Name: Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 배우세요 푸코실화된 인모유 올리고당을 전체 세포 바이오센서를 이용해 고속 검출 및 정량화하는 방법을. 이 기술은 HMO 생산 균주 분석과 영양 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 아이오와 주립 대학 시작 기금에 의해 지원 되었다. F.E.는 NSF Trinect 친교와 맨리 Hoppe 교수에 의해 부분적으로 투자 되었다. T.J.M. 카 렌과 데 니 본 학부 친목에 의해 부분적으로 지원 되었다. 저자 형광와 LC MS 연구 아이오와 주립 대학 Flow Cytometry 시설 및 W.M. 켁 대사체학 연구 실험실 지원에 대 한 감사합니다.

1. 세포 문화와 유도 조건
참고: 다음 실험에 세는 사용: 대장균 BL21 (DE3)와 빈 벡터, 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드 pAfcA14 와 pET28:green 형광 단백질 (GFP)와 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드와 pAfcB14 그리고 pET28:GFP입니다. 모든 종자는 Luria Bertani 국물 (파운드) 또는 적절 한 항생제로 최소한의 미디어에서 재배 됩니다. 물 이온 (디) 1000 x 대 (50 mg/mL) 및 carbenicillin (100mg/mL)의 재고 솔루션을 준비 합니다.
<ol><li>
미디어 준비
	<ol>
<li>디 물 1 l 파운드 분말 주식의 25 g을 추가 하 여 파운드 미디어를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독을 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션. 멸 균된 파운드 미디어 온도 60 ° c 파운드 미디어의 모든 1 mL에 대 한 항생제의 1 µ L의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.</li>
		<li>파운드 플레이트를 준비 하려면 15 g 천 살 균 전에 파운드 미디어를 추가 합니다. 멸 균된 파운드 agar 온도 60 ° c 항생제의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.</li>
		<li>1.1.3 바이오 센 싱 셀에 대 한 미디어 또는 듀얼 항생제, 대와 carbenicillin 접시를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
탄수화물 inducers
	<ol>
<li>20 g/L의 유 당을 어 금 니 동등 물에서 탄수화물 inducers의 재고 솔루션을 준비: 2'-플로리다와 3 층의 29 g/L 참고: 셀의 각 200 µ L 2'-층 또는 3 층의 20 µ L 필요 합니다.</li>
		<li>유 당 또는 2.9 g/L 2'-플로리다/3-층 품 연속 떨고와 37 ° C에서의 최종 농도의 2.0 g/L 최종 농도와 셀의 200 µ L를 유도 하 고 밤새 껏 성장 하는 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 배양
	<ol>
<li>실험 전에 하루 씨 대와 무 균 기술을 사용 하 여 신선한 세균성 식민지에서 carbenicillin 보충 파운드 매체의 5 mL.</li>
		<li>동요와 함께 37 ° C에서 모든 문화를 품 어 하룻밤 문화를 성장 하 고.</li>
		<li>신선한 파운드/M9 미디어 대와 carbenicillin의 5 mL로 50 µ L의 숙박 문화를 전송 합니다. 문화에는 600에서 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 지속적인 동요를 37 ° C에서 품 어 성장과 0.5-0.7 nm (OD600). 이 중간 로그 단계에서 세포 유도 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 측정 형광의 탐지의 한계
<ol><li>
Cytometry 셀의 준비
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브를 1 분 동안 12500 x g 에서 원심 분리기 숙박 문화를 전송 합니다.</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 다시 단일 세포 현 탁 액을 준비 하 여 단일 셀을 전송 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 6 m m 나2HPO4, 1.8 m m NaH2포4, 145 m NaCl 디 물, pH 7.2 m)의 500 µ L에 펠 릿을 일시 중지 현 탁 액 5 mL 흐름 cytometry 관에.</li>
		<li>교류 cytometer에서 샘플을 실행까지 4 ° C에서 어둠 속에서 셀 유지. 최상의 결과 얻으려면 가능한 한 빨리 셀을 분석 합니다.</li>
		<li>GFP 자극 488 nm 레이저를 선택 합니다. 525/50 nm 대역 통과 필터 fluorescein isothiocyanate (FITC) 형광 레벨 (20000-40000 이벤트, 문이 집계 셀과 파편을 피하기 위해 앞으로 옆 분산에 대 한)를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바이오 센서 보정
	<ol>
<li>보정 곡선을 범위 0-2500 mg에는 표준 2'-플로리다의 8-10 희석을 확인/l.</li>
		<li>2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 (pAfcA 및 pET28:GFP를 포함 하는) 문화 하 고 이전 섹션에서에서 설명한 대로 1.3 표준 희석으로 유도. 각 희석에 대 한 3 개의 생물 복제를 실시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 탐지 및 정량화의 2'-프로듀서 스트레인에서
<ol><li>
프로듀서 긴장의 경작
	<ol>
<li>최소한의 미디어를 만들기 위한 준비 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 1 M의 별도 솔루션-HCl. 소독 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션. 디 물 1 L 국물 분말 M9 미디어 믹스. 압력솥 15 분을 위한 121 ° C에서 M9 솔루션 쿨 50 ° c.까지 솔루션 추가 MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 2 m m, 0.1 m m, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L의 최종 농도 7.5 µ g/L, 각각.</li>
		<li>2'-플로리다 스트레인, 예를 들어, JM109 gwBC-F2, 파운드 미디어의 5 ml에서을 생산 하 고 성장 하룻밤에 37 ° C, 바 움 가트너 외.12에 설명 된 대로 그것의 문화를 시작 합니다.</li>
		<li>하위 1% 단계 1.3.3에서 250 mL 단계 3.1.1에서에서 준비 하는 최소한의 미디어의 앞부분에서 설명한 대로. 최종 농도 10 g/L의 글리세롤을 추가 하 고 37 ° c.에 문화를 품 어</li>
		<li>문화에서 0.5-0.7의 OD600 에 도달 하면 0.5 m m와 유 당 2 g/l.의 최종 농도에 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 추가</li>
		<li>연속 떨고와 37 ° C에서 품 어 고 24 h에 대 한 성장 하는 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2'-플로리다의 추출
	<ol>
<li>살 균 50 mL 튜브와 15 분 동안 900 x g 에서 원심 분리기를 숙박 문화를 전송 합니다.</li>
		<li>3.2.2 상쾌한 삭제 하 고 다시 디 물에 펠 릿을 일시 중단. 잔여 유 당을 제거 하 고 마지막으로 다시 디 물 5 mL에 일시 중지를 세척 단계 세 번을 반복 합니다.</li>
		<li>Lyse 세포 현 탁 액, 한 sonicator 30 s 펄스에서 30% 전력에서 사용 합니다. 모든 시간에 얼음에 셀을 계속.</li>
		<li>2000 x g에 25 분 lysed 세포 원심 제거는 상쾌한, 한 살 균을 통해 전달 (예: 0.22 μ m) 필터링 및 분석까지 4 ° C에서 그것을 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바이오 센서와 정량화
	<ol>
<li>2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 및 중간 로그 단계에서 문화를 접종, 2'-플로리다 섹션 2.2에에서 설명 된 대로 보정 곡선을 만드는 데 사용의 예상된 농도에 세포 lysate 동일 유도. 분석할 샘플으로 동일한 환경에서 보정을 수행 (예: 세포 lysate) 2'-플로리다의 희석 컨트롤에 추가 하 여 (즉, 비-프로듀서) 필터링 된 셀 바이오 센서 세포를 유도 하기 전에 lysate.</li>
		<li>교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 올리고 당 농도 대 한 형광 출력을 그려서 복용량 응답 곡선을 생성 합니다. 세포 lysate를 기준의 응답을 비교 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 선택적 유 당 제거
참고: 바이오 센 싱 세포는 유 당에 과민 한 그리고 그것은 선택적으로 Hmo 유 당 감지를 바이오 센서에 대 한 바람직한. 한 전략 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 셀의 세척을 포함할 것입니다. 3 개의 다른 전략은 아래 설명 되어 있습니다.
<ol><li>
상업적인 정화 β-galactosidase 치료
	<ol>
<li>동결 건조 된 β-galactosidase 1000 (FCC lactase) 단위/mL, 1 mm MgCl2 를 분해 하거나 솔루션에서 상업 β-galactosidase를 사용 합니다.</li>
		<li>필요한 효소의 최적 농도 확인 하려면 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 inoculum 성장과 유 당 2 g/L 및 2.9 g/L 2' 유도-중간 로그 단계에서 플로리다.</li>
		<li>100 µ L 문화, β-galactosidase, 최대 12 단위, 양의 추가 하 고 지속적인 동요를 37 ° C에서 하룻밤 성장 문화를 보자.</li>
		<li>섹션 2.1에에서 설명 된 대로 형광을 측정 하 고 최소 효소 농도 결정 하 여 원하는 신호 감쇄를 달성 하는 데 필요한 효소의 최적 단위 계산.</li>
		<li>2'-플로리다 생산 셀 24 h에 대 한 성장, β-galactosidase의 최적의 단위를 추가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어 3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 진행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LacZ + 스트레인와 전처리
	<ol>
<li>25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화를 품 어.</li>
		<li>접종 한 대장균 BL21 (DE3), 파운드에서 37 ° C에서 중간 로그 단계로 성장 문화와 24 h 문화를 문화 (2:1) 50 mL를 추가.</li>
		<li>3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 3 h. 진행에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
유 강 수 에탄올 참고:이 섹션은 타 외.12에서 적응.<ol>
<li>25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>문화, 100% 에탄올의 두 개의 볼륨, 동요 4 h 37 ° C에서 품 어 추가 합니다.</li>
		<li>원심 900 x g 15 분 수집에서 정지는 상쾌한 고는 유 당을 침전 하는 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>필터 종이 (11 µ m)를 통해 솔루션을 전달 하 여 침전 된 유 당을 제거 합니다. 세포 lysate 2'-플로리다, 다음 섹션 3.3으로 양이 정해질 수 있는 포함 하는 filtrate를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 인간 우유 oligosaccharides fucosylated의 연계 관련 검색에 대 한 높은 처리 전략 제시. 이 특정 glycans와 유도 따라 형광 신호 응답 대장균 유전자 공학에 의해 전체 셀 바이오 센서를 구축 하 여 달성 되었다. 프로토콜 또한 감지 metabolically 조작된 세균성 긴장에 Hmo를 계량 하는 바이오 센서를 사용 하는 방법에 자세히 설명 합니다.
우리의 프로토콜 크로마/MS 방법에 비해 그 결합 특이성에 뿐만 아니라 그것의 높은 처리량으로 인해 다른 방법 이상의 장점을 제공 합니다. 감지 및 광범위 한 다이나믹 레인지의 낮은 한계 Hmo의 직접 측정 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계 세포 lysate 프로듀서 종자의 준비에서 발생합니다. 2'-플로리다의 최대 titer를 보장 하기 위한 최적의 조건을 제공 하 결정적 이다. 일괄 처리에서 variabilities ...

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo) 유 당 파생 oligosaccharides, 일반적으로 3 ~ 8 설탕 단위체로 구성 된 있습니다. 그들은 끝 (Gal β1, 4-Glc) 유 당 감소 그리고 더 glycosidic 링크에 의해 길쭉한 (β-1, 3-또는 β-1, 6-) 포도 당 (Glc), 갈 락 토스 (Gal), 또는 N-acetylglucosamine (GlcNAc). 또한, fucose (Fuc, α-1, 2-또는 α-1, 3-) 또는 sialic acid (Sia 또는 NeuAc, α-2, 3-또는 α-2, 6-) 잔류물은 종종1추가.
Oligosaccharides과 다른 탄수화물의 현재 분석 크로마/질량 spectrometric (MS) 기술2,3,,45, 에 대 한 필요에 의해 처리량 그리고 범위에 제한 됩니다. 6 , 7, 대략 걸릴 수 있는이 장비8의 가동에 고가의 장비, 특수 열과 derivatizing 에이전트 및 전문성에 대 한 필요성을 언급 하지 않기 위하여 샘플 당 한 시간. 올리고 당 연계는 특히 어려운 결정, 고급 MS9,10 또는 핵 자기 공명 (NMR) 기법11. 이러한 oligosaccharides의 합성의 빠른 최적화 따라서이 느린 분석 단계의 처리량에 의해 제한 됩니다.
이 연구에서 설명 하는 fucosylated trisaccharide의 연계 관련 검색 유 기반 Hmo, 2'-fucosyllactose (2'-플로리다) 인간의 우유에 있는 가장 풍부한 HMO에 초점을 맞추고, 유전자 암호화를 사용 하 여 대장균 전체 셀 4 mg/l.에서 검출 한도 바이오 센서 이 바이오 센서의 중요 한 기능은 이성질체 trisaccharides 사이 구별 하는 기능입니다. 디자인 원리는 존재에 형광 신호를 생성 하는 락 오 페론에 의해 검출 된다 Hmo에서 유 당을 해방 하는 대장균 의 특정 fucosidases의 식을 기반으로 합니다. 우리는 링크 전용 fucosidase와 다른 형광 기자 단백질을 품고 하나 2-플라스 미드 시스템을 구축 하 여 이것을 달성. 이 바이오 센서 플랫폼은 높은 처리량 검열 cytometry 또는 마이크로 플레이트 리더에 적합 합니다. 우리는 또한 2'-플로리다 설계 변형12제작한 측정에 바이오 센서의 활용을 보여 줍니다. 이 연구에서 또한 선물이 세 가지 전략, 바이오 센서에서 거짓 긍정적인 신호에서 발생할 수 있는 유 당의 선택적 제거에 조작된 프로듀서 스트레인 성장 유 당에는.
함께 찍은, 유전자 인코딩된 바이오 센서 수 감지 하 고도 어려운 연계 특정 방식으로 Hmo를 계량 컬럼에, MS, 또는 NMR 기법. 높은 처리량 및 사용의 용이성,이 메서드는 대사 공학 및 Hmo의 합성에 광범위 하 게 응용 프로그램 있어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>2'-푸코실락토스&nbsp;</td><td>카르보신스&nbsp;</td><td>41263-94-9</td><td></td></tr><tr><td>3-푸코실락토스&nbsp;</td><td>카르보신스&nbsp;</td><td>41312-47-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드, 이수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>포도당(D-포도당), 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD</td><td></td><td>FACSCanto Plus RUO</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>1100 시리즈 HPLC 시스템</td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>Luna</td><td></td><td>C18 역상 컬럼</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11815024</tr><tr><td>LB 육수, 밀러&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>유당</td><td>Fisher Scientific</td><td>64044-51-5</td><td></td></tr><tr><td>M9, 최소 염, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘, 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Mass Selective Trap SL 검출기</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr></tbody></table>

fucosylated 인간 우유 trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)는 복잡 한 탄수화물의 구성 요소 인간의 모유는 유아 건강에 많은 혜택. 그러나, 그들의 바이오 합성의 최적화는 탐지의 상대적으로 낮은 처리량 및 단 당 류와 연계의 정량화에 의해 제한 됩니다. Glycan 분석의 전통적인 기술을 자동화 없이 하루 샘플 수백 순서 처리량 크로마/질량-spectrometric 메서드가 포함 됩니다. 여기, 높은 처리량, 연계 관련 검색 및 fucosylated HMO 구조, 2'-fucosyllactose와 3-fucosyllactose, 우리는 분리를 통해 달성의 정량화에 대 한 유전자 인코딩된 세균성 바이오 센서 설명 fucosidases의 표현입니다. 으로 유 당 우유 또는 바이오 프로세스의 존재는 가양성으로 이어질 수 있는, 우리 또한 다른 전략을 사용 하 여 유 당에서 신호 감소를 보여줍니다. 이 기술은 높은 처리량으로 인해 많은 반응 조건 또는 생물 매개 변수 HMO 제조의 최적화에 대 한 허용 하는 시간의 문제에 동시에 분석 될 수 있습니다.

우리는 전체 셀 바이오 센서를 2'-플로리다는 올리고 당의 biotechnological 생산와 함께에서 사용할 수 있는 특정 설계 되었습니다. 이 유 당을 생성 하는 터미널 설탕 수정 특정 효소 분열에 의존 함으로써 선도 유 당 유도할 수 있는 발기인에서 기자 형광 단백질의 표현에 걸리면 lac 오 페론의 활성화는 2'-플로리다의 수량 그것의 결합 특이성, 3-fucosyllactose (3 층), 한 이성질체를 보여 주기 위해 테스트도 했다. 두 부분을 포함 하는 유전자 회로: fucosidase 유전자, afcA 또는 afcB제정 식 결과 제정 발기인에 의해 구동 인코딩된 pelB의 신호 순서 벡터에 복제 하는 fucosidase 유전자의 상류 GFP의 식 운전 T7 발기인을 포함 하는 형광 기자 시스템 뿐만 아니라 periplasmic 수출을 촉진 한다. 첫 번째 부분은 플라스 미드 pAfcA 및 플라스 미드 pET...

우리 여기 높은 처리량 탐지 및 정량화 fucosylated 인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)의 전체 셀 바이오 센서를 사용 하 여 설명 합니다. 또한 설명 여기, HMO 생산 종자의 분석으로이 플랫폼의 적응 신호 대 노이즈 비를 향상에 초점을 맞추고 합니다.

Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

이 방법은 인간 우유 올리고당류의 생산에 관련된 몇 가지 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 첫째, 얼마나 많은 제품을 가지고 있습니까? 둘째, 특정 탄수화물 연결은 무엇입니까?여기서 목표는 이러한 인간 우유 올리고당류를 정량화하고 특성화하는 과정을 단순화하고 가속화하는 것입니다. 이 방법은 현재 기술의 상태에 비해 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 높은 처리량 스크리닝에 대한 의무입니다.그래서, 당신은 이 기술을 사용하여 하루에 다른 조건 또는 어쩌면 합성 효소의 라이브러리의 수천을 테스트 상상할 수 있습니다. 또한, 자연이 효소에서 진화한 독특한 기판 특이성을 사용하여 이러한 올리고당류의 탄수화물 연계에 대한 정보를 제공합니다. 우리는 이 방법이 인간 우유 올리고당류의 생산을 향상시킬 수 있다고 믿으며, 이는 인간 모유를 더 가깝게 모방하고 모유를 먹이고 모유를 먹는 아기 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 되는 더 나은 품질의 유아 분유로 이어질 수 있다고 믿습니다.비용, 처리량 및 장비 가용성에 따라 유당 제거에 사용할 방법을 결정할 때 사용자 재량에 따라 사용하는 것이 좋습니다. 최적의 유당 제거를 보장하기 위해 주의해야 합니다. 실험 전날, 멸균 기술을 사용하여 신선한 세균 식민지에서 카나마이신과 카베니실린으로 보충된 LB 배지의 5 밀리리터를 시드.동요와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 모든 문화를 배양. 다음 날, 카나마이신과 카베니실린과 신선한 LB M9 미디어의 다섯 밀리리터로 하룻밤 문화의 50 마이크로 리터를 전송합니다. 문화가 0 포인트 5와 0 점 7 사이에 OD600에 도달 할 때까지 연속 흔들림과 섭씨 37도에서 배양.먼저, 하룻밤 문화를 1포인트 5 밀리리터 튜브와 원심분리기로 1분 동안 12, 500회 g로 옮긴다. 1x PBS의 500 마이크로리터에서 상체를 버리고 펠릿을 다시 일시 중단하여 단일 셀 서스펜션을 준비합니다. 단일 셀 서스펜션을 팩스 튜브로 전송합니다.흐름 사이토미터를 사용하여 GFP를 자극하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 FITC 형광 수준을 수집합니다. 보정 곡선을 만들려면 리터당 0~2500밀리그램 의 범위에서 표준 2'FL의 8~10희석제를 만듭니다. 2'FL 바이오 센싱 세포를 배양하고 텍스트 프로토콜에 설명된 표준 희석제로 유도합니다.LB 미디어의 5 밀리리터에서 균주를 생산하는 2'FL의 문화를 시작하고 섭씨 37도에서 하룻밤 을 성장. 다

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Biochemistry

생화학

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

배지에 박테리아 바이오센서 배양물을 부유시키는 것으로 시작하세요.이 조작된 박테리아는 특정 대변 대사물에 결합하면 형광 리포터 유전자와 관련된 프로모터를 활성화하는 전사 인자를 생성합니다.여기에 숙주-미생물군 상호작용에 관여하는 락테이트와 같은 대사산물을 포함한 여과된 인간 대변 샘플을 추가합니다.이 혼합물을 신선한 배지로 희석하여 최적의 반응량을 유지하세요.흔들리지 않고 인체 장내 환경을 모방하세요.대변 대사산물은 박테리아 세포로 확산되어 전사 인자에 결합합니다.이 복합체는 프로모터에 결합하여 리포터 유전자 발현과 단백질 생산을 촉진합니다.용액을 균일하게 섞어 버퍼에 희석한 후 유세포 분석법을 사용한다.박테리아 세포가 레이저를 통과할 때, 리포터 단백질에서 방출되는 형광은 특정 대변 대사산물의 존재를 확인합니다.

박테리아 바이오센서를 이용한 인간 대변 대사물 검출

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

우리는 소규모로 미생물 외다당류의 식별 및 특성화를 위한 자동화된 모듈식 고처리량 방법을 제시합니다. 이 방법은 빠른 사전 선택을 결합하여 분비된 다당류의 총량을 상세한 탄수화물 지문과 결합하여 새로 분리된 박테리아 균주 또는 전체 균주 수집을 빠르게 스크리닝할 수 있습니다.

자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

이 프로토콜은 주문품 휴대용 FRET 분석기를 사용하여 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 센서 데이터의 신속한 고감도 정량 설명한다. 장치는 당도 실용적이고 효율적인 평가를 가능하게 검출 감도를 최대화하는 임계 온도 범위 내에서 말토오스를 검출하기 위해 사용 하였다.

휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

Sialic acid는 전형적인 단 당 류 단위 glycoconjugates에서 발견입니다. 그것은 분자 및 세포 상호 작용의 과다에 관여. 여기 우리가 N-acetylmannosamine 유도체와 대사 glycoengineering를 사용 하 여 셀 표면 sialic 산 식을 수정 하는 방법을 제시.

N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

자동화된 미생물반응기의 수확된 세포 배양 유체(HCCF)로부터의 단일클론 항체의 정제 및 후속 분석을 위한 상세한 프로토콜이 기술되었다. 분석을 사용하여 중요한 품질 특성(CQA)을 결정하고 제한된 샘플 볼륨을 최대화하여 중요한 정보를 추출하는 것도 제공됩니다.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

단백질에 있는 글라이칸의 자동적이고 신속한 분석을 위한 시스템이 이전에 개발되었습니다. 이 기사에서는 바이오 의약품 및 기타 당접합체 물질의 글라이칸 구조를 분석하는 사용자와 같은 광범위한 사용자에게 최적화된 "글리코 정성 분석"을 위한 프로토콜을 제시합니다.

완전 자동화된 시스템을 사용한 재조합 단백질의 신속한 Glyco-Qualitative Assessment of recombinant proteins with a fully automated system (완전 자동화된 시스템을 사용한 재조합 단백질의 신속한 Glyco-Qualitative Assessment of recombinant proteins using a fully automated system)

최근 연구에서는 C-배당체의 대사에서 인간의 장내 미생물총(microbiota) 효소의 역할을 강조하고 있습니다. 여기에서는 분석 화학 기술(LC-MS/MS 및 NMR)을 구조 생물학 접근 방식과 통합하여 이러한 C-배당체 대사 효소의 구조 및 효소 반응 사슬을 체계적으로 특성화하는 포괄적인 방법론을 제시합니다.

인간의 장내 미생물총(microbiota)에서 C-배당체 대사 효소를 특성화하기 위한 구조 생물학 및 분석 화학 접근법

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 푸코실화된 인모유 올리고당을 전체 세포 바이오센서를 이용해 고속 검출 및 정량화하는 방법을. 이 기술은 HMO 생산 균주 분석과 영양 연구에 활용됩니다.

Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

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