보여줍니다. 우리 연구소는 최근 약하게 SNCA overexpression (그림 2)23의 병 적인 결과 대 한 DNA 메 틸 화를 사용 하 여 다른 용도로. SNCA intron 1 지역 내에서 DNA 메 틸 화에 선택적 향상 전략 기반으로 그것은 이전 PD와 치 매 Lewy 몸 (DLB) 두뇌24,25, hypomethylated 이기 위하여 보고 되었다 26. 이 hypomethylation SNCA overexpression, 따라서 제공 하는 치료 적 개입24,,2728에 대 한 매력적인 대상에 연결 되었습니다. 우리가 최근에 보여주었다 DNA 메 틸 화의 저수준 SNCA intron 1에서에서 hiPSC 파생 dopaminergic NPCs에 지역 SNCA triplication23PD 환자에서 얻은. 이 실험적인 모델의 장점은 NPCs 튼튼하게 문화에서 전파 하 또는 더 성숙한 뉴런으로 분화 세포 고기, 산화 등을 중재 하는 유전 요인 식별 하는 효율적인 심사를 사용 수 있다 스트레스와 apoptosis29. 또한,이 모델 시스템 환자에서 증상 발병 전에 발생 하는 개발 이벤트를 정리 하는 과학자를 수 있습니다. 또한, hiPSC에서 파생 된 NPCs 유전자 발현과 관련 된 세포 및 분자 경로 테스트 하는 훌륭한 도구를 나타냅니다. 중요 한 것은, 최신의 CRISPR/Cas9-epigenome 기술과 결합 하는 hiPSC 파생 NPCs 많은 신경 퇴행 성 질환에 대 한 "다음-세대 약물" 개발 용이 하 게 크게 수 있습니다.
SNCA 식의 병 적인 수준을 줄이기 위해, 우리는 최근 dCas9 DNMT3A 융해 단백질과 특별히 대상 CpG 메 틸 화 SNCA intron 1 (그림 2A) 내에 gRNA lentivirus 기반 시스템을 개발23. 이 프로토콜은 lentiviral 벡터 (LV) 설계 및 생산 세부 사항에 설명 합니다. LVs 나타내는 여러 가지 이유로 CRISPR/dCas9 구성 요소를 제공 하는 효과적인 수단, 즉 (i) 자신의 능력을 부피가 큰 DNA를 수행 삽입, (ii)30 셀을 나누어 및 nondividing를 포함 하 여 셀의 광범위 한 범위를 시험의 고효율 , 그리고 (iii) 최소한의 세포 독성 및 면역성 응답을 유도 하는 능력. 최근, 우리 SNCA 로커 스의 triplication 가진 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 LV 시스템을 적용 하 고 epigenome 편집의 배달에 대 한 정 맥 주사의 치료 잠재력을 시연 메 틸 화23 ( 도구 그림 2B). 실제로, LV-gRNA/dCas9-DNMT3A 시스템 SNCA intron 1 지역에서 DNA 메 틸 화에 상당한 증가 발생합니다. 이 증가 SNCA mRNA와 단백질23의 수준에 있는 감소와 일치합니다. 또한, SNCA downregulation PD 관련 고기 SNCA triplication/hiPSC-파생 dopaminergic 신경 (예, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존)23에 구출. 중요 한 것은, 우리 SNCA 식 LV-gRNA-dCas9-DMNT3A 시스템에서에서 감소는 고기는 누가 실시는 PD 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 대 한 특성이 있다 반전의 능력을 증명 SNCA triplication, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존23등. 이 프로토콜의 목표 이며 1) 생산의 프로토콜와 높은 tittered 바이러스 준비를 생성 하기 위한 최적화 된 LV 플랫폼의 농도 2) 성숙한 dopaminergic 될 꽃무늬 NPCs에 hiPSCs의 차별화를 설명 하기 위해 신경31,32 그리고 SNCA intron 1에서 대상 영역의 메 틸 화 수준의 특성화.
Lentiviral 플랫폼 주요 이점을 가장 인기 있는 벡터 플랫폼, 즉 adeno 관련 벡터 (AAVs), 큰 유전자 삽입33,34에 맞게 전 능력은 있다. AAVs 상당히 높은 수익률에 생성 될 수 있습니다 하지만 낮은 포장 용량을 보유 (< 4.8 kb), 모든-에-하나의 CRISPR/Cas9 시스템을 제공 하기 위한 그들의 사용을 타협. 따라서, 그것은 정 맥 주사의 플랫폼 제공된 CRISPR/dCas9 도구를 응용 프로그램에서 선택 될 것 이라고 보인다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 효과적으로 세포와 장기에 epigenome 편집 구성 요소를 제공 하는 연구를 위한 유용한 도구가 됩니다. 프로토콜 추가 벡터 식 카세트30,35내 요소의 cis에 수정 통해 벡터의 생산 및 표현 기능을 증가 하기 위하여 전략을 설명 합니다. 전략을 기반으로 소설에 시스템 개발 및 연구소에서 공부 하 고 1010 바이러스 성 단위 (VU) /mL30,35의 범위에서 바이러스 성 입자를 생산 하는 능력을 강조.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; M 필터 장치, 1L</td><td>Corning</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&mu; m 필터 장치, 500 mL</td><td>Corning</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC 처리 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 원심분리 튜브</td>, <td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>150 mm TC 처리 세포 배양 접시, 20 mm 그리드</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td>, <td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>StemCell Technologies</td><td>34811</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R 탁상용 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 바닥 초원심분리 튜브</td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 어댑터</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td><td>Eppendorf</td><td>30742060</td><td></td></tr><tr><td>High-binding 96-well plates</td><td>Corning</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>가역 여과기</td><td>StemCell Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; 일회용 혈청학 피펫, 유리, 비발열성</td><td>VWR</td><td>93000-694</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; 진공 여과 시스템</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>xMark&trade; 마이크로플레이트 흡광도 플레이트 리더</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cell culture reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>접착 방지 헹굼 용액</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab60721</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab18102</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제 용액, 100x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(50개), 비타민 A 뺀</td> 값 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>소 알부민 분획 V(7.5% 용액)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>StemCell Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>Corning</td><td>08-774-552</td><td></td></tr><tr><td>우주 송아지 혈청</td><td>하이클론</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>12-719</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고혈당 매체</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect PCR Control DNA Set</td><td>Qiagen</td><td>596945</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 메틸화 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>StemCell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 bFGF</td><td>줄기세포 기술</td><td>78003</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합&nbsp; EGF</td><td>StemCell Technologies</td><td>78006</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Shh (C24II)</td><td>StemCell Technologies</td><td>78065</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>StemCell Technologies</td><td>72232</td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td> <td>나트륨시그마 알드리치</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff&nbsp; 신경 유도 매체</td><td>StemCell Technologies</td><td>5835</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 신경 전구체 동결 매체</td><td>StemCell Technologies</td><td>5838</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay FOXA2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00232764</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999905</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay Nestin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs04187831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 어세이 OCT4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs04260367</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 어세이 PPIA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>p24 ELISA 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-p24 항체</td><td>NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 토끼 양 고추 냉이 과산화 효소 IgG Sigma</td><td>Aldrich</td><td>12-348</td><td>작업집중 1:1500</td></tr><tr><td>염소 혈청, 멸균, 10mL</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>작업 농도 1:1000</td></tr><tr><td>HIV-1 표준</td><td>NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>일반 마우스 혈청, 멸균, 500mL</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>폴리클론 토끼 항24 항체</td><td>NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>TMB 퍼 옥시 다제 기판</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>작동 농도 1 : 10,000</td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Restriction enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

인간으로 epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

HiPSC에서 파생 된 세포를 사용 하 여 인간의 신경 퇴행 성 질환을 연구 하는 귀중 한 접근 방식을 나타냅니다. 여기, 우리는 환자와 파 킨 슨 병 (PD)으로 알파 synuclein 유전자 (SNCA) 로커 스의 triplication에서에서 파생 된 hiPSCs의 분화에 대 한 최적화 된 프로토콜을 설명-관련 dopaminergic 신경 인구. 증거를 축적으로 나타났습니다 SNCA 의 상부는 충족 SNCA 표현의 규제 대상으로 하는 특히 그 PD를 위한 소설 치료 접근을 설치할 필요가 PD. Recognizing의 개발에 대 한 원인이 되는 우리 최근 epigenetically SNCA intron 1 규제 지역에서 메 틸 화 수준의 풍요로운 여 SNCA 전사를 조절 하는 CRISPR/dCas9-DNA 메 틸 화-기반 시스템 개발. 죽은의 구성 된 시스템을 제공 (비활성화) 버전 Cas9의 DNA methyltransferase 효소 3A의 촉매 도메인 (dCas9) 융합 (DNMT3A), lentiviral 벡터 사용 됩니다. 이 시스템 SNCA 로커 스의 triplication와 셀에 적용 되 고 SNCAmRNA와 단백질 수준 SNCA intron 1의 타겟된 DNA 메 틸 화를 통해 약 30% 감소 시킨다. SNCA 레벨의 미세 downregulation 질환 관련 세포 고기를 구출 하 고 현재 프로토콜에서 우리 hiPSCs 신경 조상 세포 (Npc)와 설립 SNCA 에서 메 틸 프로필의 평가 대 한 pyrosequencing 분석 실험의 유효성 검사로 차별화에 대 한 단계별 절차를 설명 하고자 intron 1. 좀 더 자세하게에서이 실험에서 사용 된 lentivirus-CRISPR/dCas9 시스템 개요,이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, lentiviral 벡터를 집중 하 고 epigenome 게놈 편집 응용 프로그램을 사용 하 여 그들의 적합성을 강조 하는 방법을 hiPSCs 및 Npc입니다. 프로토콜은 쉽게 적응 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 높은 titer lentiviruses를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다.

순진한 GFP 대응에 비해 LV-dCas9-DNMT3A-GFP/순수 하지 않아 벡터의 생산 titers의 유효성 검사
우리 p24개 그 ELISA 순진한 GFP/순수 하지 않아 대조 물과 LV-dCas9-DNMT3A-GFP/순수 하지 않아의 물리적 titers 사이 비교를 수행 합니다. 그림 5A에 대표 결과 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 된 벡터의 실제 수익률 비교는 보여줍니다. 이 최적화 된 생산 프로토콜 함께 최적화 된 벡터 등뼈의 유틸리티 CRISPR/dCas9 벡터의 높은 수율 titer에서 결과 나왔다. 바이러스 성 입자로 dCas9 DNMT3A transgene의 포장의 효율성을 평가 하기 위해 우리는 HEK 293T 세포 (<stron...

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Lentiviral 벡터 플랫폼은 가장 인기있는 벡터 플랫폼에 비해 주요 이점이 있으며, 특히 더 큰 유전 삽입을 수용 할 수있는 렌티 바이러스 벡터의 능력 때문입니다. 따라서, 렌티바이러스 벡터는 CRISPR/Cas 도구의 납품을 포함하는 응용 프로그램에서 선택의 플랫폼이 될 것으로 보인다. 이 기술은 손상될 때 질병과 연관되는 알파-시뉴클레인 발현의 자연적인 조절 메커니즘을 모방합니다.그것은 유전자 발현에 있는 강력한 변화 대 발현 수준의 미세 조정을 허용합니다. 나는 강력하게 스크리닝을 위해 여러 가이드 RNA를 사용하여이 또는 유사한 접근 방식을 검증하는 것이 좋습니다. 가이드 RNA 효능에는 큰 변동성이 있습니다.그것을 결정하는 유일한 방법은 강력하고 포괄적 인 검사 및 검증이 있습니다. 개발된 시스템은 설치류 및 비인간 영장류를 포함한 동물 모델과 같은 다른 모델 시스템에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이러한 후속 실험은 미래의 임상 연구를 위한 개념의 증거로 작용할 수 있었습니다.절차를 시연하는 것은 이 프로젝트와 관련된 렌티바이러스 벡터 플라스미드를 만들기 위한 분자 복제 절차의 실행에 초점을 맞추고, 내 실험실의 선임 직원 인 Ekaterina Ilich 박사가 될 것입니다. 그녀는 또한 렌티바이러스 벡터 생산과 관련된 주요 단계를 시연할 것입니다. 또한 절차를 시연하는 것은 병리학적 관련 세포로 인간 iPS 세포의 분화에 초점을 맞춘 내 실험실에서 포스트 닥인 Lidia Tagliafierro 박사가 될 것입니다.그녀는 synuclein intron1의 메틸화 프로파일을 평가하기 위해 에세이 의 설립에 중요한 단계를 시연 할 것입니다. Ahila Sriskanda, 인간 iPS 세포 유래 신경 전구 세포의 문화에 초점을 맞춘 내 실험실에 있는 직원. 먼저 벡터의 DNMT3A 부분을 증폭하여 D-Cas9-DNMT3A-GFP로부터 DNMT3A 촉매 도메인을 개발한다.BamH1 제한 효소를 사용하여 DNMT3A 단편을 소화한 후. D-Cas9를 운반하는 수정된 PBK-301 벡터의 BamH1 부위로 클로트하고 직접 Sanger 시퀀싱에 의해 검증되며, 순수한 마이센 기자 유전자와 그 결과 플라스미드를 GFP 다이제스트 d-Cas9-DNMT3A-P2A 순수 마이센및 플라스미드FSC 1로 대체한다. 겔 정화 방법을 사용하여 벡터 조각을 정화합니다.FSC-1로 PBK-201을 소화하여 인서트를 준비합니다.

lentiviral-vector-platform-for-efficient-delivery-epigenome-editing

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

출처: Tagliafierro, L., et al. 후성유전체 편집 도구를 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델에 효율적으로 전달하기 위한 렌티바이러스 벡터 플랫폼. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 파킨슨병의 핵심 단백질인 알파-시누클레인의 표적 후생유전학적 변형을 위한 신경 전구 세포(NPC)의 렌티바이러스 형질도입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 메틸트랜스퍼라제 매개 DNA 메틸화를 가능하게 하여 유전자 조절 및 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위해 SNCA 발현을 감소시킵니다.

알파-시누클레인 발현의 후생유전학적 조절을 위한 신경 전구 세포의 렌티바이러스 형질도입

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

세이프 하버 AAVS1 유전자 자리에서 TALEN 매개 유전자 편집을 통해 인간 iPSC에서 고효율 전이유전자 추가가 가능합니다. 이 프로토콜은 TALEN 및 donor vector 전달을 위해 iPSC를 준비하고, iPSC를 transfection하고, iPSC 클론을 선택 및 분리하여 GFP 유전자의 표적 통합을 달성하여 리포터 라인을 생성하는 절차를 설명합니다.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

배우세요 CRISPR-dCas9-DNMT3A를 활용한 표적 DNA 에피게놈 편집을 위한 올인원 렌티바이러스 벡터 생산 및 정화 방법을. 이 기술은 인간 유도 만능 줄기세포 유래 신경세포에서 유전자 발현을 미세 조정하는 데 활용됩니다.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

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