Name: Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 배우세요 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서 뇌혈관 단위 손상과 혈뇌장벽 투과성을 평가하는 방법을 C57-Black/6 마우스를 이용하여. 이 기법은 다발성경화증 연구에 활용됩니다.

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우리는 기꺼이 우리와 함께 그녀의 원래 제자리에 zymography 프로토콜10 공유는 리 디 아 Sorokin 인정 합니다.

모든 연구 동물의 보호에 스위스 법률에 따라 지침에 따라 실시 했다 고 구획의 베른, 스위스의 수의 사무실에 의해 승인 (허가 번호: 31/17 수 고 수 77/18).
1. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 C57BL/6 마우스의 주택
<ol><li>집 쥐 개별 환기 케이지 12/12 h 빛-어둠에에서 주기. 음식을 제공 하 고 광고 libidum 물. 쥐의 미생물 품질 감독, 실험 코 호트 분기 상태 모니터링 더러운 침구 넬 FELASA 추천13다음으로 받았다.</li>
	<li>개별적으로 마크 8-12 주 오래 된 여성 C57BL/6 쥐 귀 펀치를 사용 합니다.</li>
</ol>2입니다. C57BL/6 마우스의 면역
<ol><li>솔루션14의 준비:<ol>
<li>대 한 완전 한 Freund의 보조 제 (CFA), 혼합 갓 pestled 열 120 mg와 불완전 한 Freund의 보조의 30 mL 비활성화 증기 두건에서 결핵균 (H37RA). 4 ° c.에 게 재고 솔루션</li>
		<li>MOGaa35-55-펩타이드 재고 솔루션에 대 한 MOGaa35-55-펩타이드 살 균 PBS (4 mg/mL)에 녹이 고-80 ° c.에 저장</li>
		<li>집 고 양이 유제 준비:<ol>
<li>CFA 1:2 2 mL microtube MOG 펩타이드 재고 솔루션을 희석.</li>
			<li>microtube 씰링 필름으로 밀봉 하 고 완전히 접착 테이프를 가진 튜브를 취재 하 여 소용돌이 믹서에 수정. 4 h 4 ° c.에 대 한 소용돌이 유제</li>
		</ol>
</li>
		<li>안정 된 에멀젼과 주사기를 준비:<ol>
<li>microtube 하 고 신속 하 게 작은 테이블 원심 분리기를 사용 하 여 유제 아래로 회전. 18G x 1½' (1.2 m m x 40 m m) 주사 바늘을 사용 하 여 주사기로 유제를 수집 합니다.</li>
			<li>쥐의 수에 따라 주사기 (100 µ L/마우스)에서 에멀젼 볼륨을 조정 하 고 18 G 바늘 27G x ¾' (0.4 m m x 19 m m) 주사 바늘으로 교체. 씰링 필름으로 주사기에 연결 된 주사 바늘을 봉인.</li>
		</ol>
</li>
		<li>백 일 해 독 소 (PTx) 재고 솔루션에 대 한 분해 살 균 PBS의 500 µ L에 동결 건조 된 PTx의 50 µ g (100 ng / µ L). 4 ° c.에 게 재고 솔루션</li>
		<li>PTx 작업 솔루션에 대 한 살 균 PBS의 97 µ L 3 µ L 마우스 (용 복 주사 바늘 30G x ½' (0.3 m m x 13 m m)) 당 PTx 재고 솔루션 (300 ng/100 µ L)의 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EAE 유도<ol>
<li>C57BL/6 마우스 기화 기 시스템을 사용 하 여 isofluorane와 anesthetize. 마우스 마 취 유도, 2.1 %isofluorane 안 면을 마우스를 전송 하기 전에 마우스는 작은 인큐베이션 챔버에 산소에 4.5 %isofluorane 노출. 패드 난방 장치를 갖추고 마 취 단위를 사용 하 여 마우스의 저체온증을 방지 하기 위해.</li>
		<li>한 손으로 마 취 마우스를 수정 하 고 먼저 뒷 다리 측면에 MOG35-55/CFA-유제의 30 µ L를 피하 주사 (그림 1: 1 + 2; 총 60 µ L, 왼쪽 측면 30 µ L과 오른쪽 측면 30 µ L) 사 타 구니 림프절에 가까운.</li>
		<li>마우스는 배꼽에 놓고 꼬리 루트에서 왼쪽 및 오른쪽 소프트 지방 조직으로 MOGaa35-55/CFA-유제의 20 µ L를 주사 (그림 1: 3 + 4; 40 µ L 총; 왼쪽 꼬리 루트 20 µ L와 오른쪽 꼬리 루트 20 µ L)와 MOGaa35-55/CFA-유제 int의 작은 방울 o 마우스의 목 (그림 1: 5).</li>
		<li>마우스에 intraperitoneally PTx 솔루션의 100 µ L를 주입 수 있습니다. 소장으로 주사를 피하는 몸 센터 아래 마우스의 머리를 잡으십시오.</li>
		<li>유지 다이어트를 대체 (한다 주요 영양소: 조 단백질 18.5%, 조 지방 4.5%, 조 섬유 4.5%, 원유 재 6.5%; 전 분 35%, 대사 에너지: 13.1 MJ/kg) 다이어트를 번 식 하 (한다 주요 영양소: 조 단백질 23.5%, 조 지방 5.5%, 조 섬유 3%; 원유 재 5.7%; 전 분 36%; 대사 에너지: 14.3 MJ/kg) 전에, 예상된 임상 질병 중 쥐 높은 에너지 콘텐츠는 음식 제공.</li>
		<li>얼굴 마스크를 제거 하 고 지구 온난화 패드의 홈 케이지를 마우스를 전송. 마우스는 완전히 깨어 운동 10 분 후에 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>PTx 주사 (2.2.4) 48 h 첫 번째 치료 후 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 점수 EAE 쥐의
<ol><li>감 금 소 내 통해 매일 아침 EAE 쥐의 건강 상태를 확인 하십시오.</li>
	<li>EAE 쥐 매일 오후 점수.</li>
	<li>꼬리에 tonus는 손가락으로 위쪽으로 이동 하 여 감 금 소 및 확인 EAE 실험에 포함 된 모든 개별 마우스를 가져가 라. 건강 한 마우스 꼬리를 유지할 것 이다 (꼬리는 tonus는). 임상 EAE 시작 했다 꼬리 tonus 낮은, 꼬리의 점진적 하락으로 표시 될 것입니다. 결국 마우스에 꼬리 리프트 수 없습니다.</li>
	<li>깨끗 한 벤치에 EAE 실험에 포함 된 모든 개별 마우스 관찰 하 고 걷는 동작을 문서화. 질병의 심각도 평가 기준 점수 표 115 참조 (EAE 점수).</li>
	<li>평가 하는 실험에 포함 된 모든 마우스의 무게를 문서화 합니다.</li>
	<li>마우스 임상 EAE를 표시 하 여 적절 한 음식과 물 통풍 관을 위해 1의 점수는 감 금 소의 바닥에 플라스틱 접시에 moistened 식품을 공급 하 고 매일 새로 고침.</li>
</ol>4. vivo에서 침투성 분석 결과
<ol><li>솔루션의 준비:<ol>
<li>Dextran 재고 솔루션, 0.9% 염화 나트륨 용액 (20 mg/mL)의 500 µ L에서 3 kDa Dextran 텍사스 레드 10 kDa Dextran 알 렉 사 Fluor 488의 10 mg을 디졸브.</li>
		<li>Dextran 작업 솔루션에 대 한 주입 피펫으로 55 µ L 10 kDa Dextran 알 렉 사 Fluor 488의 전에 영화 씰링의 조각에 솔루션 (20 mg/mL)을 재고 하 고 3 kDa dextran 텍사스 레드 재고 솔루션 (20 mg/mL)의 55 µ L를 추가 합니다. 혼합 및 일회용 미세 주사기 (최종 농도 2 mg/100 µ L)으로 100 µ L를 수집 합니다.</li>
		<li>10% 포름알데히드 (PFA) 재고 솔루션에 대 한 결합 10 g 100 mL PBS의 여분의 퓨어 파우더 PFA, 깨끗 한 유리 비이 커에 정확 하 게 56 ° C에서 자력;를 사용 하 여 교 반까지 열 1N NaOH의 200 µ L의 PFA는 완전히 해산; 때까지 30 분 동안 56 ° C에서 유지 실내 온도;에 진정 pH 7.4;를 조정합니다 고 종이 필터를 통해 필터링 합니다. -20 ° c.에 게 PBS를 사용 하 여 추가 재고 솔루션을 희석 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>곧 건강 한 C57BL/6 쥐 또는 C57BL/6 마우스 (마우스는 약 1 분 동안 진정 될 것입니다) isoflurane EAE에서 고통 anesthetize. 2.2.1 (쥐 4.5 %isoflurane 유도 실에서 산소에서에 노출 되며 2.1 %isoflurane 안 면을 전송) 단계에서 자동화 된 시스템을 사용 합니다.</li>
	<li>마 취 마우스 위치에 배치 측면, 테이블에 다음 정 맥 (예: 복고풍 orbitally) 형광 추적기의 100 µ L을 마우스 주입 전에 마우스 깨어나면.</li>
	<li>바로 안 면을 제거 하 고 마우스는 완전히 깨어 메구미 짧은 마 취 후 다는 것을 확인 한다. 15 분 순환 추적 하자.</li>
	<li>5.1 단계 진행.</li>
</ol>5입니다. 마우스의 관류
<ol><li>
Vivo에서 침투성 평가:
	<ol>
<li>깊은 isoflurane 마 취 유도 형광 추적 프로그램 삽입 후 15 분 절차를 시작 합니다. 유도 하기 위해 쥐에 깊은 마 취 산소에서 isoflurane의 2.3%를 사용 합니다. 발 철수 반사를 사용 하 여 마 취의 깊이 판단 (발가락 사이 피부를 꼬집어, 굴곡의 부족 충분 한 깊이 나타냅니다), forelimb와 쥐 EAE 대상이 hindlimb의 반사를 조사 하 고.</li>
		<li>그것의 뒤에 마우스를 해결 하 고 에탄올으로 배를 살포. 한가 위를 사용 하 여 가슴 열고 막 제거 합니다. 한가 위를 사용 하 여 뛰는 심장의 오른쪽 아 트리 움 열고 뒤에 4%의 10 mL PBS의 10 mL와 함께 심장의 좌 심 실을 통해 마우스 perfuse PFA PBS에. 주의: PFA 흡입을 방지 하는 증기 두건에서 마우스 perfuse.</li>
		<li>섹션 6로 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제자리에서 zymography에 대 한:
	<ol>
<li>EAE에서 고통을 마우스에 산소에 2.3 %isoflurane 사용 하 여 깊은 isoflurane 마 취를 유발 하 고 단계 5.1.1에서 마 취의 깊이 확인.</li>
		<li>다음, 그것의 뒤에 마우스를 해결 하 고 에탄올으로 배를 살포. 한가 위를 사용 하 여 가슴 열고 막 제거 합니다. 한가 위를 사용 하 여 뛰는 심장의 오른쪽 아 트리 움 열고 PBS의 20 mL와 함께 심장의 좌 심 실을 통해 마우스를 perfuse.</li>
		<li>섹션 6로 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 해 부와 두뇌의
<ol><li>냉각 목욕의 준비:<ol>
<li>짓 눌린된 드라이 아이스와 플랫 dewar 용기와 액체 드라이 아이스 팩 위에 약 1 cm를 도달할 때까지 2-methylbutane (Isopentane) 추가. 커버는 느슨한 뚜껑-예를 들어, 얼음 양동이 커버.</li>
	</ol>
</li>
	<li>날카로운가 위 perfused 마우스의 머리 공간이 부족 잘라냅니다 고 피부와 귀가 위의 작은 세트를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>왼쪽 및 오른쪽 뇌에 upfold skullcap를 수 있도록 전면 구멍 매그넘에서 절단 하 여 신중 하 게는 skullcap를 해 부. 다음, 조심 스럽게 들어올립니다 그대로 뇌를 두개골의 기지에서 밖으로 평면 금속 주걱을 사용 하 여 광학 신경을 절단 하는 동안.</li>
	<li>알루미늄 호 일에 두뇌를 놓고 두 코로나 컷을 배치 하 여 3 개의 조각 (정면 뇌, 중간 뇌 및 소 뇌 + 뇌 줄기)에서 뇌를 잘라.</li>
	<li>Cryomold (25 m m x 20 m m x 5 m m) 1 분기에 최적의 온도 절단 (O.C.T.) 매트릭스, cryomold에 아래쪽으로 직면 하 고 각 뇌의 앞쪽 측면 뇌 조각 장소를 커버 O.C.T. 매트릭스와 완전히 조직.</li>
	<li>2 Methylbutane 목욕으로 수평 방향으로는 조직으로 cryomold를 놓고는 조직을 동결 하단에서 상단에 1 분 이내 목욕으로 전체 조직 블록을 찍기 피하 여 다는 것을 확인 합니다.</li>
	<li>저장용-80 ° c 냉동된 조직 전송 및 섹션 7 진행.</li>
</ol>7입니다. 언된 조직 단면도의 준비
<ol><li>온도-20 ° c에서 30 분 동안 cryostat-80 ° C에서 냉동된 조직에서 equilibrate</li>
	<li>Cryomold와 cryostat 조직 홀더 (-15 ° C로 설정)에 산에서 조직 블록 제거 O.C.T. 매트릭스를 사용 하 여.</li>
	<li>날카로운 메스로 cryostat의 소유자 조직 블록의 가장자리를 트림 하 고 조직 표시 될 때까지 cryostat 칼으로 20 µ m 섹션을 제거 하 여 조직 블록으로 절단 시작 합니다.</li>
	<li>
Vivo에서 BBB 침투성의 분석:
	<ol>
<li>6-10 µ m 조직 단면도 절단, 접착 유리 슬라이드에 그들을 수집 하 고 즉시 이미지 섹션 형광 현미경을 사용 하 여 커버 슬립으로 덮여.</li>
		<li>뇌 (형광 패턴 새 혈관에 대 한 관찰을 확산에 비해 비 새는 혈관의 날카로운 주의)에서 혈관의 모양을 평가 합니다. 긍정적인 컨트롤로 circumventricular 장기 또는 부족 한 BBB 맥락 막 신경 총의 기질에는 추적의 누설을 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제자리에서 zymography에 대 한:
	<ol>
<li>6 µ m 조직 단면도 cryostat를 사용 하 여 절단, 접착 유리 슬라이드에 그들을 수집 하 고 동결 조직 섹션-20 ° c에서 냉동 상자 뚜껑에 실리 카 젤을 포함 하.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 현장에서 zymography laminin/CD45 면역 형광 얼룩과 결합
<ol><li>솔루션을 준비:<ol>
<li>포함 한 솔루션을 준비:<ol>
<li>글리세롤 (분석 등급)의 6 g, 폴 리 (비닐 알코올)의 2.4 g, ddH2O의 6 mL과 0.2 M Tris 버퍼, pH 8의 12 mL를 혼합 하 고 실시간에 4 h에 대 한 솔루션 (자력)를 저 어</li>
			<li>솔루션 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 실시간에서 2 h 동안 휴식 그 후 50 ° C (물 탕)에 10 분에 대 한 솔루션 및 실 온에서 2700 x g에서 20 분 동안 원심 분리기를 품 어.</li>
			<li>상쾌한 고-20 ° c.에 aliquots에 고정</li>
		</ol>
</li>
		<li>차가운 젤라틴 솔루션을 준비:<ol>
<li>DdH2O의 10 ml에서 소 피부에서 차가운 젤라틴의 0.1 g을 분해.</li>
			<li>그것은 적어도 1 일 동안 담가 4 ° c.에 aliquots를 저장 하자</li>
		</ol>
</li>
		<li>준비 얼음 메탄올 (-20 ° C):<ol>
<li>Coplin jar에 100% 메탄올을 넣고-20 ° c.까지 냉각</li>
		</ol>
</li>
		<li>10% 나트륨 아 지 드 재고 솔루션을 준비:<ol>
<li>DdH2O의 10 mL를 1 g의 나트륨 아 지 드를 추가 하 고 상 온에서 저장.</li>
		</ol>
</li>
		<li>0.1% 나트륨 아 지 드 작업 솔루션을 준비:<ol>
<li>10% 나트륨 아 지 드 재고 솔루션의 1 µ L와 믹스 99 µ L의 ddH2O.</li>
		</ol>
</li>
		<li>나트륨 아 지 드 솔루션 및 저장소 100 µ L aliquots 4 ° c.에 빛에서 보호 작업의 1 mL에 돼지 피부에서 활용 된 fluorescein 염료 침묵 (DQ) 젤라틴의 1 마그네슘을 분해</li>
		<li>30 mg의 에탄올과-20 ° c.에 게 76 µ L에서 1,10 phenanthroline 토스의 분해</li>
		<li>프로 테아 제 억제 물 솔루션 x 25를 준비:<ol>
<li>DdH2O의 2 개 mL를 EDTA 무료 protease 억제제의 1 태블릿을 추가 합니다. -20 ° c.에 게</li>
		</ol>
</li>
		<li>그냥 사용 하기 전에, 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:<ol>
<li>1 mg/mL DQ 젤라틴 솔루션 13300 x g에 5 분 동안 원심</li>
			<li>DdH2O, 15 µ L 반응 버퍼 (Gelatinase/콜라 분석 결과 키트, 참조 테이블의 재료) x 10의, 20 mg/mL 차가운 젤라틴의 0.3 µ L, 1 mg/mL DQ 젤라틴의 1.5 µ L 및 프로 테아 제 억제 물 솔루션 x 25의 6 µ L의 믹스 127.2 µ L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>그냥 사용 하기 전에 phenantroline 부정적인 제어 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:<ol>
<li>DdH2O, 반응 버퍼, 20 mg/mL 차가운 젤라틴, 1 mg/mL DQ 젤라틴의 1.5 µ L, protease 억제제 EDTA 무료, x 25의 6 µ L의 0.3 µ L x 10의 15 µ L 2 M 1,10-phenantroline (MMP 억제제)의 2 µ L의 믹스 125.2 µ L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>그냥 사용 하기 전에 차가운 젤라틴 (비 형광) 부정적인 제어 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:<ol>
<li>DdH2O, 15 µ L 반응 버퍼 x 10의, 20 mg/mL 차가운 젤라틴의 0.3 µ L EDTA 무료 25 x protease 억제제의 6 µ L의 믹스 128.7 µ L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 차적인 항 체 칵테일 counterstaining, 예를 들어 위한, 0.95 µ g/mL polyclonal 토끼 안티 laminin 항 체와 10 µ g/mL PBS에 1 %BSA polyclonal 쥐 안티 CD45 항 체를 준비 하 고 적절 한 isotype 제어 1 차적인 항 체 칵테일을 준비.</li>
		<li>준비 2 차 항 체 해결책, 예를 들어 7.5 µ g/mL Cy3 염소 반대로 쥐 + 15 µ g/mL PBS에서 1 %BSA AMCA 안티 토끼 (빛에서 보호).</li>
	</ol>
</li>
	<li>피하 조직에 물을 보존 하 고 펜을 격퇴 하는 물으로 라인을 그려서 하나의 슬라이드에 2 조직 단면도 분리 하는 증기 두건에서 뚜껑에 실리 카 젤을 포함 하는 플라스틱 냉동 상자 안에 EAE 쥐에서 6 µ m 비 고정 뇌 조직 단면도 녹여</li>
	<li>반응 솔루션 (단계 8.1.9-8.1.11) 준비, 실내 온도, 그리고 사전 따뜻한 물 목욕을 사용 하 여 37 ° c에서 13,400 x g 에 5 분 동안 원심.</li>
	<li>1x 반응 버퍼를 사용 하 여 37 ° C에서 5 분에 대 한 조직 단면도 리하이드레이션 다음, 반응 버퍼 x 1 부 조직 단면도에 반응 솔루션을 추가 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 DdH2O에서 슬라이드 5 번을 씻어.</li>
	<li>-20 ° C에서 얼음 처럼 차가운 메탄올을 가진 5 분에 대 한 섹션을 수정 하 고 나중 섹션 한 번 실 온에서 PBS 씻어.</li>
	<li>섹션에 PBS에서 1 %BSA 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어 (빛에서 보호). 다음, 조직에 슬라이드를 틀 지 하 여 섹션에서 PBS에서 1 %BSA 삭제, 기본 항 체 칵테일을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어 (빛에서 보호).</li>
	<li>섹션 PBS로 두번 세척, 이차 항 체 칵테일을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어 (빛에서 보호).</li>
	<li>섹션 PBS로 두번 세척, 솔루션에 포함 된 슬라이드를 탑재, 건조 한 실 온에서 밤에 탑재 된 섹션 (빛에서 보호). 마지막으로, 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 조직 섹션 분석.</li>
</ol>

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<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+laminin+isoforms%2C+laminins+8+and+10%2C+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li>
<li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언.

여기, 선물이 유도 하 고 여성 C57BL/6 쥐에서 EAE 모니터링 프로토콜. 여성은 우선적으로 선택 하 고, 그리고 여자의 발생률: MS에서 3: 1의 남자. 우리가 만든 EAE의 심각도 평가 하기 위해 3-포인트 점수 시트의 사용. EAE 심각도 모터 장애의 심각도 관하여 일반적으로 득점 된다. 마우스와 고급 EAE의 단계, 즉 2 위 점수를 전시 동물의 불필요 한 고통을 피하기 위해 희생 되어야 한다. 따라서,는 것이 좋습니다 예: 가까운 간격으로 쥐를 득점 하는 프로토콜에 설명 된 대로 두 번 매일.  여러 개의 0-6 포인트 0-3에서 도달 점수 루틴을 고용,16,17,,1819 또는 더 많은 subpoints20포인트. 그러나, 우리는 이전 살 일...

모든 신체 및 척추 동물, 정신 기능을 조정 하는 중앙 신경 시스템 (CNS) 그리고 CNS 항상성 뉴런의 적절 한 의사 소통을 위해 필수적 이다. CNS 항상성 neurovascular 단위 (NVU) CNS의 혈 류 변화 환경에서 보호에 의해 보증 된다. NVU 2 설정 CNS microvascular 내 피 세포의 화학적 고유 하 고 지속적인 누화와 pericytes, 이다, 신경, 세포 외 기질 (ECM) 구성 요소에에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 설정, 구성 고유한 지하실 막1. 내 피 지하실 막 BBB 내 피 세포의 abluminal 측면 pericytes의 높은 수 항구 이며 laminin α4와 다른 ECM 단백질2뿐만 아니라 laminin α5는 ensheathes. 반면, parenchymal 지하실 멤브레인 laminin α1 및 laminin α2의 구성 되어 있으며 astrocytic 끝-피트에 의해 포용입니다. 사이토 끝-피트 함께 parenchymal 지하실 멤브레인 가득 척수 혈관 주위 또는 거미 막 밑 공간3에서 CNS 신경 네트워크 분리 명과 limitans를 작성 합니다. NVU의 독특한 구조 때문에 CNS에 밀매 하는 면역 세포는 다릅니다 그 주변 조직으로 면역 세포는 2 단계 과정을 필요로 하 고, 먼저 위배 내 피 BBB와 그 후에 명과 limitans CNS 실질에 도달 합니다.
다 발성 경화 증 (MS)은 CNS, 순환 하는 면역 세포의 많은 CNS 입력 한 neuroinflammation, demyelination, 및 BBB 무결성4의 초점 손실의 일반적인 neuroinflammatory 질병 이다. BBB 무결성의 손실 가돌리늄 대조 자기 공명 영상 (MRI)5시각으로 CNS 병 변 강화의 존재에 의해 나타나는 것과 같이, MS의 초기 특징입니다. Postcapillary venules;의 수준에서 발생 하는 CNS에 백혈구 넘쳐 흐름 그러나, 면역 세포 diapedesis BBB 지하실 멤브레인와 이후 폐해 장벽에에서 관련 된 정확한 메커니즘 탐험 남아 있다. 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) ms는 동물 모델 역할 하 고 MS 병 인에 대 한 우리의 현재 지식에 크게 기여 했다. 예를 들어, EAE 모델을 사용 하 여 그것 발견 되었습니다 백혈구 넘쳐 흐름 초기 캡처를 포함 한 다단계 프로세스에서 발생 하 고 풀과 P selectin 당단백질 리간드 (PSGL)-1, 같은 mucin 같은 분자에 의해 중재 단계를 압 연 integrin 종속 회사 체포와 diapedesis6관대 면 BBB 내 피 세포에서 T 세포의 크롤 링에 의해 따라.
일단 T 세포는 내 피 BBB와 내 피 지하실 막 넘어, 그들은 그들의 동족 항 원 대 식 세포 나 수지상 세포를 환자의 또는 혈관 주위 공간에 전략적으로 지역화를 발생 해야 합니다. 이 상호 작용 그 트리거 후속 메커니즘 명과 limitans7,,89통해 면역 세포의 CNS 조직 침공에 필요한 프로-염증 성 중재자의 초점 생산을 유도 합니다. 매트릭스-metalloproteinases (MMP)-2 및 MMP 9의 초점 활성화 chemokine 활성화를 유도 하는 면역에 대 한 전제 조건 인 사이토 끝-피트, 수용 체 세포 외 매트릭스의 저하로 명과 limitans에서 마이그레이션 셀은 CNS 실질 EAE10,11의 임상 증상의 발병을 유도 하 고.
BBB와 면역 세포를 침투 하는 CNS의 탐지를 결합 하 여 CNS 조직 섹션에서 누설 및 gelatinase 활동 neuroinflammation의 맥락에서 내 피 및 폐해 장벽의 기능 무결성에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 최근 내 피 꽉 접합 분자 접합 접착 분자 (잼)의 제정 손실 조사-B 면역 세포 EAE의 맥락에서 CNS에 인신 매매. 건강 한 야생-타입 C57BL/6 마우스에 비해, vivo에서 침투성 평가 생 뿐만 아니라 외 인 추적기12를 사용 하 여 같이 건강 한 잼-B-결핍 littermates BBB 무결성의 아무 장애를 보였다. EAE의 맥락에서 잼 B 불충분 한 C57BL/6 마우스 환자 및 혈관 주위 공간12염증 성 세포 트래핑와 연결 했다 ameliorated 질병 증상을 보였다. 이 현상 검사 우리가 적용 현장에서 zymography, 잼-B-불충분 한 쥐에 gelatinase 활동의 부족은 면역 세포 위반 수의 감소 된 숫자에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 하는 경우 테스트 하기 위해 gelatinase 활동의 식별을 허용 합니다 명과 limitans12.
가용성을 감안할 때 다른 유전자 수정 마우스 모델 부족, 예를 들어, BBB 기능에 변화를 일으킬 수 있는 다른 BBB 꽉 접합 분자 BBB 무결성 조사 방법론은 중요 하다. 또한, 새로 개발된 된 약물 NVU 장벽에 영향을 줄 수 있습니다. 여기 우리가 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)와 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법을 보여줍니다-완전 한 Freund adjuvants에서 펩 티 드 aa35-55. 우리 다음 exogenous 추적기와 gelatinase 활동의 현장에서 감지 하 여 각각 vivo에서 내 피 및 폐해 장벽 무결성을 공부 하는 방법은 NVU의 내 피 및 폐해 장벽을 통해 면역 세포 침투를 지역화 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>AMCA 항토끼 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-156-045</td><td>Store at 4 &deg; C; 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>Anti-CD45 항체 (30F11)</td><td>Pharmingen</td><td>07-1401</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>안티 라미닌 항체</td><td>DAKO</td><td>Z0097</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>사육 식품</td><td>예: PROVIMI KLIBA SA</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>개별 환기 케이지, 블루 라인 유형 II 또는 III</td><td>예: Tecniplast </td><td>1145T, 1285L</td><td></td></tr><tr><td>BSA fraction V</td><td>Applichem</td><td>A1391</td> 4°C<td>에 보관; C</td></tr><tr><td>차가운 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9391</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar + 랙</td><td>예: Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>H554.1; H552.1</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 항쥐 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-156-144</td><td>Store at 4 &deg; C; 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>커버 슬립 24 x 40 mm # 1</td><td>예 : Thermo Scientific</td><td>85-0186-00</td><td></td></tr><tr><td>Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td> <td>예 : 분자 프로브</td><td>D22910</td><td>-20 &deg에서 저장; C; 빛으로부터 보호하십시오</td></tr><tr><td>Dextran Texas Red (3000 MW)</td> <td>Invitrogen</td><td>D3328</td><td>-20 &deg에 저장; C; 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>EnzChek 젤라티나아제/콜라겐분해효소 분석 키트&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽; EnzCheck</td><td>E12055</td><td>-20 &deg에서 보관; C; 가벼운</td></tr><tr><td>암컷 C57BL/6J 마우스(8-12주)</td>에서 보호(<td>예: Janvier Labs</td><td></td><td>암컷), 8-12</td></tr>주 <tr><td>조직학 슬라이드용 냉동 상자</td>(<td>예: Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2285.1</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1&frac12); &rsquo; &rsquo; (1.2mm x 40mm) 주사 바늘</td><td>예: BD, BD Microlance 3</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>27G x &frac34; &rsquo; &rsquo; &ndash; Nr. 20 (0.4mm x 19mm) 주사 바늘</td><td>예: BD, BD Microlance 3</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>30G x &frac12; &rsquo; &rsquo; (0.3 mm x 13 mm) 주사 바늘</td><td>예: BD, BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Incomplete Freund' s 보조제 (IFA)</td> <td>예 : Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24648</td><td>Store at 4&deg; C</td></tr><tr><td>유지 보수 식품</td><td>예: PROVIMI KLIBA SA</td><td>3436</td><td></td></tr><tr><td>MOGaa35-55 펩타이드</td><td>예: -</td>80 &deg의 GenScript <td></td><td>Store; C</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (Superfrost Plus)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37RA</td><td>예: BD</td><td>231141</td><td>Store at 4 &deg; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl 0.9 %</td><td>B. 브라운</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 화합물 (Tissue-Tek )</td> <td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 30G x &frac12; &rsquo; '</td><td>B. Braun</td><td>9151125S</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>백일해 독소</td><td>예: List biological laboratories, Inc.</td><td>180</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>폴리 (비닐 알코올) (Mowiol 4-88)</td> <td>시그마 -알드리치</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 EDTA 프리 (로슈)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>4693132001</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>반발 펜, 예: DAKO Pen</td>, <td>예: DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr>, <tr><td>밀봉 필름, 예: Parafilm M</td>, 예<td>: Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr>, <tr><td>실리카겔</td>, <td>예: Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9351.1</td><td></td></tr>, <tr><td>스티치 가위</td><td>, F.S.T</td><td>15012-12</td><td></td></tr>, <tr><td>주사기 1ml</td>, <td>예: PRIMO</td><td>62.1002</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 10ml</td><td>, 예: CODAN Medical ApS</td><td>2022-05</td><td></td></tr><tr><td>기화기 시스템 Univentor 400</td><td>UNO. </td><td></td><td></td>BV</tr></tbody></table>

vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

혈관 단위 (NVU)는 혈액-뇌 장벽 (BBB), 포함 된 pericytes와 내 피 지하실 막 형성 microvascular 내 피 세포의 구성 및 명과 limitans 구성 parenchymal 지하실 막 그리고 astrocytic 끝-피드 중앙 신경 시스템 (CNS) microvessels의 abluminal 측면을 수용. CNS 유지 이외에 항상성은 NVU 면역 세포 CNS에 밀매 제어 합니다. CNS의 immunosurveillance 동안 활성화 된 림프 톨의 낮은 수 BBB 부전 또는 임상 질병을 유발 하지 않고 내 피 방 벽을 교차 수 있습니다. 대조적으로, 다 발성 경화 증 또는 그것의 동물 모델에서와 같은 neuroinflammation 동안 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 면역 세포의 많은 교차 BBB와 이후 결국 CNS 실질 도달 명과 limitans 임상 질병을 선도. 
면역 세포 마이그레이션 CNS 실질에 이렇게 독특한 분자 메커니즘을 채용 하는 NVU의 내 피와 폐해 장벽을 가로질러 순차적 마이그레이션을 포함 하는 2 단계 프로세스 이다. 만약 내 피 장벽을 가로질러 그들의 통행 다음, T 세포 발생 그들의 현지 재 gelatinases의 초점 활성화로 이어지는 후속 메커니즘을 시작할 것 이다 혈관 주위 항 원 제시 세포에 그들의 동족 항 원 하 폐해 방 벽을 교차 하 여 CNS 실질 입력 T 셀 수 있게 된다. 따라서, BBB 침투성 및 MMP 활동 EAE 동안 CNS에 면역 세포 축적에 공간 상관 관계에서 모두, 평가 NVU의 내 피와 폐해 장벽의 무결성의 손실을 지정할 수 있습니다. 
우리는 여기 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법과 이후에 BBB 침투성 생체 조건 exogenous 형광 추적기의 조합을 사용 하 여 분석 하는 방법을 보여줍니다. 우리 더 쇼, 시각화 하 고 현장에서 zymogaphy immunofluorescent stainings BBB 지하실 막과 CD45 + 침입 면역 세포의 결합에 의해 EAE 두뇌에 gelatinase 활동을 지역화 하는 방법.

C57BL/6 쥐에서 EAE의 임상 과정의 평가 질병 곡선 그림 2A 와 그림 2B에 제시 된으로 마우스 몸 무게 변화에 묘사 된 대로 발생 한다. MOGaa35-55 일반적으로 접종 하는 C57BL/6 마우스 활성 예방 접종 (그림 1A) 후 하루 10-12 주위 질환 증상을 개발 하기 시작 합니다. 일반적으로, 면역된 생쥐 유제의 주입 및 백 일 해 독 소 (그림 1B)의 첫 번째 접종 후 하루 체중의 과도 한 방울을 표시합니다. EAE 유도 후 하루 2에서에서 다음 면역된 생쥐의 몸 무게 점차 증가 질병 시작까지 몸 무게 일반적으로 임상 증상의 개발에 앞서 1 일 삭제 하 고 계속 증가에 연관 감소 하 질병 증상 (그림 1A,B)...

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

여기에서 제출된 방법은 다발성 경화증을 위한 동물 모형인 실험적인 자기 면역 뇌척수염에 있는 두뇌 장벽을 통해 면역 세포 이동의 분자 기계장치를 연구하는 것을 허용합니다. 혈액-뇌 장벽 투과성 및 매트릭스-메탈로로티즈 활성을 동시에 조사하여 뇌 조직 섹션의 면역 세포 침투에 대한 공간 상관 관계를 조사함으로써 이러한 신경 염증 성 사건을 EAE의 임상 징후와 정확하게 연관시킬 수 있습니다. 병에 걸린 마우스의 전문적인 취급은 심층적인 훈련, 뿐만 아니라 EAE의 임상 표시의 정확한 점수를 필요로 합니다.따라서 시각적 데모가 유익합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 특정 병원균 없는 조건에 보관된 C57-Black/6 마우스의 마취로 이 절차를 시작합니다. 마취 된 마우스를 한 손에 고정하고 MOG 펩티드 30 마이크로 리터를 주입하고 각 뒷다리 측면에 프룬트의 보조 에멀젼을 피하하여 잉게인 림프절과 가깝습니다.이제 마우스를 배에 놓고, 꼬리 뿌리에서 왼쪽과 오른쪽 모두에서 연지방 조직에 MOG 펩티드 에멀젼 20 마이크로리터를 주입한다. 또한 마우스의 목에 에멀젼의 작은 액적을 주입하십시오. 당면성 독소 용제 100 마이크로리터를 마우스에 회대적으로 주입하십시오.내장에 주입을 피하기 위해 신체 센터 아래 마우스의 머리를 잡아. 사육 식단으로 유지 보수 식단을 대체하여 쥐에게 예상된 임상 질환 전후 및 도중 더 높은 에너지 함량의 식품을 제공한다. 첫 번째 치료 후 48 시간 동안 등리 소 독소 주입을 반복하십시오.매일 아침 케이지 내부를 살펴서 EAE 마우스의 건강 상태를 확인하십시오. 매일 오후 EAE 마우스 점수. EAE 실험에 포함된 모든 개별 마우스를 케이지에서 꺼내 꼬리에 토누스가 있는지 확인합니다.꼬리를 손가락으로 위쪽으로 이동합니다. 건강한 마우스는 꼬리를 유지합니다. 임상 EAE가 시작된 경우 꼬리 톤은 꼬리의 점진적인 드롭으로 볼 수 있습니다.결국, 마우스는 꼬리를 전혀 들어 올릴 수 없습니다. EAE 실험에 포함된 모든 개별 마우스를 깨끗한 벤치에 배치하여 걷기 동작을 관찰하고 문서화합니다. EAE 점수인 질병 심각도 평가를 위한 점수 기준을 보려면 텍스트를 참조하십시오.실험에 포함된 모든 마우스의 무게를 평가하고 문서화합니다. dextran 주식 솔루션을 준비하기 위해 염화 나트륨 용액 500 마이크로 리터에 10 밀리그램의 3 킬로달톤 Dextran 텍사스 레드를 녹이고 0.9 % 염화 나트륨 용액의 250 마이크로 리터에서 10 킬로톤 Dextran Alexa Fluor 488의 5 밀리그램을 녹입니다. 주입 직전에 10킬로달톤 Dextran Alexa Fluor 488 스톡 용액의 파이펫 55 마이크로리터가 밀봉 필름에 스페톤 작업 용액을 제공합니다.그런 다음 3킬로달톤 텍사스 레드 스톡 솔루션의 55 마이크로리터를 추가합니다. 100마이크로리터를 일회용 미세 주사기에 넣고 수집합니다. 다음으로, 테이블의 측면 위치에 마취 된 마우스를 배치합니다.마우스가 깨어나기 전에 100마이크로리터의 형광 추적기를 마우스에 정맥주사합니다. 트레이서가 텍스트 프로토콜에 상세한 마우스의 관류를 수행하기 전에 15 분 동안 순환하게하십시오. 평평한 데워 용기를 분쇄된 드라이 아이스로 채우고, 액체가 드라이 아이스 팩 위로 약 1센티미터 에 도달할 때까지 2-메틸부탄을 넣습니다.얼음 양동이 커버와 같은 느슨한 뚜껑으로 덮습니다. 날카로운 가위로 침투 된 마우스의 머리를 잘라 낸 후, 더 작은 가위를 사용하여 피부와 귀를 제거합니다. 두개골을 왼쪽과 오른쪽의 앞쪽으로 절단하여 두개골캡을 조심스럽게 해부하여 두개골을 뇌 위로 접을 수 있도록 합니다.그런 다음 평평한 금속 주걱을 사용하여 광학 신경을 분리하면서 두개골 의 기지에서 손상되지 않은 뇌를 조심스럽게 들어 올립니다. 알루미늄 호일에 뇌를 놓습니다. 두 개의 관상 절단을 배치하여 세 조각으로 뇌를 잘라.세 조각은 뇌간, 중간 뇌 및 소뇌를 나타냅니다. 최적의 온도 절단 매트릭스와 1 분기에 크라이오폴드를 채웁니다. 그런 다음 각 뇌 조각의 앞쪽면이 아래쪽으로 향하면서 뇌 조각을 Cryomold에 놓습니다.매트릭스로 조직을 완전히 덮습니다. 2-메틸부탄 목욕에 수평 방향으로 조직과 크라이오폴드를 놓습니다. 조직 전체가 욕조에 담그지 않도록 하여 조직이 바닥에서 위로 1분 이내에 얼어 붙는지 확인합니다.냉동 조직을 영하 80도로 옮겨 보관하십시오. 동결된 조직 섹션의 준비를 위한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. EAE 마우스에서 준비된 6마이크론, 고정되지 않은 뇌 조직 섹션을 검색합니다.연기 후드에서, 조직에 물의 보존을 피하기 위해 뚜껑에 실리카 젤을 포함하는 플라스틱 냉동 상자 내부의 섹션을 해동. 물 격퇴 펜으로 선을 그려 한 슬라이드에 두 개의 조직 섹션을 분리합니다. 원심분리기 반응 용액은 13, 실온에서 300배, 수조를 이용한 섭씨 37도까지 미리 따뜻합니다.그런 다음 1X 반응 버퍼를 사용하여 섭씨 37도에서 5분 동안 조직 섹션을 다시 수분하게 합니다. 5분 후 1X 반응 버퍼를 부어 넣습니다. 조직 섹션에 반응 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 4 시간 동안 배양하십시오.그런 다음 슬라이드를 이중 증류수로 5번 세척합니다. 이제 실온에서 PBS로 한 번 세척하기 전에 영하 20도에서 얼음 차가운 메탄올로 5 분 동안 섹션을 수정하십시오. 섹션에 PBS에 1 %BSA를 추가하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.그런 다음 조직에서 슬라이드를 뒤집어 섹션에서 버퍼를 폐기합니다. 섹션에 1 차적인 항체 칵테일을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. PBS로 섹션을 두 번 세척 한 후, 이차 항체 칵테일을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.그런 다음 PBS로 섹션을 두 번 세척하고 미끄럼 에 포함 된 용액을 장착합니다. 실온에서 밤새 장착 된 섹션을 건조하게 한 후 형광 현미경을 사용하여 염색 된 조직 섹션을 분석하십시오. EAE 질병 심각도는 EAE 유도 후 16일과 20일 사이에 예상될 수 있는 질병의 피크까지 증가합니다.임상 EAE의 절정에, 마우스는 또한 질병의 면제 단계에서 EAE의 개량에 상관 관계에 있는 증가 하는 가장 낮은 체중을 보였다. 여기에 는 EAE로 고통받는 C57-Black/6 마우스의 코로이드 신경총과 인접한 뇌 의 parenchyma의 대표적인 그림이 있습니다. 마우스는 희생하기 전에 15 분 간 정맥 주사했다.트레이서는 호로이드 신경질의 장루로 회귀된 미생물을 가로질러 쉽게 확산되는 반면, 혈액-뇌 장벽은 순환 추적자가 뇌 parenchyma로 확산되는 것을 허용하지 않으며, 이는 형광 신호가 없습니다. 이 심상은 EAE때문에 손해를 입은 C57-Black/6 마우스의 소뇌에 있는 대표적인 새는 혈관을 보여줍니다. 화살장은 뇌 미세 혈관을 통해 CNS parenchyma로 확산된 추적자를 나타내며, 이는 혈액-뇌 장벽 기능이 이러한 혈관에서 손상되었음을 시사합니다.CNS parenchyma에서, 녹색과 적색 형광 신호는 혈관 벽의 외부에 볼 수 있습니다. MOG-CFA 에멀젼의 올바른 피하 배치는 EAE로 이어지는 적절한 면역 반응을 탑재하는 데 필수적이다. 복막 내 및 근육 주사를 피해야 한다.감쇠된 진균테리움의 흡입을 피하기 위해 연기 후드 아래에서 CFA를 준비하십시오. 또한, MOG-CFA 에멀젼으로 자체 주사를 피하십시오, 이것은 condyloma를 일으키는 원인이 되거나 유전으로 걸리기 쉬운 개별에 있는 EAE로 이끌어 낼 수 있기 때문에. 뇌침투 면역 세포는 유동 세포측정에 의한 신경염증 시 면역 세포 하위 집합에 침투하는 면역 세포 하위 집합을 정량화하기 위해 EAE로부터 고통받는 마우스의 CNS로부터 분리될 수 있다.내피성 및 신경교 뇌 장벽의 무결성을 평가하는 것은 유전자 변형 마우스 모델의 분석 또는 다른 신경 장애의 모델로 번역 될 수 있습니다.

visualizing-impairment-endothelial-glial-barriers-neurovascular-unit

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오는 EAE 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴를 평가하는 절차를 보여줍니다. 다양한 크기의 형광 염료를 역궤도로 주입하여 뇌의 혈관을 순환합니다. 작은 염료는 틈을 통해 뇌 조직으로 누출되는 반면, 큰 염료는 장벽 손상 정도와 상관관계가 있는 파괴가 심한 경우에만 들어갑니다.

EAE 마우스 모델에서 형광 염료를 사용한 혈액-뇌 장벽 파괴 결정

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

출처 : 슈미츠, K.,  et al., 생쥐의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 이미징. J. Vis. 특급. (2017).이 비디오는 다음을 사용하여 시신경에서 실험적 자가면역 뇌척수염 또는 EAE 유발 염증을 시각화하고 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 생물 발광 이미징. 여기에는 마우스 위치 지정, 시약 주입, 순차적 이미지 캡처를 포함하여 시간 경과에 따른 생물 발광의 변화를 모니터링하는 것이 포함됩니다.

EAE 마우스 모델의 생물 발광 이미징

우리는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 연구하기 위해 성체 쥐의 노출된 척수에 유리창을 이식하고 유지하는 방법을 설명합니다. 이 창은 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물의 세포 내 수준에서 세포 역학을 모니터링하기 위해 척수에 대한 만성 광학 접근을 제공합니다.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

이 프로토콜은 실험적 자가면역 뇌척수염에 대한 약물 치료가 면역 세포 침투를 억제한 결과로 중추신경계 보호를 보여주는지 또는 면역 세포 침투의 맹공격 동안 신경 보호를 보여주는지 확인하는 방법을 설명합니다.

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 동물 모델 역할을 합니다. 이 기사에서는 EAE에서 척수 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 채점하는 접근 방식을 설명합니다. 또한, 생쥐 혈청에서 용해성 신경 필라멘트 광 수준을 정량화하는 방법이 제시되어 살아있는 생쥐의 축삭 손상 평가를 용이하게 합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

배우세요 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서 뇌혈관 단위 손상과 혈뇌장벽 투과성을 평가하는 방법을 C57-Black/6 마우스를 이용하여. 이 기법은 다발성경화증 연구에 활용됩니다.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

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