Name: 꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans에서 수영 유도 마비(SWIP)를 이용한 도파민 신호 평가 방법을. 이 기법은 도파민 시냅스 관련 유전자를 신속하게 식별하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

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저자 박사 오사마 Refai SWIP의 자동 분석 지침에 대 한 박사 랜디 Blakely의 연구소에서 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 LC NIH R01 DA042156에서 자금에 의해 지원 되었다.

1입니다. 솔루션 및 미디어 준비
<ol><li>KH2포4 3.0 g (22.05 m m), 나2HPO4 6.0 g (42.2 m m), 용 해 하 여 M9 버퍼를 준비 하 고 압력가 이온 물 1 L에 NaCl 5.0 g (85.5 m m). 압력가 마로 소독 후 1m MgSO4 (12 g 100 mL 압력가 이온된 수의 최종 볼륨에서)의 1.0 mL를 추가 합니다. 결과 10 x의 믹스 100 mL 압력가 마로 소독의 900 mL와 M9 저온 1 x 솔루션.</li>
	<li>계란 버퍼 수 있도록, HEPES 압력가 이온 물 1 L에의 6.896 g의 NaCl (118 m m), KCl (48 m m), CaCl2-2 H2O (2 mM), MgCl2-6 H2O (2 mM)의 0.406 g의 0.294 g의 3.578 g과 5.958 g (25 mM)를 분해. PH를 7.3 NaOH를 사용 하 여 조정 합니다.</li>
	<li>이온된 수의 3.8 mL에 5-6% 염소 (표 백제)의 1 mL 및 10 N NaOH의 180 µ L을 추가 하 여 신선한 염소/NaOH 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>그리고 60 g 자당 무게 60% 자당 해결책을 100 mL의 최종 볼륨을 압력가 이온된 물에 용 해.</li>
	<li>0.684 g 200 m m 자당을 압력가 이온된 수 10 mL에 자당의 분해. 확인 하 고는 osmolarity osmometer를 사용 하 여 동일한 조정. Microcentrifuge 튜브 1.5 mL에 1 mL aliquots을 확인 하 고-20 ° c.에 동결</li>
	<li>100 m m 재고 솔루션을 만들고 이온된 물 10 mL에 용 해 및 0.184 g AMPH (분자량 184.75 g/mol)의 무게. 0.5 m m 작업 솔루션을 물 400 µ L에서 재고 솔루션의 믹스 2 µ L.</li>
	<li>
영양 성장 미디어 (NGM) 접시를 준비
	<ol>
<li>믹스 NaCl의 3 세대 (52.65 m m), 펩, 25 g bacto agar의 및 2 L 삼각 플라스 크에 이온된 수의 975 mL의 20 g. 액체 주기를 사용 하 여 1 시간 동안 자기 저 어 바와 오토 클레이 브 (121 ° C, 15 PSI)를 포함 합니다.</li>
		<li>냉각 하 고 감동 하는 동안 히터에 플라스 크를 배치 하 여 약 50 ° C에서 온도 유지 합니다. 추가 (5 mg/mL에 에탄올), 콜레스테롤의 0.5 mL 1 M MgSO4, 1 mL의 1 M CaCl2 와 25 mL의 1 M 칼륨 인산 염 버퍼, pH 7.4 (KH2포4108.3 g, K2HPO4 의 35.6 g의 1 mL 저온 1 l).</li>
		<li>100 m m x 15 mm 페 트리 접시에 25 mL를 플라스틱 하 고 강화 하기 위해 미디어를 허용 합니다. 최대 4 주에 대 한 상자에 4 ° C에서 거꾸로 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysogeny (파운드) 국물 국물의 준비
	<ol>
<li>5 g 파운드 가루 믹스 200 mL를 삼각 플라스 크에 이온을 제거 된 물에서 용 해. 액체 살 균을 이용 하 여 30 분 동안 고압 주기. 진정 국물을 허용 합니다. 1-2 주 동안 실내 온도에 상점.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA22 세균성 접시의 준비
	<ol>
<li>살 균 피 펫 팁 또는 살 균 세균 루프를 사용 하 여 글리세롤 재고에서 NA22 대장균 박테리아의 작은 볼륨으로 파운드 플레이트를 행진 하 고 품 어 접시 거꾸로 37 ° C 배양 기에서 밤새 고립 된 식민지를 성장 하는 것을. 선택 및 준비 단계 1.8에서에서 파운드 국물의 200 mL에 단일 식민지를 소개 하 고 떨고 플랫폼에서 37 ° C에서 하룻밤 성장 하자.</li>
		<li>씨앗 판, 200 µ L 세균성 문화 단계 1.7에서에서 준비 하 고 메 마른 유리 하 키 막대기로 확산 NGM 접시에의 분배. 플레이트 후드 아래에서 하룻밤 이상 말리 고 4 ° c.에 밀폐 상자에 거꾸로 저장 하자</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레를 데리 러 속눈썹/백 금 도구를 접착제 파스퇴르 슈퍼 접착제를 사용 하 여 플라스틱 유리에 두꺼운 속눈썹 또는 백 금 필 라 멘 트. 면도날을 사용 하 여 각도에 속눈썹의 끝을 잘라. 또는 백 금 필 라 멘 트 주위 유리 피 펫의 끝을 녹기 분 젠 버너를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 선 충 C. 축산
참고: 야생-타입 N2C. 선 충 문화 대장균 NA22 격판덮개에 긴장. 세부 문화 방법 아래 설명 되어 있습니다.
<ol><li>
벌레 문화의 준비
	<ol>
<li>벌레의 스타터 문화, 잘 먹이 동물을 포함 하는 접시에서 agar의 작은 조각을 잘라와 1.9 메 마른 주걱을 사용 하 여 단계에서 준비 NA22 대장균 박테리아 접시에 그것을 전송. 3-4 일 동안 20 ° C에서 접시를 품 어. 스테레오 현미경 시각 벗 성인의 존재를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
벌레의 동기화 된 인구의 준비
	<ol>
<li>물 총 병을 사용 하 여 접시 주위 압력가 이온된 수를 분배 하 여 최소 2 접시에서 벗 성인을 수집 합니다. 부드럽게 소용돌이 벌레를 꺼내 려 하 고 일회용 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 15 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 벌레를 수집 판을 친다.</li>
		<li>작은 벌레, 다음 진공 펌프를 사용 하 여 표면에 뜨는 발음 2 분 140 x g 에서 원심 분리기에 튜브 아래로 회전 시키십시오 또는 실험실 진공 내장.</li>
		<li>Resuspend 및 세척 압력가 이온된 수와 믹스 2 분에 대 한 140 x g 에서 원심 분리기와 튜브를 작성 하 여 벌레는 상쾌한 발음 하 고이 마지막 반복 단계 2 번 더 또는 벌레는 박테리아 (물 혼합 때 분명 나타납니다에서 분명 때까지 벌레).</li>
		<li>웜 펠 릿을 갓 만든된 염소/NaOH 솔루션 (1.3 단계)의 5 mL을 추가 하 고 빠르게 소용돌이 사용 하 여 혼합. 약 4-8 분 동안 로커에 튜브를 품 어. 염소/NaOH 솔루션 외피의 시간 4-8 분 재고 염소 솔루션 (표 백제)의 품질에 따라 번갈아 사용 합니다.</li>
		<li>유리 현미경 슬라이드에 벌레를 포함 하는 솔루션의 드롭 (2-50 µ L)을 넣고 모든 2 분 웜 세포에 대 한 현미경 검사. 벌레의 약 70%는 lysed 계란 출시 때 채우기 계란 버퍼 튜브 단계 1.2에서에서 준비 하 고 즉시 배아 작은 벌레 시체를 140 x g 에서 1 분 동안 원심.</li>
		<li>상쾌한 발음 하 고 때마다 계란 버퍼와 튜브를 작성 하 여 펠 릿 3 번 더 씻어. 140 x g 1 분 동안에 아래로 회전 하 고 제거는 상쾌한 때마다. 펠 릿 세척의 끝에 흰색으로 변합니다.</li>
		<li>최종 세척 후 30% 자당 해결책에서 죽은 시체에서 배아를 구분 합니다. 펠 릿에 압력가 이온된 수의 5 mL을 추가 하 고 resuspend 단계 1.4에서에서 준비 하는 60% 자당의 5 mL을 추가. 철저 하 게 혼합 하 고 6 분 160 x g 에서 원심.</li>
		<li>유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신선한 15 mL 원뿔 튜브로 위 초승달 모양에 부동 하는 배아를 전송. 3-4 mL 이상 복용 하지 마십시오. 제거 하려면 모든 나머지 자당, 배아를 씻어 3 번 centrifuging 140 x g 3 분에 의해 압력가 물 제거는 상쾌한 고 펠 릿 resuspending (와 튜브를 작성) 각 시간.</li>
		<li>1 x M9 버퍼와 세척을 반복 합니다. 최종 세척 후 M9 10 mL에 펠 릿을 resuspend. L1 애벌레로 부 화 계란을 위해 밤새 통 (더 이상 14 h)에 튜브를 둡니다. 벌레는 음식의 부족으로 인해 L1 애벌레 단계에서 유지 됩니다.</li>
		<li>3 시간 2 분에 대 한 140 x g 에서 centrifuging 애벌레에 의해 발표 어떤 페로몬을 제거 하려면 압력가 물으로 워시는 L1 애벌레 물의 1 mL에서 애벌레를 Resuspend. 1:10 희석 물에 벌레의 플라스틱 유리 슬라이드에 10 µ L 드롭는 coverslip에 넣고는 stereoscope 아래 벌레의 수를 계산. 이것을 두 번 반복 하 고 결과 평균.</li>
		<li>피 펫 작은 배치 하 여 약 1000 벌레는 NA22 플레이트 (실내 온도에 주어진 이전)에 해당 하는 벌레의 볼륨 접시에 떨어진다. 드롭 마르면 때까지 반 오픈 접시를 둡니다. 그런 다음 접시를 커버 하 고 거꾸로 약 44-48 h 또는 벌레는 stereomicroscope에서 시각적으로 확인으로 늦은 L4 단계에 도달 될 때까지 20 ° C 배양 기에서 품 어. 이제 벌레 SWIP에 대 한 테스트할 준비가 되어 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. SWIP
참고: 야생-타입 웜 AMPH 치료에서 SWIP 평가의 수동 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 짧게 벌레의 추적 및 자동된 웜 추적기와 Hardaway 외.10이전에 설명한 추적 소프트웨어를 사용 하 여 웜 활동의 추가 분석을 논의.
<ol><li>
수동 메서드 SWIP에 대 한 테스트를
	<ol>
<li>Aliquot 40 µ L 200 mOsm/L 자당 솔루션 또는 자리 유리판에 0.5 m m AMPH 없이. Stereoscope, 아래 속눈썹 또는 백 금 8-10 늦은 L4 단계 웜 선택 선택 하 고 잠수함 웜 선택 밖으로 이동 하 고 솔루션으로 수영 때까지 솔루션을 포함 하는 접시에서 선택. 잘으로 선택 하는 벌레의 수, 타이머 시작, 관찰 하 고 각 분 마크에서 SWIP를 전시 하는 벌레의 수를 기록.</li>
		<li>원시 데이터를 스프레드시트에 복사 고 웜 웜 분석 결과 통해 테스트의 총 수에 의해 각 순간에 마비 하는 벌레의 수를 나누어 마비의 비율을 계산 하 고 100을 곱하십시오. 어떤 그래프에 백분율 값을 복사 하 고 통계 소프트웨어 및 플롯 Y 축 백분율 값 및 X 축 XY 그래프를 사용 하 여 시간 데이터 형식.</li>
		<li>다음에 post hoc 분석 (예를 들어, Bonferroni 테스트 후) 제어, AMPH 그룹 및 치료 시간 중 통계적 의미를 테스트 하는 양방향 ANOVA를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SWIP의 자동된 분석
	<ol>
<li>한 번에 단일 벌레에 자동화 된 분석을 수행 합니다. 프로토콜 설정 카메라, 벌레 추적 소프트웨어 및 추적 소프트웨어를 실행 하는 스크립트를 분석 Hardaway 외.16에 자세하게 설명 되어 있습니다.</li>
		<li>간단히, 절 3.1.2에에서 수동 방법에 설명 된 대로 속눈썹 선택, 활용 하 여 유리 자리 접시에는 단일 늦은 L4 단계 자웅 동체를 놓습니다. 당시 한 벌레의 수영 동영상을 기록 하 고 벌레 추적 소프트웨어를 사용 하 여 신체 굴곡의 빈도 계산.</li>
		<li>벌레 탈 곡 데이터에서 열 지도 생성 하 고 웜 탈 곡 주파수를 추적 소프트웨어와 함께 제공 하는 스크립트에 따라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 행동 분석 결과, SWIP, C. 선 충에서 수행 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 없이 주요 기술적인 장애물이 분석 결과 매우 사용자 친화적인 만들기로 간단 하 고 직관적입니다. 그럼에도 불구 하 고, 분석 결과 효과적으로 수행 하기 위해 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 측면 있다.
분석 결과 대 한 사용 하는 웜 때문에 식이 제한에 영향을 미치는 SWIP17잘 먹이 되도록 주의 한다. 부드러운 따기 (백 금 선택을 사용 하는 경우에 일반적인 더) 또는 염소/NaOH 솔루션에 배아의 확장된 노출 동안 외상 할 수 있는 세포 중 잘 초과 염소/NaOH 처리는 중요 한 단계를 따기 동안 벌레의 처리 웜18 에 영구적인 손상을 원인과 따라서 수영을 자신의 능력을 손상 시킬.
무 균 기법 오염을 피하기 위...

동물 다양 한 복잡 한 신호 처리에 의해 조정 하는 다른 신경 전달 물질에 의해 중재는 타고 난 하 고 복잡 한 동작을 수행 합니다. 신경 전달 물질 도파민 (DA) 종, 학습, 운동 기능 및 보상 처리를 포함 하 여에 걸쳐 높은 보존된 행동 중재.
토양 선 충 류 C. 선 충만 302 뉴런으로 구성 된 비교적 간단 하 고 잘 매핑된 신 경계 표시 등 짝짓기, 학습, 구하고, 운동 달걀 누워 다에 의해 규제는 많은 포함 하 여 현저 하 게 복잡 한 동작 1. 다른 기능, 짧은 라이프 사이클, 취급의 용이성 및 신호 분자의 보존, 중 보존된 행동의 신경 기초 공부에 대 한 모델로 C. 선 충 의 장점을 강조.
C. 선 충 자웅 동체 포함 8 dopaminergic 신경; 이들 이외에, 남자 짝짓기 목적 6 여분의 쌍을 포함 합니다. 포유류에서 이러한 신경 다 합성 하 고 다 전송 (DAT-1)는 다 다시 dopaminergic 신경 세포에 시 냅 스 갈라진 틈에 발표 전송 dopaminergic 신경에서 독점적으로 찾아낸 막 단백질을 표현 한다. 또한, 합성, 포장 및 다의 출시의 각 단계에 관련 된 단백질의 대부분은 매우 벌레와 인간 사이 보존 하 고, 같은 포유류, 다 변조 먹이 행동과 C. 선 충2운동.
C. 선 충 고체 표면에 크롤 링 하 고 물에 특성 때리는 행동으로 수영. 흥미롭게도, DAT-1 (dat-1)의 표현 부족 돌연변이 고체 표면에 일반적으로 크롤 링 하지만 물 때 수영을 유지 하기 위해 실패 합니다. 이 문제는 수영 유도 마비 또는 SWIP 되 나. 이전 실험 SWIP, 부분적으로, 발생 했다고 궁극적으로 d 2 같은 postsynaptic 수용 체 (DOP-3) overstimulates 시 냅 스 갈라진 틈에 다의 과잉에 의해 설명 했다. 원래 dat 1 녹아웃 동물3확인, SWIP 야생-타입 동물 블록 활동 DAT (예: imipramine4)의 약물 치료에 관찰 및 유도 다 릴리스 (예: 암페타민5). 다른 한편으로, 합성 및 다의 릴리스를 averting와 DOP-3 수용 체 기능을 차단 약리학 또는 유전자 조작 방지 SWIP6. 함께 찍은, 이러한 이미 게시 된 데이터는 설립 SWIP dopaminergic 시 냅 스3,,47 돌연변이 단백질에 의해 발생 하는 행동 효과 공부 하 고 하에 대 한 신뢰할 수 있는 도구로 다7,,89,10,,1112신호에 관련 된 소설 규제 통로의 식별에 대 한 앞으로 유전 스크린. 또한, 생체에 약물 유발 동작의 쉽게 정량 판독 함으로써 SWIP 수 암페타민 (AMPH) 같은 약물의 행동의 메커니즘의 해명 및 azaperone는 dopaminergic에서 synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
SWIP 분석 실험을 수행 하기 위한 프로토콜16전에 설명 했습니다. 방법론 및 설치 SWIP를 효과적으로 수행 하기 위해 선 충 C. 커뮤니티에 대 한 시각적 가이드를 제공 하는 목적으로 시험을 수행 하는 여기, 우리가 자세히 설명.

<table><tbody><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Reynolds 랩</td><td>1091835</td><td></td></tr><tr><td>Amphetamine</td><td>Sigma</td><td>51-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세균 인큐베이터</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1352-0000</td><td></td></tr><tr><td>세균 등급, Agar</td><td>Lab Scientific, Inc</td><td>&nbsp; A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) Peptone</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (dihydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>카메라&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td>Eppendorf 5810R 15amp</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Milli-Q</td></tr><tr><td>Depression 유리 스포트 플레이트</td><td>Corning</td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크</td><td>ThermoFisher</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>속눈썹</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>그래프 및 통계 소프트웨어</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=H3375 & H7006</td><td></td></tr><tr><td>하이포아염소산염</td><td>Hawkins</td><td>차아염소산나트륨 4-6%, USP" 1</td><td></td></tr>갤런 <tr><td>LB 육수, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(육수화물)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=M0250</td><td>500g</td></tr><tr><td>황산마그네슘(헵타하이드레이트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 스티어 바</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 박테리아</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>삼투압 계</td><td>Advanced Instruments, Inc</td><td>모델 3320</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Orion VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>폴리스린 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소 칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 - 이염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 - MONOBASIC</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>VWR</td><td>10ml=89130-898</td><td></td></tr><tr><td>셰이커</td><td>신뢰할 수 있는 과학</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher</td><td>RB = BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>인산이 수소 나트륨</td><td>Fisher</td><td>RB = S381</td><td></td></tr><tr><td>스프레드 시트</td><td>MS office</td><td></td><td>Microsoft Excel</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Zeiss</td><td>모델 tlb3. 1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 팁</td><td>다양한</td><td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=S5016</td><td></td></tr><tr><td>초강력</td><td>록타이트</td><td>1647358 .14 oz.</td><td></td></tr><tr><td>SwimR 소프트웨어</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr> <tr><td>비디오 녹화 소프트웨어</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

이 프로토콜에서 설명 하는 수영 분석 결과 dopaminergic 조절 단백질을 식별 하는 유효한 도구 synapses 이다. 포유류와 마찬가지로, 도파민 (DA) C. 선 충 등 학습과 모터 활동에에서 여러 기능을 제어 합니다. 다 릴리스 (예를 들어, 암페타민 (AMPH) 치료)를 자극 하는 또는 그 다 허가 조건 (예: 동물 다 전송 부족 (dat-1) 는 뉴런을 다를 reaccumulating 할 수 있다) 세포 외 다의 과잉 생성 궁극적으로 저해 운동의 결과. 이 동작은 동물 물에서 수영 하는 때 특히 분명 하다. 사실, 야생-타입 동물 오랜된 시간 동안 수영을 계속, 하는 동안 dat 1 null 돌연변이 야생-타입 AMPH 처리 또는 억제제 다 전송의 우물의 바닥에 침 몰 하 고 이동 하지 않습니다. 이 문제는 "수영 유도 마비" (SWIP) 이라고 불린다. SWIP 분석 결과 잘 설립, 방법의 자세한 내용은 부족 한. 여기, 우리가 SWIP 수행 하는 단계별 가이드를 설명 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 늦은 애벌레 단계 4 동물 또는 AMPH 없이 제어 자당 솔루션을 포함 하는 유리 자리 접시에 배치 됩니다. 동물은 stereoscope에 장착 하거나 수동으로 시각화는 stereoscope 아래 자동으로 카메라와 함께 녹음 하 여 그들의 수영 동작에 대 한 득점 된다. 동영상 다음 탈 곡 주파수와 마비 열 지도 형태로 시각적 표현 생성 하는 추적 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 수동 및 자동 시스템 동물 들의 수영 능력의 쉽게 정량 판독을 보장 하 고 따라서 동물 dopaminergic 시스템 내에서 돌연변이 베어링에 대 한 또는 보조 유전자에 대 한 심사를 용이 하 게. 또한, SWIP 명료 AMPH 악용의 약물의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

선물이 SWIP 분석 결과 AMPH 치료에 의해 유도 된의 예. 그림 1 에서는 위에서 설명한 대로 분석 결과 설정의 도식 대표. 수동 분석 결과, 약 8-10 나이 동기화 된 늦은 L4 단계 벌레는 속눈썹 또는 백 금 수집 선택 하 고 유리 자리 접시 200 mOsm/L 자당 (제어 솔루션) 또는 0.5 m m AMPH 자당의 40 µ L를 채워지고, SWIP에 대 한 테스트에 배치.
동물 수영을 중지 하는 경우 (즉, SWIP 전시), 그들은 신속 하 게 우물의 바닥에 침 몰 하 고 이동 하지 않습니다. 따라서, 여전히 우물의 바닥에 꾸준한 사람 대 물의 표면에 수영 동물 사이 차별은 매우 간단 합니다. 벌레의 대부분 AMPH 치료에서 SWIP 점차적으로 전시 하는 동물의 수는 증가 하는 반면에 적어도 10...

수영 유도 마비 (SWIP)가 잘 설립 행동 분석 결과 꼬마 선 충 (C. 선 충)에서 신호 하는 도파민의 기본 메커니즘을 연구 하는 데 사용. 그러나, 분석 결과 수행 하는 자세한 방법을 부족 이다. 여기, 우리가 SWIP에 대 한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

이 절차의 전반적인 목표는 수영 유도 마비 또는 SWIP를 입증 하는, C.elegans에서 도파민 신호를 평가 하는 행동 분석. SWIP는 도파민성 시냅시스 내 또는 관련 유전자의 신속한 식별을 허용합니다. 이 방법은 약물이나 도파민 수송기의 돌연변이에 의해 예를 들어 발생하는 세포 외 도파민의 과잉에 의해 생성 된 효과의 조사를 할 수 있습니다.분석 중에 테스트된 모든 웜이 동일한 시간 동안 수영할 수 있도록 동물은 신속하게 용액으로 이송되어야 합니다. 시리샤 쿠두말라와 고요한 소시입니다. 그들은 모두 내 실험실에서 작동합니다.웜 스타터 문화를 설정하려면 멸균 주걱을 사용하여 C.elegans를 잘 먹이는 접시에서 작은 한천 조각을 자르고 한천 조각을 개별 NA22 E.coli 플레이트로 옮길 수 있습니다. 3~4일 동안 섭씨 20도에서 플레이트를 배양한 후 스테레오 현미경으로 중력 성인의 존재를 시각적으로 확인합니다. 벌레의 동기화 된 인구를 얻으려면, 중력 성인의 전체 접시에 물을 분출.부드럽게 웜을 빼내기 위해 접시를 소용돌이게 하고 폐기 파이펫을 사용하여 벌레를 15 밀리리터 폴리스티렌 원내 튜브로 옮춥시다. 두 번째 플레이트에서 벌레를 튜브로 끌어낸 후, 세척당 15밀리리터의 자동 세척기에서 3개의 세척을 위해 원심분리로 벌레를 수집합니다. 물은 마지막 세척 후 맑게 나타납니다.마지막 원심분리 후, 새로 준비된 저혈당 나트륨 용액 5밀리리터를 웜에 넣고 소용돌이와 빠르게 섞는다. 로커에 튜브를 배양하고, 유리 현미경 슬라이드에 벌레 용액 한 방울을 놓고 4~8분 동안 2분마다 입체 범위 아래에 웜 용액을 검사합니다. 벌레의 약 70%가 lysed되고 계란이 방출되었을 때, 계란 버퍼를 추가하여 즉시 리시스를 중지하십시오.그런 다음 배아와 벌레 시체를 4번 재중단하여 남은 표백제를 제거합니다. 마지막 세척 후 펠릿은 흰색으로 표시되어야 합니다. 유리색 물 5밀리리터와 60%의 자당 5마리의 밀리리터에서 펠릿을 재연하여 배아를 원심분리로 시체로부터 분리한다.밀도 그라데이션 분리 후 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 상반신 연반상에 떠있는 배아의 3~4밀리리터를 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 옮킨다. 자당을 제거하기 위해 오토클레이브 물로 배아를 세 번 씻은 다음 M9 완충제에서 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 신선한 M9 버퍼의 10 밀리리터에 하룻밤 셰

swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

이 동영상은 파킨슨병에 대한 모델로 dopaminergic 신경 세포의 neurodegeneration을 평가 C. 엘레간스를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, 유전자 화면은 어느 변성을 향상 또는 neuroprotective 가지 요인을 식별하는 데 사용됩니다.

잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

이 동영상은 선충류, C. 엘레간스의 신경 기능을 연구 보완 방법의 두 신경 자극, aldicarb 및 pentylenetetrazole (PTZ)을 고용하는 방법을 보여줍니다. 이 상호 보완적인 접근 방법은 또한 modulating의 연결 synchrony에 대한 evolutionarily 보존 메커니즘에 대해 설명해 주실 사용 간질과 발작에 대한 의미를 가지고있을 수 있습니다.

C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

여기에서는 수영과 같은 격렬한 움직임 중에 발생하는 예쁜꼬마선충의 행동 표현형인 SWIP를 측정하기 위한 분석을 소개합니다. 예제 프로토콜은 수동 및 자동 분석 접근 방식에 대해 설명합니다.

SWIP(Swimming-Induced Paralysis) 분석: 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 도파민 매개 운동을 정량화하는 방법

이 비디오는 야생형 또는 ALS 돌연변이 인간 TDP-43 단백질을 발현하는 예쁜꼬마선충의 운동 기능 장애를 평가하기 위해 방사형 운동 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. 다양한 수준의 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 발현을 가진 웜은 크롤링할 수 있으며, 이들의 움직임은 분석 플레이트의 중심점에서 이동한 반경 거리로 측정됩니다. 이 분석은 다양한 예쁜꼬마선충 균주가 이동한 거리에 따라 경증, 중등도 및 중증 운동 장애를 구별합니다.

방사형 운동 분석법을 사용한 예쁜꼬마선충 모델의 운동 손상 평가

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체...

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

액체의 선충 유영의 컴퓨터 기반 분석을위한 효과적이고 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 C. elegans의 실험실에 대한 더 투자에 조금 필요합니다. 사용되는 하드웨어는 표준 및 행동 분석 (CeleST)을위한 컴퓨터 소프트웨어는 오픈 소스이다.

의 자동 분석<em&gt; C. 엘레</emCeleST 소프트웨어를 사용&gt; 수영 동작

이 프로토콜은 근위축성 측삭 경화증의 C. elegans 모형에 있는 온화한, 온건한, 및 가혹한 운동 손상 사이에서 차별에 대한 2개의 민감한 분석, C. elegans 긴장에 대한 일반적인 유틸리티, 변경된 운동성.

근위축성 측삭 경화증의 C. 엘레간 모델의 모터 손상 평가

이 기사에서는 7점 득점 시스템을 사용하여 C. elegans의도파민성 뉴런 원간 형태에 대한 변경 사항을 일관되게 정량화하는 방법을 소개합니다. 이 시스템은 유전, 화학 및 신경 퇴행성 질환의 노화 기반 모델을 활용한 도파민성 신경 변성 분석의 분석을 위한 것입니다.

Caenorhabditis elegans에서 도파민인체학 뉴런 형태 학적 변경 및 변성의 수준을 정량화

본 프로토콜은 예쁜 꼬마선충 아세틸콜린 수용체의 한 부류의 약리학적 작용제인 레바미솔에 대한 반응을 결정하기 위한 검정을 기술한다. 이 액체 레바미솔 수영 분석에서 연구자들은 24 웰 플레이트에서 재배 된 동물의 시간 의존적 마비를 시각적으로 관찰하고 정량화합니다.

Caenorhabditis elegans 아세틸콜린 수용체 작용제 Levamisol에 대한 민감도 측정

이 프로토콜은 젊은 RAC1/CED-10 돌연변이 Caenorhabditis elegans에서의 정량적 배변 검사를 상세히 다루며, 전염성 파킨슨병 병기를 연구할 수 있는 간단한 모델을 제공합니다. 이 방법은 다른 동물 모델의 한계를 극복하고 초기 파킨슨병리를 표적으로 하는 치료 전략 시험을 용이하게 합니다.

초기 파킨슨병 연구 도구로서 Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 돌연변이의 위장 운동성 평가

배우세요 Caenorhabditis elegans에서 수영 유도 마비(SWIP)를 이용한 도파민 신호 평가 방법을. 이 기법은 도파민 시냅스 관련 유전자를 신속하게 식별하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

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