Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

여기에서 제출된 방법은 다발성 경화증을 위한 동물 모형인 실험적인 자기 면역 뇌척수염에 있는 두뇌 장벽을 통해 면역 세포 이동의 분자 기계장치를 연구하는 것을 허용합니다. 혈액-뇌 장벽 투과성 및 매트릭스-메탈로로티즈 활성을 동시에 조사하여 뇌 조직 섹션의 면역 세포 침투에 대한 공간 상관 관계를 조사함으로써 이러한 신경 염증 성 사건을 EAE의 임상 징후와 정확하게 연관시킬 수 있습니다. 병에 걸린 마우스의 전문적인 취급은 심층적인 훈련, 뿐만 아니라 EAE의 임상 표시의 정확한 점수를 필요로 합니다.

따라서 시각적 데모가 유익합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 특정 병원균 없는 조건에 보관된 C57-Black/6 마우스의 마취로 이 절차를 시작합니다. 마취 된 마우스를 한 손에 고정하고 MOG 펩티드 30 마이크로 리터를 주입하고 각 뒷다리 측면에 프룬트의 보조 에멀젼을 피하하여 잉게인 림프절과 가깝습니다.

이제 마우스를 배에 놓고, 꼬리 뿌리에서 왼쪽과 오른쪽 모두에서 연지방 조직에 MOG 펩티드 에멀젼 20 마이크로리터를 주입한다. 또한 마우스의 목에 에멀젼의 작은 액적을 주입하십시오. 당면성 독소 용제 100 마이크로리터를 마우스에 회대적으로 주입하십시오.

내장에 주입을 피하기 위해 신체 센터 아래 마우스의 머리를 잡아. 사육 식단으로 유지 보수 식단을 대체하여 쥐에게 예상된 임상 질환 전후 및 도중 더 높은 에너지 함량의 식품을 제공한다. 첫 번째 치료 후 48 시간 동안 등리 소 독소 주입을 반복하십시오.

매일 아침 케이지 내부를 살펴서 EAE 마우스의 건강 상태를 확인하십시오. 매일 오후 EAE 마우스 점수. EAE 실험에 포함된 모든 개별 마우스를 케이지에서 꺼내 꼬리에 토누스가 있는지 확인합니다.

꼬리를 손가락으로 위쪽으로 이동합니다. 건강한 마우스는 꼬리를 유지합니다. 임상 EAE가 시작된 경우 꼬리 톤은 꼬리의 점진적인 드롭으로 볼 수 있습니다.

결국, 마우스는 꼬리를 전혀 들어 올릴 수 없습니다. EAE 실험에 포함된 모든 개별 마우스를 깨끗한 벤치에 배치하여 걷기 동작을 관찰하고 문서화합니다. EAE 점수인 질병 심각도 평가를 위한 점수 기준을 보려면 텍스트를 참조하십시오.

실험에 포함된 모든 마우스의 무게를 평가하고 문서화합니다. dextran 주식 솔루션을 준비하기 위해 염화 나트륨 용액 500 마이크로 리터에 10 밀리그램의 3 킬로달톤 Dextran 텍사스 레드를 녹이고 0.9 % 염화 나트륨 용액의 250 마이크로 리터에서 10 킬로톤 Dextran Alexa Fluor 488의 5 밀리그램을 녹입니다. 주입 직전에 10킬로달톤 Dextran Alexa Fluor 488 스톡 용액의 파이펫 55 마이크로리터가 밀봉 필름에 스페톤 작업 용액을 제공합니다.

그런 다음 3킬로달톤 텍사스 레드 스톡 솔루션의 55 마이크로리터를 추가합니다. 100마이크로리터를 일회용 미세 주사기에 넣고 수집합니다. 다음으로, 테이블의 측면 위치에 마취 된 마우스를 배치합니다.

마우스가 깨어나기 전에 100마이크로리터의 형광 추적기를 마우스에 정맥주사합니다. 트레이서가 텍스트 프로토콜에 상세한 마우스의 관류를 수행하기 전에 15 분 동안 순환하게하십시오. 평평한 데워 용기를 분쇄된 드라이 아이스로 채우고, 액체가 드라이 아이스 팩 위로 약 1센티미터 에 도달할 때까지 2-메틸부탄을 넣습니다.

얼음 양동이 커버와 같은 느슨한 뚜껑으로 덮습니다. 날카로운 가위로 침투 된 마우스의 머리를 잘라 낸 후, 더 작은 가위를 사용하여 피부와 귀를 제거합니다. 두개골을 왼쪽과 오른쪽의 앞쪽으로 절단하여 두개골캡을 조심스럽게 해부하여 두개골을 뇌 위로 접을 수 있도록 합니다.

그런 다음 평평한 금속 주걱을 사용하여 광학 신경을 분리하면서 두개골 의 기지에서 손상되지 않은 뇌를 조심스럽게 들어 올립니다. 알루미늄 호일에 뇌를 놓습니다. 두 개의 관상 절단을 배치하여 세 조각으로 뇌를 잘라.

세 조각은 뇌간, 중간 뇌 및 소뇌를 나타냅니다. 최적의 온도 절단 매트릭스와 1 분기에 크라이오폴드를 채웁니다. 그런 다음 각 뇌 조각의 앞쪽면이 아래쪽으로 향하면서 뇌 조각을 Cryomold에 놓습니다.

매트릭스로 조직을 완전히 덮습니다. 2-메틸부탄 목욕에 수평 방향으로 조직과 크라이오폴드를 놓습니다. 조직 전체가 욕조에 담그지 않도록 하여 조직이 바닥에서 위로 1분 이내에 얼어 붙는지 확인합니다.

냉동 조직을 영하 80도로 옮겨 보관하십시오. 동결된 조직 섹션의 준비를 위한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. EAE 마우스에서 준비된 6마이크론, 고정되지 않은 뇌 조직 섹션을 검색합니다.

연기 후드에서, 조직에 물의 보존을 피하기 위해 뚜껑에 실리카 젤을 포함하는 플라스틱 냉동 상자 내부의 섹션을 해동. 물 격퇴 펜으로 선을 그려 한 슬라이드에 두 개의 조직 섹션을 분리합니다. 원심분리기 반응 용액은 13, 실온에서 300배, 수조를 이용한 섭씨 37도까지 미리 따뜻합니다.

그런 다음 1X 반응 버퍼를 사용하여 섭씨 37도에서 5분 동안 조직 섹션을 다시 수분하게 합니다. 5분 후 1X 반응 버퍼를 부어 넣습니다. 조직 섹션에 반응 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 4 시간 동안 배양하십시오.

그런 다음 슬라이드를 이중 증류수로 5번 세척합니다. 이제 실온에서 PBS로 한 번 세척하기 전에 영하 20도에서 얼음 차가운 메탄올로 5 분 동안 섹션을 수정하십시오. 섹션에 PBS에 1 %BSA를 추가하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.

그런 다음 조직에서 슬라이드를 뒤집어 섹션에서 버퍼를 폐기합니다. 섹션에 1 차적인 항체 칵테일을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. PBS로 섹션을 두 번 세척 한 후, 이차 항체 칵테일을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.

그런 다음 PBS로 섹션을 두 번 세척하고 미끄럼 에 포함 된 용액을 장착합니다. 실온에서 밤새 장착 된 섹션을 건조하게 한 후 형광 현미경을 사용하여 염색 된 조직 섹션을 분석하십시오. EAE 질병 심각도는 EAE 유도 후 16일과 20일 사이에 예상될 수 있는 질병의 피크까지 증가합니다.

임상 EAE의 절정에, 마우스는 또한 질병의 면제 단계에서 EAE의 개량에 상관 관계에 있는 증가 하는 가장 낮은 체중을 보였다. 여기에 는 EAE로 고통받는 C57-Black/6 마우스의 코로이드 신경총과 인접한 뇌 의 parenchyma의 대표적인 그림이 있습니다. 마우스는 희생하기 전에 15 분 간 정맥 주사했다.

트레이서는 호로이드 신경질의 장루로 회귀된 미생물을 가로질러 쉽게 확산되는 반면, 혈액-뇌 장벽은 순환 추적자가 뇌 parenchyma로 확산되는 것을 허용하지 않으며, 이는 형광 신호가 없습니다. 이 심상은 EAE때문에 손해를 입은 C57-Black/6 마우스의 소뇌에 있는 대표적인 새는 혈관을 보여줍니다. 화살장은 뇌 미세 혈관을 통해 CNS parenchyma로 확산된 추적자를 나타내며, 이는 혈액-뇌 장벽 기능이 이러한 혈관에서 손상되었음을 시사합니다.

CNS parenchyma에서, 녹색과 적색 형광 신호는 혈관 벽의 외부에 볼 수 있습니다. MOG-CFA 에멀젼의 올바른 피하 배치는 EAE로 이어지는 적절한 면역 반응을 탑재하는 데 필수적이다. 복막 내 및 근육 주사를 피해야 한다.

감쇠된 진균테리움의 흡입을 피하기 위해 연기 후드 아래에서 CFA를 준비하십시오. 또한, MOG-CFA 에멀젼으로 자체 주사를 피하십시오, 이것은 condyloma를 일으키는 원인이 되거나 유전으로 걸리기 쉬운 개별에 있는 EAE로 이끌어 낼 수 있기 때문에. 뇌침투 면역 세포는 유동 세포측정에 의한 신경염증 시 면역 세포 하위 집합에 침투하는 면역 세포 하위 집합을 정량화하기 위해 EAE로부터 고통받는 마우스의 CNS로부터 분리될 수 있다.

내피성 및 신경교 뇌 장벽의 무결성을 평가하는 것은 유전자 변형 마우스 모델의 분석 또는 다른 신경 장애의 모델로 번역 될 수 있습니다.