Name: 로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 학습하세요 신경세포와 신경교세포에서 유전자 인코딩 칼슘 지표를 이용한 고해상도 칼슘 이미징 프로토콜을 통해 세포내 신호 전달 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.

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이 작품은 다음 교부 금에 의해 지원: 일본 과학 및 기술 기관 (JST) / Precursory 연구 배아 과학 및 기술 (프레스 토) (JPMJPR15F8, 일본); 과학 (JSP)의 승진을 위한 일본 사회 / 다케다 기초 과학 연구 (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316)에 대 한 원조에 부여. 저자 RCaMP2 및 아서 재 황 제공 Haruhiko Bito (도쿄 대학)를 감사 하 고 토마스 맥 휴 (RIKEN CBS) AAV 벡터를 제공 하 고 대 한 지침은 AAV 준비에 관한. 저자는 또한 편집자 저널의 시각 실험 비디오 촬영 및 편집 그들의 도움에 감사 하 고 싶습니다.

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<li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca%282%2B%29+Sensing%3A+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li>
<li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li>
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<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li>
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<li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+local+Ca%282%2B%29+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca%282%2B%29+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li>
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<li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+Ca2%2B+signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li>
<li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+high-affinity%2C+fast%2C+red+calcium+indicator+R-CaMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li>
<li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li>
<li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li>
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<li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+subtle%2C+transient%2C+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca%282%2B%29+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li>
<li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TI+Workbench%2C+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxford%2C+UK%29%22%5BJournal%5D)">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li>
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<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

다양 한 생물 학적 출력 캘리포니아2 + 신호에 의해 시작 됩니다. 캘리포니아2 + 다양 한 세포내 신호 메신저입니다. 근본적인 생물학 질문 되었습니다 특정 출력 연상 캘리포니아2 + 신호 디코딩 그리고 캘리포니아2 + 이미징 기술을 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하기 위해 필요 합니다. 현재 상세한 프로토콜 고유 Ca2 + 원형질 막 및 응급실 (그림 3 및 그림 4)와 로컬 Ca2 + microdomains (그림 4 및 그림 5) 셀 내에서 신호 감지 수 있습니다. 이 세포내 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하는에 공헌 한다. 캘리포니아2 + 의 시간적 해상도 또한 캘리포니아2 + 그리고 GECIs,의 3 차원 확산의 효과 피할 수 있고 그것이 검출 가능성이 있기 때문에 원형질 막에 응급실 GECIs를 대상으로 개량 되었다 신호는 캘리포니아2 + 유입 또는 캘리포니아2 + , 막에 발생 하는의 아주 순간.
프로토콜에는 몇 가지 제한이 있습니다. 사용자가 검색 된 신호는 "캘리포니아2 + 유입 또는 릴리스 순간"의 합계 염두에 두어야 할 "캘리포니아2 + 확산 밖으로 캘리포니아2 + 원본에서", 특히 큰 캘리포니아2 + 신호에 대 한 및. 예를 들어 비록 HeLa 세포에서 그의 자극 끝 캘리포니아2 + 릴리스 응급실, ER 대상 사이트-GCaMP6f에 의해 뿐만 아니라 플라즈마 막 대상 Lck-RCaMP2 (그림 3)에 의해2 + 신호 감지의 결과 Ca에서. 또 다른 한계는 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 패턴 캘리포니아2 + 신호 출력의 유일한 결정 요인이 되지 않을 수 있습니다. 다운스트림 effector 단백질의 분포 (Ca2 +같은-종속 kinases와 가수분해)2요소를 결정할 수도 있습니다. 완전히 세포내 캘리포니아2 + 신호 디코딩,이 프로토콜에 적용 되지 않습니다, 다운스트림 효소 행동의 분석은 절대적으로 필요 하다.
성공적인 캘리포니아2 + 이미징에 대 한 가장 중요 한 측면 중 하나는 이미지 설정 및 이미지 인수 조건, 뿐만 아니라 다른 라이브 이미징 연구에 관해서는. 우리는 이전 캘리포니아2 + 응답 셀에는 높게 지 기간 및 흥분의 강도에 노출 시간 및 수집 주파수16를 포함 한 이미지 획득 조건에 보였다. 조명 전원을 광 독성 및 photobleaching GECIs의 발생할 수 있습니다 가장 중요 한 요소입니다. 노출 시간, 주파수, 흥분 빛의 강도, 및 기간 기록의 기록의 기록 조건 실험의 목적에 따라 최적화 되어야 합니다. 노출 시간 및 흥분 빛의 강도 photobleaching와 phototoxicity 셀을 피하기 위해 가능한 한 많이 감소 하는 것이 좋습니다. 녹음 주파수와 녹음 기간 Ca2 + 상승 이벤트 관심을 커버 하기에 충분 해야 하지만 또한 photobleaching 및 phototoxicity을 피하기 위해 가능한 한 낮게 유지 되어야 한다. 먼저 녹음 주파수와 기간을 결정 하 고는 GECIs photobleaching 최소화 되도록 노출 시간과 빛의 강도 최적화는 것이 좋습니다. 또 다른 중요 한 요소는 GECIs 식 수준입니다. GECIs는 캘리포니아2 +-그들은 캘리포니아2 +효과 버퍼링-바인딩 단백질. 따라서, GECIs의 overexpression 셀에 대 한 생리 적으로 필요한의 캘리포니아2 +, 버퍼링 발생 합니다. GECI 식의 양은 GECIs의 높은 금액을 표현 하는 이미징 셀을 피하기 위해 최소화 한다. 
  결론적으로, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부 세포내 캘리포니아2 + 출력 생물 학적 현상을 결정 하는 신호를 해독 하는 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜의 이러한 신호 중 다양성을 설명 하기 위해 캘리포니아2 + 신호 해 부에 대 한 새로운 방법을 제공 합니다. 현재,이 기술은 체 외 실험에 대 한 제한 됩니다. 그러나, Lck-GCaMP6f 이미 쥐17, vivo에서 캘리포니아2 + 이미징에 사용 되 고 그리고 OER GCaMP6f 모니터링 Ca2 + C. 선 충7에서에서 VD 모터 뉴런에 생체 신호 확인 했다. 따라서, subcellular 격실에 있는 GECIs를 타겟팅 vivo에서 이미징 미래에, 따라서 사용 하면 Ca2 + vivo에서 해 부에 확장 될 가능성이 있다.

캘리포니아2 + 신호는 세포내 캘리포니아2 + 농도의 고 도를 나타냅니다. 캘리포니아2 + 진 핵 세포에 대 한 보편적인 두 번째 메신저입니다. 를 사용 하 여 Ca2 +세포 다양 한 세포내 신호 통로 통해 작동 하 고 다양 한 생물 학적 출력을 유도. 예를 들어 뉴런, 시 냅 스 소포 릴리스 연 접 맨끝에 있는 유전자 발현, 핵에는 postsynapse에서 시 냅 스가 소성의 유도 고유한 Ca2 + 신호를 정확 하 게 적절 한 활성화에 의해 통제 된다 다운스트림 효소와 정확한 타이밍1오른쪽 사이트에서.
캘리포니아2 + 신호 특정 spatiotemporal 패턴 특정 다운스트림 효소를 활성화합니다. 캘리포니아2 + 신호를 두 개의 서로 다른 Ca2 + 소스 사이의 조정에 의해 생성 됩니다: 세포 외 공간 및 바인딩과 그물 (응급실), 세포내 캘리포니아 2 +역할에서 Ca2 + 방출 캘리포니아2 + 유입 저장. 의미 있는 spatiotemporal 캘리포니아2 + 신호 패턴을 유도 하는 특정 세포의 기능 10-100 µ M Ca2 + 캘리포니아2 + 원형질 막 또는 ER 막2채널 주변에서 생성 된 nanodomains에 의해 지원 됩니다. 중요 한 것은, 캘리포니아2 + 신호 소스 다운스트림 생물 출력을 결정 하는 가장 중요 한 요인 중 하나입니다. 신경에 있는 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 릴리스는 감마-aminobutyric 산 (GABA)A 수용 체 (GABAAR) GABAergic 시 냅 스에서의 클러스터링에 대 한 반대 효과의 저해에 대 한 책임은 신경 흥분3. 캘리포니아2 + 유입 대규모 신경 흥분을 동반 시 냅 스 GABAAR 클러스터의 분산을 유도, 영구 캘리포니아2 + 응급실에서 출시 하는 반면 시 냅 스 GABAARs의 클러스터링을 촉진. 다른 그룹 또한 성장 콘의 튜닝 방향 비판적으로 Ca2 + 신호 소스에 의존은 보고: 캘리포니아2 + 유입 유도 반발, 동안 캘리포니아2 + 릴리스 가이드 신경 성장의 매력 콘4. 따라서, 완벽 하 게 이해 하는 캘리포니아2 + 특정 세포 출력 기본 경로 신호, 그것은 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 설명 하 여 캘리포니아2 + 신호 소스를 식별 하는 것이 중요.
이 프로토콜에 우리는 Ca2 + 이미징 메서드를 Ca2 + 신호 Ca2 + 신호 소스 (그림 1)의 평가 허용 한다 subcellular 해상도에 대해 설명 합니다. 바로 아래에 원형질 막 캘리포니아2 + microdomains는 성공적으로 지표에 의해 유전으로 인코딩된 캘리포니아2 + (GECIs) 플라즈마 멤브레인 지역화 신호 Src 내 Lck의 첨부 파일을 통해 플라즈마 멤브레인을 대상으로 모니터링 GECIs5의 N termini에 니. Ca2 + 신호 패턴 더 나은 공간과 시간 해상도 응급실 주변 감지, 우리 최근 개발 OER-GCaMP6f, 어느 GCaMP6f6 대상 응급실 외부 막에서 ER 막 횡단 단백질을 사용 하 여. OER-GCaMP6f 캘리포니아2 + 그리고 GECIs의 확산을 방지 하 여 민감하게 COS-7 셀7 와 HEK293 세포8, 기존의 nontargeted GCaMP6f 보다는 더 나은 spatiotemporal 해상도에 응급실에서 Ca2 + 자료를 보고할 수 있습니다. . 우리는 또한 사이트-GCaMP6f에 의해 보고 된 교양 hippocampal 이다에서 자발적인 Ca2 + 고도 다른 spatiotemporal 패턴을 보여 확인 원형질 막 표적으로 GCaMP6f에 의해 모니터링에 비해 (Lck-GCaMP6f)7 ,9, 나타내는 Lck-GCaMP6f와 함께에서 OER-GCaMP6f와 함께 캘리포니아2 + 이미징 캘리포니아2 + 신호 그들의 소스를 식별 하기 위해 subcellular 해상도 해 부에 기여.
현재, 우리는 캘리포니아2 + 신호 해 부 HeLa 세포와 신경-사이토 혼합 유리 coverslips에 도금 하는 문화에 대 한 프로토콜을 선발. 캘리포니아2 + 이미징 기술은 GECIs와 표시 여기, Lck-GCaMP6f, 플라즈마 막 대상 RCaMP210 (Lck-RCaMP2), 고 OER-GCaMP6f (그림 1) 이러한 GECIs를 표현할 수 있는 모든 셀에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>(RS)-3,5-디하이드록시페닐글리신(DHPG)</td><td>Tocris</td><td>#0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5% DNase I 원액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#11284932001</td><td>120mM MgSO4로 보충된 Hanks' Balanced Salt Solution&nbsp에서 0.5% DNase I(w/v)를 준비합니다. 160 &micro를 준비하십시오. L 분취량은 -30 &deg;C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA 용액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#25300054</td><td></td></tr><tr><td>100 mM L-glutamine (&times; 100 stock)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#25030081</td><td>250-750 &micro의 작은 부분 표본 준비; L을 선택하고 -30 &deg;C에서 저장합니다.</td></tr><tr><td>100 mM 나트륨 피루베이트 (&times; 100 stock)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#11360070</td><td>부분 표본(10 mL)은 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 해동 후 용액은 4°C로 유지될 수 있습니다. C를 2개월 동안 복용합니다.</td></tr><tr><td>저증발 뚜껑이 있는 12웰 멀티웰 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>#353043</td><td>저증발 뚜껑은 뉴런-아교세포 혼합 배양을 배양하는 데 중요합니다. 세포주 세포의 경우, 대체 배양 접시를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>18mm 직경의 원형 커버 슬립</td><td>Karl Hecht "Assistent"</td><td># 41001118</td><td>두께 1, 18mm 직경의 원형 커버 슬립; 대체 커버 슬립을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15630080</td><td>pH 7.2-7.6</td></tr><tr><td>2.5% 트립신 주식 용액 (&times; 20 주식)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>#T4674</td><td>150 &micro를 준비하십시오; L 분취 및 -30 &deg;C에서 보관.</td></tr><tr><td>50% 폴리(에틸렌이민)(PEI) 용액&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3143</td><td>2% (V/V) PEI 원액을 준비합니다 (&times; 50) 여과에 의해 살균 된 증류수. 재고 솔루션을 -30 &deg에 저장하십시오. C 250-750 &마이크로의 작은 분취액을 준비한 후 L. 커버슬립 코팅 당일 증류수로 0.04% PEI 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td>표면 소독에 사용하기 위해 스프레이 병에 보관합니다.</td></tr><tr><td>EF1a 프로모터 AAV의 지시에 따라 Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 및 OER-RCaMP2 발현을 위한 아데노 관련 바이러스(AAV)</td><td>는 AAV Helper Free System(Agilent Technologies) 및 HEK293 세포 또는 대체 방법을 사용하여 제조할 수 있습니다.요청 시 pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 및 &nbsp; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f를 사용할 수 있습니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 (&times; 50 stock)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#17504044</td><td>B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) 또는 MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566)로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>B57BL/6</td><td>일본 SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 이미지 기록</td><td></td><td></td>용 카메라 <td>다음 카메라를 사용할 수 있습니다: 냉각-CCD 카메라(예: Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD 카메라(예: Hamamatsu Photonics,&nbsp; 이매지엠; Andor, iXon) 또는&nbsp; CMOS 카메라(예: Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td></tr><tr><td>셀 동결 용기</td><td>Sarstedt K.K.</td><td>#95.64.253</td><td>대체 세포 냉동 용기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td></td><td></td><td>37°C로 유지 C, 5% CO<이하 >2</이하 >.</td></tr><tr><td>극저온 튜브</td><td>Corning</td><td>#430661</td><td>대체 극저온 튜브를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>동결 보존 배지</td><td>Zenoaq</td><td></td><td>"CELLBANKER1"</td></tr><tr><td>배양 배지 (HeLa 세포 용)</td><td></td><td></td> <td>10 % 열 비활성화 소 태아 혈청 및 페니실린-스트렙토 마이신 용액이 보충 된 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) (최종 농도 : 페니실린 100 U / mL 및 스트렙토 마이신 100 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>해부 매체&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1 밀리리터의 1 M HEPES (최종 농도 20 mM) - 49 mL DMEM&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td><td>대체 DMEM을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td><td>저포도</td></tr>당 <tr><td>DNA 형질주입 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#6366244001</td><td>"X-tremegene HP DNA 형질주입 시약" 대체 형질주입 시약을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr>동물을 마취하기 위한 <td>뚜껑</td><td></td><td></td>이 있는 유리 항아리 <td>500 mL 항아리(마우스용) 또는 1,500 mL 항아리(쥐용);</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#14170161</td><td>칼슘 및 마그네슘 무함유 HBSS</td></tr><tr><td>열 불활성화 소 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10100147</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>RIKEN BioResource Center</td><td>#RCB0007</td><td></td></tr><tr><td>히스타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H7125</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>Metamorph(분자 장치), ImageJ(NIH) 및 TI Workbench14(맞춤형)와 같은&nbsp;</td></tr><tr><td>이미지 분할 광학</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>#A12801-01</td><td>W-view GEMINI</td></tr><tr><td>이미지 분할 광학 이색성 거울</td><td>Semrock</td><td>#FF560-FDi01-25&times; 36</td><td>녹색 형광 단백질/적색 형광 단백질의 분리를 위해&nbsp; (GFP/RFP) 신호</td></tr><tr><td>이미지 분할 광학 방출 필터</td><td>Semrock</td><td>#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td><td>GFP/RFP 신호 방출의 경우 각각</td></tr><tr><td>이미징 매체 및 버퍼</td><td></td><td></td><td>실험에 최적의 배지 또는 버퍼를 사용합니다. 배지를 사용하는 경우 페놀 레드가 없는 배지는 배경 형광을 줄이는 것이 바람직합니다. 20mM HEPES를 추가하여 CO2 인큐베이터 외부에서 pH를 유지합니다.</td></tr><tr><td>배양 식염수&nbsp;</td><td></td><td></td> IX73 (Olympus)과 같은 <td>49 mL HBSS 도보형 형광 현미경</td></tr><tr><td></td><td></td>에 1 mL의 1 M<td>HEPES</td> (20 mM)를 첨가하거나<td>; 이클립스 TI (니콘 인스텍)</td></tr> <tr><td>이소 플루란</td><td>화이자</td><td></td><td>마취에 사용</td></tr><tr><td>유지 매체 (4 &times; 12 웰 접시)</td><td></td><td></td> <td>48.5 mL Neurobasal-A 배지 1 mL B-27, 500 &micro; L-글루타민 스톡의 L 및 25 &마이크로; L 페니실린-스트렙토마이신 용액.</td></tr><tr><td>동결된 피질 세포를 위한 유지 매체 (1 &times; 12 웰 접시)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>12.2 mL Neurobasal plus 배지에 250 &micro 첨가; L B-27, 125 &마이크로; L-글루타민 스톡의 L 및 6.2 &마이크로; L 페니실린-스트렙토마이신 용액.</td></tr><tr><td>MEM (Minimum Essential Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#11090-081</td><td></td></tr><tr><td>GCaMP6f 이미징</td><td></td><td></td>용 현미경 필터 세트 <td>GFP에 적합한 필터(여기, 480 &plusmn; 10 nm; 방출, 530 &plusmn; 20 nm)</td></tr><tr><td>RCaMP2 이미징</td><td></td><td></td>용 현미경 필터 세트 <td>RFP에 적합한 필터(여기, 535 &plusmn; 50 nm; 방출, 590 nm long pass)</td></tr><tr><td>RCaMP2 및 GCaMP6f</td><td>Semrock</td><td>#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&times의 이중 이미징을 위한 현미경 필터 세트; 36, #FF01-512/630-25</td><td>GFP/RFP 이미징을 위한 이중 여기 필터, 이중 이색성 미러 및 방출 필터.</td></tr><tr><td>현미경 가열 시스템</td><td></td><td></td><td>세포를 37 &deg로 유지하는 가열 시스템; C 이미징 중. 열팽창으로 인한 드리프트를 방지하려면 전체 현미경 자체를 덮는 가열 시스템(예: Tokai Hit, Thermobox)을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr>여기<td></td><td></td><td>용 현미경 광원</td><td>수은 램프(100W), 크세논 램프(75W), 발광 다이오드(LED) 조명 시스템(예: CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4파장 LED 소스; Lumencor, SPECTRA X 라이트 엔진). 수은 덩어리 및 크세논 램프의 경우 ND 필터를 사용하여 여기 강도를 줄이십시오.</td></tr><tr>개구수가 1.3 이상인 <td>현미경 대물렌즈</td><td></td><td></td><td>Plan-Apochromat 오일 이멀젼 대물렌즈는 뉴런과 성상세포에서 자발적인 Ca2+ 활동을 기록하는 데 적극 권장됩니다.</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td> 배지 대신 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10888022</td><td>Neurobasal plus medium(Thermo Fisher, A3582901)을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PBS(-): Ca2+ 및 Mg2+&nbsp;</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td><td>#164-23551</td><td>Ca2+ 및 Mg2+의 부재는 트립신 활성을 억제하지 않는 데 중요합니다. PBS(-) 대신 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr>Metamorph(Molecular Devices)와 같은 <td>PC 및 이미지 수집 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>; 마이크로 매니저; TI Workbench14.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15140122</td><td>페니실린 10,000 U/mL 및 스트렙토마이신 10,000 &마이크로; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>거대세포바이러스 프로모터 하에서 Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 및 OER-RCaMP2 발현을 위한 플라스미드 7-9</td><td></td><td></td><td>요청 시 사용 가능</td></tr><tr><td>도금 매체 (4 &times; 12 well dish)</td><td></td><td></td><td>48 mL MEM에 1 mL B-27 supplement, 500 &micro; L L- 글루타민 스톡 (최종 농도 : 2 mM), 500 &micro; 피루브산 나트륨 스톡(1mM) 및 25&마이크로의 L; L 페니실린-스트렙토마이신 용액(페니실린 5 U/mL, 스트렙토마이신 5 &마이크로; g/mL)입니다. 이 페니실린-스트렙토마이신의 농도는 1/20의&nbsp; 제조업체가 권장하는 농도는 신경 세포의 생존에 매우 중요합니다.</td></tr><tr><td>기록 챔버</td><td>Elveflow</td><td>Ludin 챔버</td><td>이 기록 챔버는 직경 18mm의 원형 커버슬립용입니다.</td></tr><tr><td>저혈청 배지</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11058021</td><td>Opti-MEM</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td></td><td></td> 해마를 <td>해부하는 데 사용됩니다. Olympus SZ60 또는 동급의 실체현미경을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>수술 도구</td><td></td><td></td><td>쥐나 쥐의 복부를 절단하기 위한 표준 해부 가위, 자궁을 집어넣기 위한 핀셋, 자궁과 배아의 머리를 절단하기 위한 섬세한 해부 가위, 배아를 집어넣기 위한 링 펜치, 뇌를 추출하기 위한 13cm 곡선의 셈켄 펜치 (Fine Science Tools #11009-13), &nbsp; 세밀한 팁이 있는 3개의 펜치&nbsp; (뒤몽 이녹스 #5)</td></tr><tr><td>뉴런용 형질주입 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#L3000008</td><td>"Lipofectamine 3000" 시약. 2.2.3단계에서 플라스미드 DNA와 혼합해야 하는 "supplement (P3000)"와 2.2.4단계에서 사용한 "transfection 시약(lipofectamine 3000)"으로 구성되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Trypan blue (0.4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15250061</td><td></td></tr><tr><td>동결 피질 세포용 세척 매체&nbsp;</td><td></td><td></td><td>25 mL DMEM, 250 &micro 보충; L 열 비활성화 소 태아 혈청 + 12.5 &마이크로; L 페니실린 스트렙토마이신.</td></tr><tr><td>Wistar 쥐</td><td>일본 SLC, Inc</td><td></td><td>임신 쥐 (E18)</td></tr></tbody></table>

로컬 ca2 + 신호 막 대상 ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

칼슘 이온 (캘리포니아2 +)은 다양 한 생물 학적 출력으로 이어지는 여러 개의 신호 경로 드라이브 보편적인 세포내 메신저 분자 이다. 두 캘리포니아2 + 신호 소스 조정-"Ca2 + 유입"에서 셀 외부 "캘리포니아2 + 릴리스"에서 세포내 Ca2 + 저장 바인딩과 그물 (ER)-기초 캘리포니아의 다양 한 spatio 시간적 패턴으로 간주 됩니다 2 + 셀에서 여러 생물 학적 기능을 일으키는 원인이 되는 신호. 이 프로토콜의 목적은 설명 새로운 Ca2 + 이미징 방법 "캘리포니아2 + 유입"와 "캘리포니아2 + 릴리스" 순간의 모니터링 하는 것입니다. OER-GCaMP6f는 유전으로 인코딩된 Ca2 + 표시기 (GECI) 구성 된 GCaMP6f는 응급실 외부 막에 대상 이다. OER-GCaMP6f Ca2 + 출시 기존의 GCaMP6f 보다 더 높은 시간 해상도 모니터링할 수 있습니다. 원형질 막 대상 GECIs와 결합, subcellular 해상도 spatio 시간적 캘리포니아2 + 신호 패턴을 설명할 수 있습니다. Subcellular 대상 Ca2 + 지표 설명, 원리, 모든 세포 유형에 사용할 수 있는에 vivo에서에 이미지 꼬마 선 충 의입니다. 이 프로토콜에서 우리 세포, 뉴런, 그리고 해리 주 문화, glial 세포에서 캘리포니아2 + 영상 셀에 소개 하 고 쥐 대뇌 피 질의 뉴런의 냉동된 재고의 준비를 설명.

Lck-RCaMP2 및 GCaMP6f OER HeLa 세포에 표현 했다 고 두 신호가 동시에 이미지 분할 광학, transfection (그림 3A 및 비디오 1) 후 24 h를 사용 하 여 기록 되었다. 이미지 10 Hz. 히 스타 민 (그의 1 µ M), 캘리포니아2 + 출시는 응급실에서 유도, 녹음 하는 동안 추가 되었다에 취득 했다. 그의 응용 프로그램에 따라 Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 신호 강도 증가, δ/F0, 초기 형광 강도 (그림 3B)에서 변화를 나타내는 모조 색상 표시에 의해 표시 된 것 처럼. 캘리포니아2 + 상승 (δ/F0)의 시간 과정 보고 Lck-RCaMP2 및 GCaMP6f OER (ROI) (그림 3C)의 같은 지역에 비교 되었다. Δ/F0 값 그들의 피크 값을 다른 식 수준 및 분포는 두 개의 다른 GECIs 사이 시간 과정 비교로 정규화 되었다. 두 센서 발진 같은 Ca2 + 고도 보고. Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f 5 셀 종류 중에서 두 개의 셀에 캘리포니아2 + 상승에 대 한 동일한 시간 과정을 보여주었다 (그림 3C, 투자 수익 1 및 3)을 검사 합니다. 그러나, 캘리포니아2 + 고도 Lck-RCaMP2에 의해 표시 된 OER-GCaMP6f (그림 3 C, 2, 4, 및 5 ROI) 표시에 비해 더 높은 수준에 남아 있었다. 결과 종료 이전 응급실, 주위는 그의 자극에 의해 유도 된이 Ca2 + 신호 소스 동안 Ca2 + 상승 원형질 막 주변 장기를 나타냅니다.
자연 스러운 캘리포니아2 + 쥐 된 (그림 4A)에서 문화 혼합 신경 사이토에 이다에서 신호 및 이르렀다는 (그림 4B) Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f (그림 4, 비디오 2, 비디오 3에 의해 보였다 , 동영상 4, 및 비디오 5). 대뇌 피 질의 문화는이 프로토콜에 설명 된 대로 준비 된 냉동된 주식에서 부활 했다. Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 신호는 동일한 셀에서 2 Hz에서 순차적으로 기록 되었다. 3 ROIs 각 GECI, 캘리포니아2 + 고도 지역에 선정 됐다 고 δ/F기본 (즉, 형광 강도)의 시간 과정 (F기본 전체 녹음 기간 동안 평균 형광 강도 변경 ). 초기 형광 안정적 이며 캘리포니아2 + 고도 보다 적게 빈번한, F기본 Ca2 + 상승 이벤트를 감지 하는 유용한 기준 된다. 자연 스러운 캘리포니아2 + 고도 astrocytic 과정에서 세포 체에서 볼 수 있었다. 이 결과 astrocytic 자발적인 Ca2 + 신호 다른 GECIs 시각화 된 생체 외에서13 그리고 vivo에서14에 의해 이전 보고서와 일치. Hippocampal와 대뇌 피 질의 이다에서 캘리포니아2 + 고도 Lck-RCaMP2 (위)에 의해 표시 된 사이트-GCaMP6f에 의해 표시 된 것 보다 더 자주 했다. 이 결과 Lck GCaMP6f 때문 이다에서 캘리포니아2 + 고도 OER GCaMP6f7 때문에 그들 보다 더 자주 검색 된 우리의 이전 데모와 일치 하 고이 개념은 또한에서 적용 된 단일 셀 수준입니다.
자발적인 캘리포니아2 + 고도 Lck-GCaMP6f에 의해 미 성숙한 쥐 hippocampal 신경 (10 DIV)에서 2 Hz (그림 5A 및 비디오 6)에서 볼 수 있었다. 5 다른 ROIs에 δ/F0의 시간 과정 캘리포니아2 + 도 이러한 subcellular 도메인에 국한 로컬로 것이 좋습니다. 그림 5B (비디오 7) Ca2 + 응답 성숙한 마우스 hippocampal 신경 (30 DIV)에 감염 된 사이트-GCaMP6f-식 AAV 벡터를 보여준다. 신경 세포는 100 µ M는 주 작동 근 metabotropic 글루타민 산 염 수용 체에 대 한 유도 하는 캘리포니아2 + 버전은 DHPG으로 자극 했다. DHPG 유도 캘리포니아2 + 릴리스 OER-GCaMP6f로 검색 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> 그림 1: 막 대상 GECIs를 보여주는 다이어그램. 원형질 막 대상 GECIs (Lck-GCaMP6f 및 RCaMP2 Lck) 및 외부 응급실의 회로도 막 대상 GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> 그림 2: hippocampal 및 대뇌 피 질의 세포 준비, 플라스 미드 transfection 그리고 AAV 감염에 대 한 순서도. 미세한 이미지는 대표, 갓 도금된 DIV 6 대뇌 피 질의 세포 (왼쪽) 및 냉동된 주식 (오른쪽)에서 세포를 부활. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> 그림 3: Lck RCaMP2 그리고 HeLa 세포에 OER-GCaMP6f의 동시 이미징의 예. (A) 이미지 분할 광학 신호 분리의 도식 적인 표현입니다. Lck RCaMP2 및 사이트-GCaMP6f에 대 한 보기의 동일한 필드 카메라에 동시에 예상 된다. CMOS 카메라 10 Hz에서 인수 대표 녹음 비디오 1, 제공 되 고이 녹음의 한 프레임 (오른쪽) 패널 A 에 표시 됩니다. (B) δ/F0 Lck-GCaMP2 (맨 위) 및 사이트-GCaMP6f (아래)의 의사 컬러 이미지. (그의 1 µ M) 히 스타 민 Lck-GCaMP2 (마젠타색) 및 사이트-GCaMP6f (녹색)의 정규화 된 δ/F0 시간 과정 0 미 (C) 대표에 추가 되었습니다. 데이터는 각 플롯에 대 한 최대 δ/F0 값으로 정규화 되었다. 회색 막대는 그의 응용 프로그램의 타이밍을 나타냅니다. 데이터 맞춤 소프트웨어 TI 작업 대15로 분석 되었다. 눈금 막대 = 50 µ m (미세한 이미지).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> 그림 4: 자연 스러운 캘리포니아2 + 상승 Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 식에 대 한 모니터링 이다에서. (A) 대표 hippocampal 고 Lck-RCaMP2 (맨 위)와 OER-GCaMP6f (아래) 페 (B) 피 질 이다. 대뇌 피 질의 세포 냉동된 주식 문화에서 부활 했다. Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 이미지 순차적으로 동일한 셀, 2 Hz, EM-CCD 카메라와 함께 인수 했다. 왼쪽된 표시는 ROIs δ/Fbase의 시간 과정 측정에 플롯 현미경 이미지에 표시 된. 데이터는 TI 워크 벤치로 분석 되었다. 실제 영화 비디오 2 동영상 3 동영상 4, 비디오 5에서 제공 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m (미세한 이미지). 베이스 라인 드리프트 셀의 글로벌 Ca2 + 수준에서 변경 내용을 제안합니다.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> OER-GCaMP6f Lck GCaMP6f와 신경에 캘리포니아2 + 영상의 그림 5: 예. (A) 대표 쥐 hippocampal 신경 Lck-GCaMP6f 사업부 10 (왼쪽)와 플롯 (오른쪽) 이미지에 δ/F0 ROIs (노란색 동그라미)에 측정의 과정 표시 된 시간을 보여주는 표현 시간 과정에 있는 숫자는 이미지에 투자 수익 번호에 해당합니다. 캘리포니아2 + 상승의 시간적 패턴은 관심의 다양 한 지역 중 다른 note. 베이스 라인 드리프트가이 신경의 글로벌 Ca2 + 수준에 증가 제안합니다. (B) 성숙한 마우스 hippocampal 신경 (DIV 30) OER GCaMP6f 식 AAV 벡터 (왼쪽)와 감염의 예. Δ/F0 측정의 과정 플롯 보여주는 100 μ m Ca2 + 응답 시간 (RS)-3, 5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) 회색 막대로 표시 된 타이밍에 적용. 노란 동그라미 시간 코스를 얻어 ROIs의 위치를 표시 합니다. 이미지 냉각 CCD 카메라 (패널 A) 또는 EM-CCD 카메라 (패널 B) 2 Hz에 인수 되었고 티 워크 벤치와 분석. 눈금 막대 = 20 µ m (미세한 이미지). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> 비디오 1: Lck RCaMP2 그리고 HeLa 세포에 OER-GCaMP6f의 동시 이미징의 예. 대표적인 녹음 10 Hz에서 취득 하 고 그림 3에 제시. 눈금 막대 = 50 µ m.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> 비디오 2: 자연 스러운 캘리포니아2 + 과도 관찰 Lck RCaMP2 hippocampal 사이토에. 2 Hz (그림 4A)에서 인수 하는 대표적인 녹음 비디오3 보기의 동일한 필드에 기록. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> 비디오 3: 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰 OER GCaMP6f hippocampal 사이토에. 대표 녹화 비디오 2로 보기의 동일한 필드에 2 Hz (그림 4A)에서 인수. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> 비디오 4: 대뇌 피 질의 사이토에 Lck-RCaMP2에서 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰 2 Hz (그림 4B)에서 인수 하는 대표적인 녹음 비디오5 보기의 동일한 필드에 기록. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> 비디오 5: 대뇌 피 질의 사이토에 OER-GCaMP6f에서 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰. 대표 녹화 비디오4 보기의 동일한 필드에 2 Hz (그림 4B)에서 인수. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Lck-GCaMP6f에 의해 쥐 hippocampal 신경 (DIV 10)에 캘리포니아2 + 영상의 비디오 6: 예. 신경 캘리포니아2 + 의 예 2 Hz (그림 5A)에 기록 된 신호. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> 비디오 7: 캘리포니아2 + 릴리스 마우스 hippocampal 신경 (DIV 30) 표현 OER-GCaMP6f. 신경 캘리포니아2 + 신호 예제 사이트 GCaMP6f 식 AAV 벡터 (그림 5B)와 감염 마우스 hippocampal 신경에 기록. 30에 있는 100 µ M dihydroxyphenylglycine (DHPG)으로 신경 자극 했다 캘리포니아2 + 출시는 응급실에서 연상 s. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

세포 내 분해능에서 칼슘 신호의 해부는 생체 학적 현상을 결정하는 세포 내 칼슘 신호를 해독하기 위한 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜은 칼슘 유입 과 칼슘 방출의 바로 그 순간의 모니터링을 가능하게 하는 새로운 칼슘 화상 진찰 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표의 발현을 허용하는 모든 세포 유형에 적용됩니다.우리는 우리의 방법이 실험실 문화에 있는 살아있는 동물에 있는 세포 분해능에 칼슘 신호의 해부로 확장될 가능성이 있다는 것을 믿습니다. 이 절차를 입증하는 데 도움이 되는 것은 실험실의 기술자인 히로즈 마쓰미입니다. 이 절차를 시작하려면 12 웰 플레이트의 각 웰에 18 밀리미터 직경유리 커버 슬립을 놓습니다.살균된 물을 사용하고 사용 중인 12개의 웰 플레이트당 0.4%의 PEI 용액을 12.5밀리리터를 준비합니다. PEI 솔루션 의 밀리리터 를 각 웰에 추가하고 커버 전표 아래에 거품이 없는지 확인합니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 밤동안 37도의 인큐베이터에 배양하십시오.다음 날, PEI 솔루션을 제거하기 위해 흡인기를 사용합니다. 각 우물에 살균 된 물 1 밀리리터를 추가하고 덮개 슬립과 플레이트 사이의 PEI 용액이 철저히 씻겨 되도록 접시를 흔들어줍니다. 이 세척 과정을 신선한 살균 물로 2회 추가로 반복하십시오.마지막 세척 후, 완전히 각 에서 물을 흡인. 후드 내부에는 자외선을 사용하여 뚜껑 전표를 15분 이상 건조하고 살균합니다. PEI 코팅 요리는 최대 2개월 동안 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다.진행 준비를 마쳤을 때, 사용하기 직전에 자외선으로 요리를 15분 동안 조명하십시오. 배양 배지의 증발을 방지하기 위해 우물 사이의 공간에 멸균 증류수 5밀리리터를 첨가합니다. 먼저, 인큐베이션 식염수로 코르티스를 씻으시다.그런 다음 트립신과 DNAse로 코르티치를 37도에서 5분간 인큐베이션 식염수로 배양합니다. 그런 다음, 얼음 차가운 인큐베이션 식염수로 코르티스를 세 번 씻는다. 상체를 제거하고 DNAse I 재고의 150 마이크로 리터로 보충 도금 매체의 두 밀리리터를 추가합니다.20배 이하의 파이프를 통해 세포를 해리시키고 70마이크로미터의 모공 크기로 세포 여과기를 통해 세포를 필터링한다. 다음으로, 도금 매체의 20 밀리리터로 셀 스트레이너를 씻는다. 냉동 셀 스톡의 제조를 위해, 세척 매체의 20 밀리리터로 세포를 씻으라.밀리리터 당 140 000 실행 가능한 세포의 밀도로 도금 매체로 피질 세포를 희석시. 이어서, 12개의 웰 배양 판에 PEI 코팅 커버 슬립에 희석셀 현탁액1밀리리터를 첨가한다. 2 ~3 일 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 유지하십시오.세포가 안정되면, 도금 후 2~3일, 배양 배지를 유지보수 매체로 변경한다. 냉동 셀 스톡의 제조를 위해, 3 분 동안 187 배 G에서 세포를 원심 분리하는 스윙 로터를 사용하여 셀아래로 회전하십시오. 상체를 흡인하고 냉동 보존 배지를 추가하여 섭씨 4도에 보관하여 밀리리터당 1,000만 개의 세포 밀도를 얻습니다.극저온 튜브에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 알리쿼트. 영하 80도의 온도에 도달 할 때까지, 분당 영하 1도의 동결 속도와 셀 동결 용기에 튜브를 배치합니다. 냉동 용기는 영하 80도에서 냉동고로 옮춥습니다.냉동 된 세포를 부활하려면, 냉동 피질 셀에 대한 세척 매체및 유지 보수 매체를 미리 따뜻하게. 다음으로, 냉동 된 세포를 37섭씨에서 수조에서 빠르게 해동하십시오. 3분 동안 187회 G의 스윙 로터로 미리 데워진 세척 매체와 원심분리기로 세포를 부드럽게 희석시.세척 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 실행 가능한 세포 밀도를 측정합니다. 이어서, 냉동 피질 세포에 대한 유지 보수 배지로 세포를 희석하고, 밀리리터당 300 000 세포의 세포 밀도를 산출한다. PEI 코팅 12 웰 플레이트의 우물에이 세포 현탁액의 Cede 1 밀리리터.도금 후 3~8일 간 트랜스펙트의 경우, 플라즈마 DNA용, 다른 하나는 형질 검사 시약용 2개의 튜브에 라벨을 붙입니다. 각 튜브에 잘 당 50 마이크로 리터의 감소 된 혈청 배지를 추가합니다. 커버 슬립 당 혈장 DNA의 0.5 마이크로 그램과 뉴런에 대한 트랜스펙트 시약을 동반 보충의 마이크로 리터, 플라즈마 DNA 튜브에 잘 당 추가합니다.Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 공동 변환을 위해 각 플라스미드의 0.5 마이크로그램과 1마이크로리터의 보충제를 잘 당 50 마이크로리터에 섞는다. 다음으로, 경질 시약 튜브에 잘 당 형질 전환 시약의 마이크로 리터 를 추가합니다. 1~2초 동안 두 튜브를 소용돌이시다.그런 다음, DNA 혼합물에 경전 시약 혼합물을 추가한다. 부드럽게 파이펫을 사용하여 실온에서 5분간 혼합하고 배양합니다. 이 혼합물을 드롭-현명한 방식으로 셀에 적재합니다.마커 단백질이 발현될 때까지 2~3일 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 배양한다. AAC 감염을 만들기 위해 L과 O를 혼합합니다. 혼합 된 신경 성상세포 문화에 잘 당 AAC의 3 개의 마이크로 리터를 추가합니다.부드럽게 혼합 접시를 흔들어. GECI가 표현될 때까지 1~2주 동안 문화를 유지한다. 먼저 Lck-RCaMP2 및 OER-CaMPG6f로 감염된 세포를 포함하는 커버 슬립을 현미경의 기록 챔버에 장착합니다.이미징 배지의 마이크로리터 400기를 추가하고 챔버 위에 뚜껑을 놓습니다. GCaMP6f 및 광원에 대한 필터 세트를 선택합니다. OER-GCaMP6f를 표현하는 성상세포를 찾습니다.다음으로 RCaMP2의 필터 세트 및 광원을 선택하고 Lck-RCaMP2가 동일한 성상세포로 표현되는지 확인합니다. 2분 동안 두 Hertz에서 Lck-RCaMP2의 시간 경과 이미지를 기록하고 이미징 데이터를 저장합니다. 그런 다음 GCaMP6f의 필터 집합을 다시 변경합니다.2분 동안 두 Hertz에서 OER-GCaMP6f의 시간 경과 이미지를 기록하고 이미징 데이터를 저장합니다. 이 연구에서는 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f가 HeLa 세포에서 발현되며 두 신호모두 회전 후 24시간 광학을 분할하는 영상을 사용하여 동시에 기록되었다. 히스타민이 추가되면서 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 신호 강도가 증가했습니다.Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f에 의해 보고된 칼슘 이온 고도의 시간 과정은 관심의 동일 지구에서 비교됩니다. 두 센서 모두 진동과 같은 칼슘 이온 고도를 보고합니다. 그리고 둘 다 검사된 5개의 세포의 2에서 동일 시간 과정을 보여줍니다.그러나, Lck-RCaMP2에 의해 표시된 칼슘 이온 고도는 그밖 세포에 있는 OER-GCaMP6f 보다는 더 높은 수준에 남아 있습니다. 이러한 결과는 혈장 막 부근에서 칼슘 이온 고도가 연장되어 히스타민 자극에 의해 유도된 이 칼슘 이온 신호의 근원인 ER 주위에서 일찍 종료된다는 것을 나타낸다. 쥐 해마와 코르티체에서 뉴런 성상세포 혼합 배양에서 성상세포에서 자발적인 칼슘 이온 신호는 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f에 의해 표시됩니다.자발적인 칼슘 이온 고도는 이전 보고서와 일치하는 세포 본체가 아닌 성상세포 공정에서만 볼 수 있습니다. 미성숙한 쥐 해마 뉴런에서 Lck-GCaMP6f에 의한 자발적인 칼슘 이온 고도는 두 헤르츠에서 볼 수 있습니다. 관심 있는 5개 영역의 시간 과정은 이러한 고도가 로컬로 셀룰러 하위 도메인에 국한되어 있음을 시사합니다.OER-GCaMP6f 발현 AAV 벡터에 감염된 성숙한 마우스 해마 뉴런은 DHPG의 첨가에 응하여 칼슘 이온 반응을 나타낸다. 칼슘 이미징의 경우, 흥분 발광 력이 가장 중요한 요소입니다. 사진 표백및 사진 독성을 피하기 위해 흥분빛을 가능한 한 낮게 유지하십시오.칼슘 신호의 근원은 칼슘 채널에 특정 억제제를 사용하여 Pomakorzi에 의해 추가로 확인될 수 있습니다. 특정 출력을 연상시키는 칼슘 신호를 해독하는 것은 근본적인 생물학적 질문이었습니다. 이 칼슘 이미징 기술은 세포 내 칼슘 신호의 다양성을 설명하는 길을 열어줍니다.

dissection-local-ca2-signals-cultured-cells-membrane-targeted-ca2

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

endoplasmic reticulum은 단백질 biogenesis과 칼슘 항상성에 중요한 역할을합니다. 우리는 우리 Ca2 + 누출 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘을 특징 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA 중재 유전자 입을 라이브 세포 Ca2 + 이미징을 포함한다.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

친 유성 염료 FM1-43에 노출 된 세포의 라이브 영상은 기공 형성 독소는 세포막에서 제거되는 반응 속도의 정밀한 결정을 허용한다. 이것은 CA에 대한 요구 사항이 +, sphingomyelinase 및 세포막 수리 및 다른 인자를 평가하는 데 사용될 수있는 민감한 분석이다.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 2 + 신호.

측정 공간적 칼슘 2 + 신호

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

이 문서는 하나 이상의 플라즈마 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 (GSD) 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 세포 막 단백질의 검출에 대 한 프로토콜을 설명. 여기, 우리 토론 혜택과 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 이러한 접근을 사용 하 여 고려 사항.

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

유전자 인코딩된 Ca2 + 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아2 + 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아2 + 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아2 + 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

여기에서는 형광 현미경을 사용하여 원발성 쥐 및 인간 T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인으로 알려진 초기 국소 Ca2+ 신호를 분석하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 면역 세포 내의 Ca2+ 신호 경로를 조사하고 그 기능을 더 자세히 밝히는 데 귀중한 리소스 역할을 합니다.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

학습하세요 신경세포와 신경교세포에서 유전자 인코딩 칼슘 지표를 이용한 고해상도 칼슘 이미징 프로토콜을 통해 세포내 신호 전달 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.

로컬 Ca^{2 +} 신호 막 대상 Ca^{2 +} 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

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