Name: 원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 배우세요 원자력 현미경을 이용한 세포 외 소포의 무표면 이미징 방법을. 정전기적 고정 기술로 크기 측정 및 생물물리학적 특성 분석이 가능하며, 초보자도 적용할 수 있는 신뢰성 높은 프로토콜입니다.

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저자는 국립 과학 재단 (수상 번호 IGERT-0903715), 유타 대학 (화학 공학 종자 보조금 및 대학원 연구 펠로우십 상), 그리고 과학의 스콜코보 연구소의 재정 지원을 인정 기술 (스콜테크 펠로우십).

1. 바이오 유체로부터 전기 자동차 분리
<ol><li>차등 초원심분리8,강수량 또는 크기 배제 크로마토그래피 와 같은 확립된 방법 중 하나에 의해 EV를분리한다.</li>
	<li>예상 표면 및 발광 바이오마커의 존재와 제제의 교차 오염을 나타내는 바이오마커의 부재를 확인합니다. 전자 현미경검사법에 의해 단리된 입자의 지질 이중층 형태를 확인한다. 참고: 엑소좀을 분리할 때 나노입자 추적 분석(NTA) 또는 동적 광 산란으로 측정된 유체역학적 크기 분포는 예상 범위에 있어야 합니다. EV 및 엑소좀 격리의 세부 사항은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 선택된 방법은 실험적인 질문과 연구10의목표에 따라 달라집니다. 다음 단계는 시판되는 침전키트(표 오브 머티리얼)를이용하여 MCF-7 유방암 세포의 성장 배지로부터의 침전에 의해 엑소좀을 풍부하게 하는 절차의 구체적인 그림을 제공한다.</li>
	<li>세포 배양 확장 전에 MCF-7 유방암 세포를 액체 질소에 저장하십시오. 서브 배양에 세포를 해동.</li>
	<li>무균 관행에 따라 150mm 플레이트에서 셀 도금을 수행하십시오. 이글의최소 필수 배지, 0.01 mg/mL 인간 재조합 인슐린, 및 10% 엑소좀프리 태아 소 혈청으로 구성된 성장 배지를 사용한다.</li>
	<li>배양을 95% 공기 및 5%CO2로 축하하고 37°C에서배양한다.</li>
	<li>세포가 정착 된 후 (도금 후 약 24 시간), 매체를 변경하십시오. 플레이트를 1:10 비율로 분할하고 각각 20 mL의 배지를 함유하는 배양 10개의 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>수확 및 풀 미디어 에서 9 이러한 플레이트 (180mL) ~70- 80% 합류 세포는 성장 단계에 여전히 있을 때.</li>
	<li>미디어를 60 mL 및 120 mL로 나누고 30 mL / 튜브로 나누고 15 분 동안 3,000 x g의 원심 분리기를 넣습니다.</li>
	<li>각 튜브에서 상온을 새로운 멸균 50 mL 튜브로 옮기고 엑소좀 절연을 수행합니다.</li>
	<li>게시된 프로토콜에 따라 침전으로 엑소좀을 분리(참조11참조 참조) 또는 상업적 격리 키트(표 오브머티리얼)가사용되는 경우제조사의지침을 따르십시오. 후자의 경우의 첫 번째 단계로, 원심분리기 세포 배지를 3,000 x g에서 15 분 동안. 상류를 철회하고 세포 및 세포 파편을 폐기한다.</li>
	<li>침전 용액(1:5 부피비)을 상류에 넣고 밤새 혼합하고 냉장보관합니다.</li>
	<li>실온에서 30 분 동안 1,500 x g의 원심 분리기. 원심 분리 후 상급체를 폐기하십시오.</li>
	<li>1,500 x g에서 나머지 엑소좀 펠릿을 5 분 더 돌릴 수 있습니다. 펠릿을 방해하지 않고, 포부로 나머지 침전 용액을 제거하십시오.</li>
	<li>100-1x 인산완식염수(PBS) 완충액의 500 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 다운스트림 분석에 필요한 여러 개의 aliquots로 나눕니다.</li>
	<li>즉시 AFM 이미징을 위한 단리된 엑소좀의 표면 고정으로 진행한다. 필요한 경우 동결 해동 주기 동안 시료의 손상을 방지하기 위해 예방 조치를 취하는 동안 나중에 사용하기 위해 -80 °C에서 알리쿼트를 동결하십시오.</li>
</ol>2. 세포외 소포의 표면 고정
<ol><li>강력한 양면 테이프, 에폭시 또는 대체 접착제를 사용하여 AFM/스캐닝 터널링 현미경(STM) 자기 스테인리스 스틸 시편 디스크에 운모 디스크를 단단히 부착하십시오.</li>
	<li>날카로운 면도기 나 유틸리티 나이프를 사용하거나 상단 표면에 접착제 테이프를 부착한 다음 그것을 엿보워서 재료 층을 제거하여 운모 디스크를 절단하십시오. 참고 : 어느 방법이든 이전에 환경에 노출 된 운모의 얇은 층을 제거하여 처녀 표면을 공개해야합니다. 시술 후 AFM/STM 금속 시편 디스크에 운모를 부착하는 것은 확고하게 유지되어야 합니다.</li>
	<li>실온에서 100 μL의 100 μL의 100 μL의 운모 표면을 10mM NiCl2 용액으로 처리하여 표면 전하를 음수에서 양성으로 수정합니다.</li>
	<li>보풀이없는 물티슈 또는 블로팅 용지로 NiCl2 용액을 얼룩. 탈이온화(DI) 물로 운모 표면을 3배 세척하고 건조한 질소로 건조시다. 참고: AFM으로 수정된 표면을 스캔하여 오염물질이 없는지 확인하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>AFM 시편 디스크를 부착된 표면 수정 운도를 페트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>1.14 단계에서 엑소좀 샘플을 1x PBS로 희석하여 용액의 mL당 4.0 x 109 및 4.0 x10 입자 사이의 농도를 얻었다. NTA를 사용하여 희석된 입자 농도를 검증합니다.</li>
	<li>파이펫으로부터 희석된 엑소좀 용액의 100 μL을 비우고 운우의 표면에 sessile 드롭을 형성한다.</li>
	<li>페트리 접시에 뚜껑을 놓고 파라핀 필름으로 밀봉하여 시료 증발을 줄입니다. 4 °C에서 18 시간-12 에 대한 샘플을 배양. 참고 : 고정 된 엑소좀의 표면 밀도는 인큐베이션 시간과 액체 내의 전기 EV의 농도에 따라 증가합니다. 엑소좀이 더 낮은 농도로 시료에 존재하는 경우 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>배양 후, 흡인 80-표면을 방해하지 않고 샘플의 90 %. 이 시점에서, 엑소좀은 정전기적으로 운모 기판 상에 고정될 것이다.</li>
	<li>수화 된 전기 를 이미징하기 전에 1 x PBS로 표면을 헹구하십시오. 3회 반복합니다. 헹구는 과정 전반에 걸쳐 샘플을 수화상태로 유지하도록 주의하십시오.</li>
	<li>1x PBS로 운도 표면을 세척 한 후, 80 % 제거-액체의 90 %, 피펫 ~ 40 신선한 1x PBS의 40 μL 샘플을 커버합니다.</li>
	<li>건조 된 전기 를 이미징 할 때, DI 물로 기판을 헹구. 3회 반복합니다. 참고 : DI 물로 헹구면 염결정이 형성되고 기판이 건조할 때 표면에 용질의 침착을 방지 할 수 있습니다.</li>
	<li>건조 된 전기 를 이미징하기 전에 표면을 건드리지 않고 가능한 한 많은 액체를 흡입하고 건조한 질소 스트림으로 나머지를 건조시다.</li>
</ol>3. AFM 이미징
<ol><li>건조된 전기 를 이미지화하려면 탭 및 비접촉 이미징 모드에서 공중에서 스캔하도록 설계된 캔틸레버를 선택하고 프로브 홀더에 장착하십시오. 참고: 재료 표에 나열된 예의 캔틸레버(길이 123μm, 너비 40μm, 7nm 팁 반경 및 37 N/m 스프링 상수)의 특성은 사용 가능한 AFM 계측과 호환되는 프로브를 선택할 때 가이드로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>AFM 스테이지에서 2.13단계에서 준비를 합니다. 자기 스테인레스 스틸 표본 디스크는 무대에서 샘플을 고정합니다. 준비하고 무대가 열적으로 평형화될 때까지 시간을 두어 보라고 합니다.</li>
		<li>태핑 모드를 사용하여운모표면의 충분히 넓은 영역을 스캔합니다. 예를 들어~ 1Hz의 스캔 속도로 512선으로 래스터된 5 x 5 μm의 영역을 선택합니다. 참고: 이미지 영역과 이미지를 형성하기 위해 선택한 선 수에 따라 스캔 시간이 증가하지만 초당 스캔한 선 수로 정의된 스캔 속도에 따라 검색 시간이 줄어듭니다. 빠른 스캔 속도는 이미지 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 래스터링 속도는 획득 시간과 이미지 품질 간의 균형을 사법적으로 조정해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수화 소포를 이미지화하려면 부드럽고 수화된 샘플을 스캔하는 데 적합한 캔틸레버를 선택하고 캔틸레버를 액체스캔용으로 설계된 프로브 홀더에 장착합니다. 참고: 사용 가능한 AFM 계측기와 호환되는 프로브를 선택할 때 재료 표에 나열된 프로브의 사양(공칭 길이 175μm, 폭 22m, 팁 반경 20nm, 0.07 N/m 스프링 상수, 및 4~8kHz 범위의 구동 주파수로 이미징에 최적화되어 있습니다.<ol>
<li>캔틸레버 끝을 1x PBS로 적시면 스캔 중에 액체에 기포가 유입될 가능성을 줄입니다.</li>
		<li>AFM 단계에서 2.11 단계에서 준비를 합니다. 자기 스테인레스 스틸 시편 디스크는 표면에 고정 된 전기 를 포함하는 부착 된 운모를 고정합니다.</li>
		<li>준비 시간과 AFM 단계가 열적으로 평형화될 수 있도록 합니다.</li>
		<li>태핑 모드에서 수화 된 운모 표면을 이미지화하십시오. 높이 와 위상 이미지를 모두 획득합니다. 참고: 이미징 품질은 계측, 선택한 프로브 및 스캔 매개변수의 영향을 받습니다. 스캐닝 조건을 최적화할 때, ~0.8-1.0Hz 스캔 속도와 4~8kHz 사이의 구동 주파수로 512라인에서 스캔한 5 x 5 μm 영역을 시작점으로 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 이미지 분석
참고: 수집된 높이 이미지에는 다음 데이터 처리 및 분석 단계가 적용됩니다. 유사한 절차가 위상 데이터를 분석하도록 조정될 수 있다. 아래 설명은 GNU 일반 공공 라이센스에 따라 제공되는 무료 및 오픈 소스 소프트웨어인 Gwyddion12에만표되어 있습니다. 대체 소프트웨어 도구에서도 유사한 기능을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>데이터 프로세스, SPM 모드, 팁으로 이동하여 모델 팁(그림 2)을 선택합니다. 샘플을 스캔하는 데 사용되는 팁의 형상과 치수를 선택하고 확인을클릭합니다.</li>
	<li>표면 재구성을 수행하여 팁 침식 아티팩트를 수정합니다. 이미지를 엽니다. 메뉴에서 데이터 프로세스, SPM 모드, 팁을선택한 다음 표면 재구성을 선택하고 확인을 클릭합니다(그림3).</li>
	<li>스캔 데이터에서 기판의 기울기를 제거하여 이미징 평면을 실험실 XY 평면과 일치하도록 정렬합니다. 이 작업을 수행하려면 데이터 프로세스, 수준을 선택하고 평면 수준(그림 4)을선택합니다.</li>
	<li>데이터 프로세스, 데이터 수정을 선택한 다음 행 정렬을선택하여 이미지행을 정렬합니다. 여러 정렬 옵션을 사용할 수있습니다(그림 5). 예를 들어 Median은 각 검색 선의 평균 높이를 찾아 데이터에서 빼는 알고리즘입니다.</li>
	<li>데이터 프로세스로이동하여 데이터를 수정하고 흉터 제거(그림 6)를선택하여 흉터로 알려진 일반적인 스캔 오류를 제거합니다.</li>
	<li>데이터 프로세스에서 액세스할 수 있는 레벨 드롭다운 메뉴에서 평평한 베이스를 선택하여 0 높이인 Z = 0으로 운모 표면을 정렬합니다(그림7).</li>
	<li>그레인 드롭다운메뉴(그림 8A)에서 임계값별 표시를 사용하여 스캔한 표면에서 EV를 식별합니다. 이 알고리즘은 사용자가 선택한 임계값 이상의 높이에 의해 제로 표면 기판에서 돌출된 입자로 표면 고정된 엑소좀을 식별합니다. 1nm에서 3nm 사이의 범위에서 임계값을 선택하면 대부분의 배경 간섭이 제거됩니다. 더 작은 임계값은 더 깨끗한 배경에서 사용됩니다. 참고: 그림 8A의 임계값은 1.767 nm입니다. 이 임계값을 가진 MCF-7 엑소좀 식별의 결과는 도 8B에도시되어 있다. Gwyddion은 자동 임계값(Otsu의 방법), 에지 감지 및 유역 알고리즘을 포함하여 이미지의 소포를 자동으로 식별하는 알고리즘으로서 임계값에 대한 몇 가지 대안을 제공합니다. 참고: AFM 이미지에 있는 입자 응집체는 마스처되고 분석에서 제외될 수 있습니다.</li>
	<li>그레인 스 메뉴에서 액세스할 수 있는 사용 가능한 분포 알고리즘을 사용하여 식별된 EV의 기하학적 및 차원 특성화를 수행합니다. 참고: Gwyddion은 수화 또는 탈기 상태에서 비늘 값, 비상, 체적 및 기타 고정화 EV의 분포를 평가하는 도구를 제공합니다. 스칼라-값 속성의 예는 그림 9에 나와 있으며, 이는 식별된 각 엑소좀의 외곽공간 내에서 최대 높이의 분포를 제공합니다.</li>
	<li>다른 계산 도구 및 사용자 지정 컴퓨터 프로그램에서 전문 분석을 위해 Gwyddion에서 AFM 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

생물학적 유체, 표면 스캐닝 및 이미지 분석에서 전기 EV의 고정은 액체에서 EV의 AFM 특성화를 위한 개발된 프로토콜의 필수 단계입니다. AFM 이미징 스케일에 대한 소포의 수는 기판 상에 고정된 소포의 표면적 및 표면 농도를 갖는다. 전기 자동차및 엑소좀18의부정적인 제타 전위를 감안할 때, 우리는 액체 샘플에서 AFM 기판에 이르기까지 전기 전기 적 고정을 옹호합니다. 고정은 표면이 양전하일 때 효과적입니다. EV 고정화 에 앞서, 양성 표면 전하가 운모의 경우와 같이 기판에 부여되어야 할 수도 있다―일반적인 식 KAl 2(AlSi3O10)(OH)2를가진 층화된 규산염 미네랄. 갓 갈라진 운우의 표면은 완벽하게 평평한 표면에 가깝기 때문에 AFM에 의해 나노 입자를 이미징하는 데 이상적이지만 표면 전하가 음수이므로 수정해야합니다. 프로토콜은 AFM 기판에 양성 표면 변화를 부여하는 절차를 설명합니다. ...

세포밖 소포 (EV)는 혈액, 소변, 타액, 우유 및 양수를 포함하여 모든 체액에서 존재합니다. 엑소좀은 내생 생물발생, 내생 통로의 마커, 모든 EV 중 가장 작은 크기로 다른 EV와 차별화된 지역 형 EV 클래스를 형성합니다. 엑소좀의 크기는 종종 연구 사이 상당한 가변성으로 보고됩니다. 상기 크기 조정 결과는 EV 크기를 추정하기 위해 상이한 분석 기법에 의해 채택된 물리적 원리의 차이를 반영하여 EV 크기1,2를반영하는 방법에 의존하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 크기 특성 화 기법인 나노 입자 추적 분석(NTA)은 용액에서 EV의 브라운 이동성에 대한 저항성을 특징짓는 유체역학적 직경으로 EV의 크기를 추정합니다. 소포의 더 큰 유체 역학 직경은 액체에서 낮은 이동성을 의미합니다. 표면 단백질 및 멤브레인 표면에 고정되거나 흡착된 다른 분자로 구성된 소포 주위의 관상 층은 이동성을 실질적으로 방해하고 전기 EV의 유체 역학적 크기를 증가시킵니다. 상대적인 측면에서, 이러한 증가는 그림 1에도시된 바와 같이 엑소좀3에대해 특히 크다.
극저온 투과 전자 현미경 검사법 (cryo-TEM) 화상 진찰은 그들의 수화한 상태에서 소포 크기 및 형태를 특성화하는 결정적인 기술입니다. 그러나 계측기의 높은 비용과 이를 사용하는 데 필요한 전문 지식은 수화된 전기 를 이미지화할 수 있는 대체 기술의 탐구에 정확하게 동기를 부여합니다. 획득된 극저온-TEM 이미지에서 관찰되거나 특징지어지는 비교적 적은 수의 EV는 이 기술의 또 다른 주목할 만한 단점이다.
원자력 현미경 검사법(AFM)은 표면에 입자의 이미지를 래스터하기 위해 기판을 가로질러 프로브를 스캐닝함으로써 수화 또는 건조된 EV4,5,6의 3차원 지형을 시각화한다. AFM에 의해 전기 를 특성화하는 프로토콜의 필수 단계는이 연구에서 설명되어 있습니다. 액체에 소포를 이미징하기 전에, 그들은 기능화 된 표면에 테더링, 필터에 트래핑, 또는 정전기 인력7에의해 기판에 고정되어야한다. 양전하 기판상정전기 고정은 음의 제타 전위를 가지는 것으로 알려진 엑소좀의 고정화를 위한 특히 편리한 옵션이다. 그러나 표면에 세포외 소포를 고정시키는 동일한 정전기력도 모양을 왜곡하여 이미징 후 데이터 분석이 필수적입니다. 우리는 표면에 고정 된 엑소좀의 왜곡 된 모양에 AFM 데이터를 기반으로 솔루션의 구형 소포의 크기를 추정하는 알고리즘을 설명하여이 점을 정교하게.
개발 된 프로토콜에서 소포의 강력한 정전기 고정을위한 절차가 제시되고 수화 또는 건조 된 상태에서 원자력 이미징을 수행하는 데 필요한 단계가 뒤따릅니다. 고정된 소포의 표면 농도에 영향을 미치는 요인이 확인됩니다. 이 지침은 용액에서 서로 다른 농도의 EV를 가진 시료에 대한 정전기 고정을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 충분히 많은 수의 고정된 소포에 기초하여 상이한 생물물리학적 성질의 경험적 확률 분포의 추정을 허용하는 실험 조건의 선택이 논의된다. AFM 데이터의 사후 이미징 분석의 예가 제공됩니다. 구체적으로, 고정화 EV의 AFM 특성화에 기초하여 용액내 소포의 크기를 결정하기 위한 알고리즘이 설명된다. 대표적인 결과는 극저온-TEM 이미징의 결과와 AFM에 의한 소포 크기 조정의 일관성을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>AFM/STM 컨트롤러&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>멀티모드 나노스코프 V</td><td>이 AFM 컨트롤러는 액체와 공기 중의 생물학적 샘플의 이미징을 지원합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>AFM/STM 금속 시편 디스크(10mm)</td><td>TedPella</td><td>16207</td><td>운모 디스크를 양면 테이프 또는 기타 수단으로 부착한 금속 시편 디스크.</td></tr><tr><td>AFM/STM 운모 디스크(10mm)</td><td>TedPella</td><td>50</td><td>최고 품질 등급 V1 운모, 두께 0.21mm(0.0085인치). 10개 패키지로 인터리브됩니다. AFM/STM 디스크에 장착할 수 있습니다. 공중 촬영을 위한 4가지 직경의</td></tr><tr><td>AFM 프로브</td>, <td>Bruker</td><td>TESP-V2</td>, <td>태핑 모드용 고품질 에칭 실리콘 프로브, 공중 스캔을 위한 비접촉 모드로 제공됩니다.</td></tr><tr>액체 <td>Bruker</td><td>MLCT</td> 소프트 실리콘 질화물 캔틸레버와 실리콘 질화물 팁의 <td>소프트 샘플 이미징을 위한 AFM 프로브</td><td>는 액체 작동에 적합합니다. Range in force constants를 통해 사용자는 접촉 모드뿐만 아니라 고하중 대 거리 분광법에서 매우 부드러운 샘플을 이미지화할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>스펙트럼</td><td>360-77705</td><td>금속 시편 디스크에 운모 디스크를 고정하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>ExoQuick-TC</td><td>시스템 Biosciences</td><td>EXOTC50A-1</td><td>ExoQuick-TC는 조직 배양 배지에서 엑소좀을 분리하도록 설계된 독점적인 폴리머 기반 키트입니다.</td></tr><tr><td>액체 Bruker 이미징을 위한 유리 프로브 AFM 홀더</td><td></td><td>&nbsp; MTFML-V2</td><td>이 유리 프로브 홀더는 MultiMode AFM을 사용하여 유체에서 스캔하도록 설계되었습니다. 홀더는 피크 포스 태핑 모드, 접촉 모드, 태핑 모드 및 포스 모듈레이션에서 사용할 수 있습니다.&nbsp; 프로브는 더 큰 진폭 변조를 위해 별도의 피에조 발진기에 의해 음향적으로 구동됩니다.&nbsp; 홀더는 두 개의 포트, 필요한 피팅 및 유체 추가 및 제거를 위한 액세서리 키트와 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>Gwyddion</td><td>체코 계측 연구소.</td><td>버전 2.52</td><td>프로브 현미경 기술을 스캔하여 얻은 데이터 필드의 시각화 및 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어.</td></tr><tr><td>보푸라기가 없는 압지</td><td>GE Healthcare Whatman&nbsp;</td><td>Grade GB003 블로팅 페이</td>퍼 <td>이 블로팅 페이퍼를 사용하여 마이카의 기판 수정 후 NiCl2를 제거하십시오. &nbsp;</td></tr><tr><td>보푸라기가 없는 클린룸 와이프</td><td>Texwipe</td><td>AlphaWipe TX1004</td><td>이 폴리에스테르 와이프를 사용하여 표면을 청소하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>니켈 (II) 염화물 (NiCl2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td>분말은 DI 물에서 10 mM NiCl2를 만드는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td> <td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS, pH 7.4</td></tr></tbody></table>

원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

엑소좀 및 기타 세포외 소포(EV)는 지질막 소포, 막 단백질 및 기타 분자에 의한 표면 장식, RNA를 포함하는 모세포로부터 상속된 다양한 발광 량으로 구성된 분자 복합체이며, 단백질, 및 DNA. 소포의 크기와 표면 장식에 의해 형성된 관상 층의 크기에 따라 달라지는 전기 자동차의 유체 역학적 크기의 특성화는 일상화되었습니다. 엑소좀, 전기 의 가장 작은, 유체 역학 과 소포 크기 사이의 상대적 차이는 중요하다. 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM) 이미징에 의한 소포 크기의 특성화는 금 본위제 기술인 금본위제 기술로 인해 기기 의 비용, 시료 준비, 이미징 및 이미지에서 관찰되는 소수의 입자를 분석합니다. 널리 이용가능하고 접근 가능한 대안은 3차원 기하학, 크기 및 세포외 소포의 그밖 생물물리학적 특성에 대한 다양한 데이터를 생성할 수 있는 원자력 현미경 검사법(AFM)입니다. 개발된 프로토콜은 사용자가 이 분석 도구를 활용하게 하는 데 지침이 되며, AFM에 의한 전기자동차 분석을 위한 워크플로우를 간략하게 설명하며, 여기에는 수화 또는 건조 형태로 이미징 EV를 위한 샘플 준비, 정전기 적 고정화 고정화 기판, 데이터 수집, 분석 및 해석에 대한 소포. 대표적인 결과는 수정된 운소 표면에 전기 를 고정하는 것이 예측 가능하고 사용자 정의 가능하며 사용자가 많은 수의 소포에 대한 크기 조정 결과를 얻을 수 있음을 보여줍니다. AFM 데이터에 기초한 소포 크기 조정은 저온-TEM 이미징과 일치하는 것으로 나타났다.

전기 자동차의 표면 고정은 이미징 시퀀스에서 중요한 단계입니다. 음의 제타 전위를 가진 것으로 알려진 엑소좀의 정전기 표면 고정은 운모의 기질이 양극성 표면 전하를 갖도록 변형된 후에 강력하게 발생합니다. NiCl2를 사용하여 양성 표면 변화를 부여하지 않으면 기판 상에서 의 전추가 비효율적인 것으로 나타났습니다. 도 10A의높이 이미지는, PBS의 mL당 2.59 x 1010 소포를 포함하는 MCF-7 엑소좀 샘플 후 공기중에서 획득한 것으로, 갓 갈라진 운모의 수정되지 않은 표면에서 12시간 동안 배양되었고, DI 물로 세척한 후 표면에 담습니다. 도 10A에서 볼 수 있는 소포는, 대부분, DI 물의 불완전한 포부의 결과이며, 이는 표면에 고정되지 않은 소포를 다시 매달아 증발함에 따라 기판 상에 그(것)들을 놓습니다.
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단계별 절차는 액체 견본에서 엑소좀 및 세포외 소포의 표지 자유로운 고정을 위해 기술되고 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의하여 그들의 화상 진찰. AFM 이미지는 용액에서 소포의 크기를 추정하고 다른 생물 물리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

이 프로토콜은 수화 및 건조 된 형태로 세포 외 소포의 AFM 이미징, 정전기 고정, 표면 스캐닝, vesical 식별 및 데이터 분석 및 해석에 대한 간단한 준비를 간략하게 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 피부 표면에 소포의 편리한 정전기 고정및 고정으로 인한 모양 왜곡을 설명하기 위한 포스트 이미징 분석입니다. 획득한 소포 크기 조정 결과는 비용이 많이 들고 도전적인 기술로 남아있는 골드 스탠다드 CryoTEM 이미징과 일치합니다.새로운 AFM 사용자인 경우 수화 샘플을 진행하기 전에 건조 시료의 특성화로 시작합니다. 수화 샘플 획득에 영향을 미칠 수 있는 수많은 추가 요인이 있기 때문입니다. 시작하려면, 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 생체 유체로부터 세포외 소포를 분리한다.다음으로, 마그네틱 스테인리스 시편 디스크에 마우스 디스크를 단단히 부착합니다. 날카로운 면도기를 사용하여 새로운 재료 층을 노출하여 운모 디스크를 크리브하십시오. 실온에서 10밀리알라 니켈 II 염화물 용액의 100 마이크로 리터로 10초 동안 운하의 상단 표면을 처리합니다.이렇게 하면 표면의 전하가 음수에서 양수로 수정됩니다. 니켈 II 염화물 용액을 보풀 프리 와이프 또는 블로팅 페이퍼로 블롯합니다. 그런 다음, 산화 된 물로 운하 표면을 세 번 씻고 건조 질소의 스트림으로 건조.부착된 표면 수정 된 운하와 AFM 표본 디스크를 페트리 접시에 놓습니다. 다음으로, PBS로 엑소좀을 희석하여 용액의 밀리리터당 4~40억 입자의 농도를 얻습니다. 나노 입자 추적 분석을 사용하여 희석된 입자 농도를 검증합니다.파이펫에서 희석된 외민용의 100 마이크로리터를 비우어, 운하의 표면에 세실 낙하를 형성한다. 그런 다음 뚜껑을 페트리 접시에 놓고 파라펜 필름으로 밀봉하여 시료 증발을 줄입니다. 12 시간 동안 냉장고에 인큐베이션.인큐베이션 후, 표면을 방해하지 않고 주의 깊게 샘플의 80 ~ 90 %를 흡인. 이 시점에서, 엑소솜은 정전기로 운모기판에 고정됩니다. 수화 된 샘플을 이미징 할 때 PBS로 표면을 세 번 헹구습니다.헹구기 과정 전반에 걸쳐 샘플을 수화상태로 유지하십시오. PBS로 운하 표면을 세척한 후, 시료를 커버하기 위해 신선한 PBS의 액체 및 파이펫 40 마이크로리터의 80~90%를 제거합니다. 수화 된 샘플은 이미징을 위한 준비가 되어 있습니다.건조 된 EV의 를 이미징 할 때, 탈이온 된 물로 기판을 세 번 헹구어 표면에서 소금을 제거합니다. 가능한 한 많은 액체를 흡입 한 후, 표면에 닿지 않고, 건조 질소의 스트림으로 나머지를 건조. 건조된 세포외 소포를 이미지화하려면 도청 및 비접촉 이미징 모드에서 공중에서 스캔하도록 설계된 캔틸레버를 선택하고 프로브 홀더에 장착합니다.샘플을 AFM 단계에 배치합니다. 자기 스테인레스 스틸 시편 디스크는 무대의 샘플을 고정합니다. 프로브 홀더를 AFM에 넣습니다.준비 와 스테이지가 열을 평형화할 시간을 허용합니다. 도청 모드를 사용하여 512 줄로 래스터된 5x5 미크론 영역을 하나의 hertz의 스캔 속도로 스캔합니다. 지형과 샘플의 표면 특성에 대한 무료 정보를 제공하면서 높이 및 위상 이미지를 모두 획득합니다.검색 시간은 이미지 영역과 이미지를 형성하기 위해 선택한 줄의 수로 증가하지만 스캔 속도에 따라 감소합니다. 빠른 스캔 속도가 이미지 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 래스터링 속도는 획득 시간과 이미지 품질 간의 균형을 유지해야 합니다. 수화 소포를 이미지화하려면 부드럽고 수화된 샘플을 스캔하는 데 적합한 캔틸레버를 선택하고 액체 스캔을 위해 설계된 프로브 홀더에 캔틸레버를 장착합니다.스캔 하는 동안 액체에 기포를 도입의 가능성을 줄이기 위해 PBS와 캔틸레버의 끝을 적시. 그런 다음 샘플을 AFM 단계로 고정합니다. 샘플이 열적으로 평형되면 도청 모드에서 수화 된 운하 표면을 이미지합니다.높이 와 위상 이미지를 모두 획득합니다. 촬영한 이미지를 분석하려면 먼저 데이터 프로세스의 SPM 모드 선택후 Tip'을 선택하고 모델 Tip'을 선택하여 샘플을 스캔하고 표면 재구성을 수행하여 팁 침식 아티팩트를 확인'을 클릭합니다. 이미지를 엽니다.메뉴에서 데이터 프로세스를 선택한 다음 Tip'다음에 SPM 모드를 선택한 다음 Surface 재구성을 선택하고 확인'Next를 클릭하고, 데이터 프로세스를 선택하고, 레벨'을 선택하고, 평면 레벨을 선택하여 이미징 평면을 정렬하고 스캔 데이터에서 기판의 기울기를 제거하여 실험실 XY 평면과 일치합니다. 데이터 프로세스를 선택한 다음 올바른 데이터'를 선택한 다음 각 검색 선의 평균 높이를 찾아 데이터에서 빼는 알고리즘인 중앙값을 포함하여 행 정렬 옵션을 정렬하는 것을 선택하여 이미지의 행을 정렬합니다. 다음으로 데이터 프로세스로 이동하여 흉터 제거를 선택합니다'이 Scars'로 알려진 일반적인 스캔 오류를 제거'제로 높이에서 운하 표면을 정렬하려면 데이터 프로세스 메뉴로 이동하여 레벨 드롭 다운 메뉴에서 플랫텐 베이스를 선택합니다.Grains'menu로 이동하여 임계값에 의해 표시를 사용하여 스캔 된 표면의 추가 셀룰러 소포를 식별'이 알고리즘은 사용자가 선택한 임계값 위의 높이에 의해 제로 표면 기판에서 튀어 나온 입자로 표면 고정 된 엑소좀을 식별합니다. 1~3나노미터 범위의 임계값을 선택합니다. 이렇게 하면 대부분의 백 그라운드 간섭이 제거됩니다.마지막으로 Grains 메뉴에서 액세스할 수 있는 사용 가능한 배포 알고리즘을 사용하여 식별된 소포의 기하학적 특성과 치수 특성을 수행합니다. 다른 계산 도구 및 사용자 지정 컴퓨터 프로그램에 의해 전문 분석을 위해 Gwyddion에서 AFM 데이터를 내보냅니다. 니켈 염화물 표면 수정은 시간에 따라 달라 지는 여분의 세포 소포의 고정을 초래합니다.고정 된 소포의 표면 농도는 24 시간 인큐베이션 후 지나치게 조밀한 반면 12 시간 잠복은 더 적은 엑소좀으로 이어지고 정확하게 분석하기 쉬운 데이터를 스캔합니다. 이 AFM 이미지는 수정된 운모 표면에 정전기적으로 고정된 수화 MCF7 엑소좀을 보여줍니다. 해당 AFM 상 이미지는 높이 영상의 입자가 멤브레인 소포에 대해 예상대로 부드러운 나노 입자임을 확인합니다.동일한 선을 따라 세 가지 소포에 대한 높이 데이터가 여기에 표시됩니다. 이러한 프로파일은 변형된 운하의 양전하 표면에 엑소좀의 정전기 매력으로 인한 평평한 형상을 보여 준다. 형상 왜곡은 고정된 소포와 그 단면의 확대보기에서 명백합니다.용액에서 엑소좀의 구형 크기를 추정하기 위해 표면 고정 및 구형 멤브레인 봉투에 의해 동봉된 볼륨과 일치할 수 있습니다. 용액에서 구형 소포의 크기 분포는 561개의 고정된 소포의 AFM 데이터로부터 결정되었다. CryoTEM 이미지의 소포 크기는 AFM 결과와 일치합니다.hyrdrated 엑소좀을 이미징하기 전에 PBS로 표면을 철저히 헹구는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 인바운드 엑소좀이 제거되고 AFM 팁에 대한 첨부 파일이 방지됩니다. 건조된 외민을 이미징할 때는 DI 물을 사용하여 기판을 상승시십시오.DI 세척은 기판이 건조함에 따라 표면에 소금 결정의 형성을 방지할 것입니다. 존재하는 경우, 소금 결정은 이미지 처리어려운 작업을 만들 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

출처: Biller, SJ, et al. 시아노박테리아 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 음성 염색을 통해 투과 전자 현미경을 위한 시아노박테리아 세포외 소포를 준비하여 구조 및 비교 분석을 위해 소포 형태, 크기 및 순도를 고해상도로 시각화하는 방법을 보여줍니다.

투과전자현미경을 이용한 시아노박테리아 세포외소포의 시각화

이 비디오에서는 세포외 소포체 또는 EV의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 컨포칼 현미경을 사용하여 3D 형광 이미징을 활용하며 내재화된 EV와 세포 표면에 부착된 EV를 구별할 수 있습니다.

Extracellular Vesicle Uptake Assay: 3D 형광 이미징 기법을 사용하여 세포외 소포의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 방법

이 비디오는 형광 표지 포획 항체-자기 나노입자 접합체를 사용하여 세포외 소포체의 면역 캡처를 보여줍니다. 이 프로세스에는 복잡한 형성, 형광 표지된 검출 항체를 사용한 염색, 자기 분리 및 항원 특성 분석을 위한 유세포 분석이 포함됩니다.

항원 특성 분석을 위한 세포외 소포체의 면역포획 및 유세포 분석(Immunocapture and flow cytometry of Extracellular Vesicles for Antigenic Characterization)

출처 :  Lunelli, L., et. al. 원자력으로 뇌 폴리솜 들여다보기 현미경.J. Vis. 특급.(2016).이 비디오는 원자력 현미경을 사용하여 폴리솜의 이미징을 보여줍니다. 니켈 이온으로 코팅된 운모 시트는 리보솜이 부착된 RNA를 고정합니다. 샘플을 세척하고 건조시켜 현미경 스테이지에 장착합니다. 캔틸레버 팁은 샘플 표면을 스캔하고 레이저 편향을 기록하여 토폴로지를 매핑합니다. 소프트웨어는 왜곡을 수정하고 고해상도 폴리솜 구조를 시각화하는 데 사용됩니다.

 원자력 현미경을 사용하여 마우스 뇌에서 분리된 폴리솜 이미징

이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법 (dSTORM)은 빛 현미경 검사법의 전형적인 회절 한계를 우회하고 나노 미터 척도에서 엑소좀을 보는 데 사용됩니다. 엑소좀을 특성화하기 위해 2차원과 3차원에서 모두 사용할 수 있다.

3 차원에서 세포 외 소포의 직접 스토카스틱 광학 재건 현미경 검사

우리는 암성 비뇨생식기 세포로부터 기원되는 세포밖 소포(EVs)의 분리 및 동결 파쇄를 위한 프로토콜을 제시한다. 동결 파괴 기술은 EV의 직경과 모양, 그리고 EV 멤브레인의 내부 조직을 독특한 특징으로 드러냈다. 이는 EV가 수신자 멤브레인과 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 데 매우 중요합니다.

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이 논문은 세포외 소포 하위 집합의 특성화를 위해 처리량이 증가한 차세대 다중 매개변수 분석 플랫폼을 제안합니다. 이 방법은 마이크로어레이 바이오칩에 갇힌 소포 표적을 검증하기 위해 원자력 현미경에 의한 도량형 및 형태역학적 분석과 라만 분광법의 결합을 기반으로 합니다.

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