Name: Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 학습하세요 Danio rerio 배아에서 우수한 눈 고랑(SOS)을 시각화하는 표준화된 프로토콜을 통해 척추동물 눈 발달의 진화적 구조를 연구하는 방법을. 이 기술은 재현성 있는 실험 결과를 제공합니다.

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이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 자연과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 앨버타 혁신 기술 선물, 그리고 여 성과 어린이 건강 연구 연구소 (WCHRI)에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 앨버타 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 프로토콜 1: stereomicroscopy와 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미징 사용 하 여 SOS의 시각화
<ol><li>배아 컬렉션<ol>
<li>Dechlorinated 물 탱크에서 여성 제 브라와 남성 zebrafish를 페어링 하 여 저녁에 gdf6a+ zebrafish의 십자가 준비 합니다. 배아는 시간의 작은 범위 내에서 태어난 되도록 구분선을 사용 하 여 여성에서 남성을 구분 해야 합니다.</li>
		<li>다음 아침, 구분선을 끌어 E3 미디어, Zebrafish 책12에 설명 되어 있는 접시에 배아를 수집 하는 30 분 보다 더 이상에 대 한 번 식을 zebrafish를 허용 하 고 28.5 ° C 배양 기에 넣어.</li>
		<li>모든 unfertilized 계란 또는 흰색과 불투명 나타납니다 죽은 태아를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비 및 zebrafish 태아의 라이브 영상<ol>
<li>20 hpf, E3 미디어 0.004 %1-페 닐 2-thiourea (PTU) 안료 생산을 방지 하기 위해 포함 된 교체는 E3 미디어. 참고: 22-24 hpf 같은 약간 나중 timepoint에 PTU의 추가 화상의 시간에는 배아의 초기 나이 실험을 방해할 가능성이 크다. 그러나, SOS의 이미징 방해할 수 있는 등 눈에 나타나는 색소의 밴드는 완전히 착 색을 방지 하기 위해 초기 배아를 치료 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>모든 태아 관찰의 시간을 다양 한 지점에서 올바른 발달 단계에 있는지 확인 하십시오. 이 somite에 수는 명확 하 게 보이는 Kimmel 외.13에 의해 설명 하는 단계에서 이루어집니다 하는 것이 좋습니다. 그 발달 성숙 하지 않은 제거 합니다.</li>
		<li>부드럽게 떨어져 chorion 미세 집게를 사용 하 여 당겨 해 현미경, 및 dechorionate에서 배아 배아를 놓습니다. 등 눈에 SOS를 시각화 합니다. SOS, 눈의 등 쪽 여백에서 들여쓰기로 나타날 수 있으며 선 지 눈에서에 표시 되어야 합니다. 일반 SOS 폐쇄에 대 한 주위에 배아 관찰 hpf 20-23. 지연된 SOS 폐쇄 고기 검사, 28에서 배아 관찰 hpf 이상.</li>
		<li>SOS 폐쇄 지연 하지 않는 보여 주는 배아를 정렬 합니다.</li>
		<li>이러한 배아 해 현미경을 사용 하 여 사진, e 3에서 1 %agarose 포함 하는 배양 접시를 준비 합니다. 가볍게 태아의 노 른 자 태아는 agarose에 배치 되 면 앉을 수 있는 얕은 구멍 생성 하기 agarose의 중심을 찌 르 기. 이렇게 하면 태아 아니다는 것을 경사 각도에서 촬영 되 고 때.</li>
		<li>배아는 agarose 옆에 e 3에 0.003 %tricaine anesthetize</li>
		<li>35 mm 페 트리 접시 포함 gelled 비 1% 낮은 녹는 포인트 agarose e 3에서의 작은 bolus로 배아 배아 화합물 또는 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 전송 (w/v). 신속 하 게 옆으로 잘 낚 싯 줄 또는 속눈썹을 사용 하 여 태아를 놓고을 agarose를 기다립니다. agarose는 회사, 일단 충분 한 e 3는 agarose를 접시에 붓으십시오. 자세한 내용은 Distel 및 Köster14를 참조 하십시오. 참고: 경우는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여, 태아 수 유리 coverslip 아래 접시의 유리에 대 한 배치 되며 X 객관적 렌즈 표준 20 군데.</li>
		<li>물 침수 20 배 대물 렌즈를 사용 하 여 복합 현미경으로 SOS를 시각화. 시각화, 다음 부드럽게 당겨 배아에서 agarose 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 수정 또는 그들의 개발을 계속 하 허용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 2 프로토콜: laminin의 전체-마운트 immunofluorescent 얼룩
<ol><li>전체-마운트 immunofluorescent laminin의 얼룩: 1 일<ol>
<li>단계에서 설명한 1.2.3, 완료 되지 않은 경우에 배아를 Dechorionate 갓 만든된 4%에서 원하는 timepoint에 microcentrifuge 튜브 배아 수정 PFA 실 온 (22-25 ° C) 통에 2 h. 1에서 세척 5 분, 4 회 x PBST. 참고: gastrulation, 다음 배아 수를 해결할 더 나은 dechorionation 후.</li>
		<li>5 분 보육 시간 배아는 고정 발달 단계에 따라 달라 집니다 대 한 실 온에서 10 mg/mL 가수분해 K에에서 배아를 permeabilize (Thisse 및 Thisse 참조15).</li>
		<li>1에서 세척 5 분, 4 회 x PBST.</li>
		<li>5% 염소 혈 청 및 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온 통에 1-2 h에 대 한 1xPBST에서의 솔루션에 배아를 차단 합니다.</li>
		<li>1: 200 희석에 블록 솔루션에서 토끼 안티 laminin 항 체를 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>4 ° C 통에 하룻밤 안티 laminin 1 차 항 체에 태아를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전체-마운트 laminin의 immunofluorescent 얼룩이 지기: 주 2<ol>
<li>1에서 세척 15 분, 5 번에 대 한 x PBST.</li>
		<li>1에서 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488 항 체를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 1:1000의 희석을 x PBST. 참고:이 단계는 다른 이차 항 체를 사용 하 여 사용할 수 있는 리소스는 실험에 맞게 적응 가능 하다.</li>
		<li>4 ° C 통에 하룻밤 이차 항 체에 태아를 품 어. 앞으로이 단계에서 가능한 한 많은 빛에서 방패.</li>
		<li>1에서 세척 15 분, 4 회 x PBST. 필요한 경우 최대 1 주일, 4 ° C에서 배아를 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해 부 및 미 발달 눈의 설치<ol>
<li>원하는 경우 배아 작은 페 트리 접시에 놓고 1에서 배아 deyolk x PBST. 부드럽게 잘 집게와 노른자위를 방해 하 고 노 른 자 색의 가벼운 스크 통해 노 른 자 세포를 제거 하 여 이렇게 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브에서 PBS 글리세롤 시리즈 솔루션의 다음 농도 준비: PBS에서 30%, 50% 및 70% 글리세롤. 30% 글리세롤/PBS, 솔루션 및 가능한 이전 솔루션의 조금 전송 배아를 확인으로 배아를 전송 합니다. 튜브의 바닥에 침 몰 하기 위하여 배아를 기다립니다.</li>
		<li>배아 바닥에 침 몰 할 때, 50% 글리세롤/PBS에 그들을 전송 합니다. 반복 하 고 70% 글리세롤/PBS에 전송.</li>
		<li>일단 태아 70% 글리세롤/PBS에서 침 몰, 해에 대 한 작은 플라스틱 접시에 그들을 이동 합니다.</li>
		<li>태아는 hindbrain에 후부를 베 고 필요한 경우 유전형, 후부 조직을 사용 합니다.</li>
		<li>가능한 작은 글리세롤으로 전송 하는 유리 슬라이드에 머리를 이동 합니다. 집게 또는 다른 정밀한 해 부 도구를 사용 하 여 유지 하는 고정 후부 끝에 개최. 좋은 minutien 핀 또는 다른 정밀한 해 부 도구를 사용 하 여 부드럽게는 앞쪽에서 개 심 실에 삽입 하 고 서로 머리의 오른쪽과 왼쪽 반쪽을 아래로 밀어. 이동 하면서 뒤로 midbrain를 hindbrain 심 실에 기본적으로 중간 선 아래로 머리를 fileting 이것을 반복 합니다. 눈 및 그로 인하여 손상 되지 않은 SOS을 떠나 주변 조직의 수동 조작을 최소화 됩니다.</li>
		<li>위로 아래로, 눈 머리 중간의 각 측면을 탑재 합니다. 위치 4 모서리 (적절 한 거리를 사용 하는 coverslip 떨어져)에서 진공 그리스의 게시물 및 유리 coverslip 커버, 예제와 함께 접촉 하 게 아래로 밀어 순차적으로 각 게시물에는 coverslip까지. 플라스틱 70% 글리세롤은 coverslip의 가장자리에는 글리세롤은 coverslip 슬라이드 사이의 공간을 채우고, 아래 가져온 있도록.</li>
		<li>하루, 또는 매니큐어와 이미지 샘플 매니큐어 건조 했다 후에 coverslip 주위 인감 이미지 샘플. 4 ° c.에 어둠 속에서 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 프로토콜 3: 시각화의 의 조 난 신호를 사용 하 여 eGFP CAAX mRNA
<ol><li>EGFP CAAX mRNA의 합성<ol>
<li>37 ° c.에서 4 시간 동안 1mg pCS2 eGFP CAAX 플라스 미드16 노트 40 mL의 반응 볼륨에서의 선형화</li>
		<li>제한 다이제스트 반응을 중지, 추가 10 RNase 무료 물, 2.5 mL 10 %SDS 및 2.0 mL 10 mg/mL 가수분해 공화국</li>
		<li>50 ° c.에 1 시간을 품 어</li>
		<li>다음 반응에 추가 (전체 용량 200ml) 다음 단계로 진행: RNase 무료 50 mL 물, 20 mL 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2와 75.5 RNase 무료 물 참고: RNase 무료 물 나트륨 아세테이트의 과도 한 희석을 방지 하기 위해 두 개의 별도 경우에 추가 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>페 놀/클로 프롬 추출 및 에탄올 강 수를 통해 DNA의 정화<ol>
<li>추가 200 mL 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜과 소용돌이 20 미 분리에 대 일 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리를 통해 수성 및 유기 단계.</li>
		<li>새로운 microcentrifuge 튜브, 하단 유기 층의 전송 방지를 위 수성 층 전송. 새로운 튜브를 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 참고: 클로 프롬의 추가 선택 사항 이지만 샘플에서 페 놀의 완전 한 제거를 보장 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>20 미 분리 5 분 18000 x g에서 원심 분리를 통해 수성 및 유기 단계에 대 한 소용돌이.</li>
		<li>이전, 새로운 microcentrifuge 튜브, 하단 유기 층의 전송 방지를 위 수성 층 전송.</li>
		<li>3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2의 1/10 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>-20 ° C에서 4 ° c.에 20 분에 대 한 18000 x g 15 분 원심 분리기에서 100 %RNase 무료 에탄올과 오의 3 볼륨을 추가 하 여 DNA를 침전 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.</li>
		<li>70% 에탄올/RNase 무료 찬물 100ml와 펠 릿을 세척. 부드럽게 혼합 후 판이 펠 릿을, 4 ° c.에서 15 분 18000 x g에서 원심 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.</li>
		<li>5 분 동안 펠 릿 건조 하 고 7 mL 물에 DNA를 resuspend. 참고: 펠 릿 해야 사용할 수 있는 공기 흐름에 따라 5 분 이상 건조 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전사 및 eGFP CAAX mRNA의 정화<ol>
<li>RNase 없는 방식으로 한 체 외에 녹음 방송 반응 상용 Sp6 RNA 중 합 효소 키트, 순화 선형화 플라스 미드 DNA 단계 3.2에서의 약 1 밀리 그램을 사용 하 여 준비 합니다. 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어 참고: Sp6 RNA 중 합 효소 출장된 mRNA의 생산을 위해 사용 해야 합니다.</li>
		<li>1 mL DNase 추가 (2 U/mL; RNase 무료) 37 ° c.에 30 분 동안 품 어와</li>
		<li>어떤 상용 RNA 정화 키트와 mRNA를 정화. 약 수-80 ° c.에 저장 반복된 동결-해 동을 피하기 위해 mRNA</li>
	</ol>
</li>
	<li>사출 및 시각화<ol>
<li>1.1 프로토콜에에서 명시 된 배아를 얻을.</li>
		<li>Microinjection 장치를 사용 하 여 1 셀 단계에서 eGFP CAAX mRNA의 300 pg를 주사.</li>
		<li>EGFP 형광 stereoscope를 사용 하 여 눈에서의 밝은 표정으로 배아에 대 한 화면.</li>
		<li>프로토콜 1.2에 설명 된 대로 배아를 이미지.</li>
		<li>또는, dechorionate 4%에서 원하는 timepoint에 배아를 수정 하 고 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에서 4 시간 동안 PFA 이전 일 경우 5 분 PBST, 4 번, 그리고 dechorionate, x 1에 배아를 씻어. 눈을 해 부하 고 프로토콜 2.3에 설명 된 대로 슬라이드에 그들을 마운트.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).</li>
</ol>

저자는 선언에 전혀 상반 되는 관심사를 있다.

여기, 선물이 발전 zebrafish 태아에서 조 난 신호를 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈. 확인 하려면 폐쇄 지연 고기, 우리의 프로토콜에 초점을 맞춘 눈, 비슷한 맥락 막 게 폐쇄 지연 시각화 하는 데 사용 하는 기술을의 지 강과 등 시간적 측면의 두 개의 개별 돌출부의 분리를 구별할 수 있는 능력 복 부 눈에 고기입니다.
이러한 시각화 기술은 SOS의 폐쇄에 그들의 역할을 공부 하는 특정 유전자의 표정을 유도 또는 억제의 효과 연구 하는 다양 한 유전자 조작 기술 함께에서 사용할 수 있습니다. 우리와 같이 우리는 이전에 gdf6a-/- 배아를 사용 하 여 이러한 프로토콜의 손실 영향을 미칠 수는 SOS의 적절 한 폐쇄 하지만 조작으로 어떤 유전자의 표현 효과 공부 하는 프로토콜을 사용할 수 수 하기로 했습니다. 필수. 등 눈에 어떤 형태학 변화 관측 해 현미경을 사용 하 여 예비 공부는 하는 것이 좋습니다. 초기 링크를 결정적으...

척추 동물 눈의 형성 과정이 매우 보존는 신중 하 게 조율 된 세포 신호 경로 조직 유형을 설정 하 고 지정 지역 정체성1. 초기 눈 morphogenesis 하 섭 눈의 아키텍처를 깊은 결함 귀착되 고2눈부신 자주 있다. 같은 하나의 질병 시 컵3의 복 부 측에 맥락 막 눈 균열을 실패에서 유래한 다. 눈 coloboma로 알려진이 장애 4-5000 라이브 출생 및 일반적으로 inferiorly 눈4의 중심에 있는 눈동자에서 돌출 하는 열쇠 구멍 모양의 구조로 만들어 낸 소아 실명의 원인 3-11 %1 발생 추정 5,6. 맥락 막 균열의 기능은 후는 균열의 측면 혈관7을 묶는 데 융합 것입니다 시 컵에 성장 초기 맥 관 구조에 대 한 진입점을 제공 하는 것 이다.
눈 coloboma은 고 대부터 알려져 왔다, 하는 동안 우리가 최근 눈의 우수한/등 쪽 측면에 영향을 미치는 조직 손실 coloboma 환자의 소설 부분 집합을 확인 했습니다. 우리 실험실에서 최근 작품 지칭 우수한 눈 고 랑 (SOS) 또는 뛰어난 균열8zebrafish 등 눈에는 눈 구조의 발견을 주도하 고 있다. 구조는 고 랑과는 균열의 특성은 중요 하다. 한 고 랑 마찬가지로 그것은 비음에서 일시적인 망막에 걸쳐 지속적인 조직 계층입니다. 또한, 구조의 폐쇄는 반대 하는 지하실 막, 2의 융합에 의해 중재 하지 고 전체적 프로세스는 구조는 세포에 의해 채워집니다를 나타납니다. 그러나,는 게와 마찬가지로, 그것은 지하실 막 등 눈의 비 강 및 시간적 측면을 구분 하는 구조 형성. 일관성을 위해 우리는 참조할 SOS로이 텍스트에서.
SOS는 진화론 척추 동물, 물고기, 병아리, 영원, 및 마우스8눈 morphogenesis 동안 표시 되 고에서 보존 됩니다. Zebrafish에 20-60 시간 후 수정 (hpf)에서 존재 하는 맥락 막 게 달리 SOS 매우 과도 20-23 hpf에서 쉽게 볼 수 되 고 결 석 26 hpf8. 우리 실험실에서 최근 연구는, 비슷한 맥락 막 균열, SOS 역할 눈 morphogenesis8동안 혈관 가이드에 발견 했다. 형성 및 SOS의 폐쇄를 제어 하는 요소는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 우리의 데이터 패턴화 유전자8등 복 부 눈에 대 한 역할 강조 했다.
Zebrafish는 SOS를 공부 하는 우수한 모델 생물 이다. 모델 시스템으로 공부 눈 개발에 장점을 제공 합니다: 그것은 척 추가 있는 모델; 각 세대 전시 높은 통치 (~ 200 배아); 그것의 게놈 완전 시퀀싱 된 유전자 조작;를 용이 하 게 그리고 인간의 유전자의 약 70% 이상의 zebrafish orthologue, 그것은 인간의 질병9,10의 이상적인 유전학 기반 모델을 만드는. 가장 중요 한 것은, 그것의 개발 외부 어머니, 그리고 그것의 애벌레는 투명, 쉽게11와 개발 눈의 시각화에 대 한 수 있습니다.
프로토콜의이 세트에서 우리는 SOS zebrafish 애벌레에 구상 될 수 있다 기술을 설명 합니다. 이 보고서에 사용 되는 시각화 기법의 다양 한 정상적인 눈 개발 하는 동안 SOS의 명확한 관측 뿐만 아니라 SOS 폐쇄 결함을 감지 하는 능력 수 있습니다. 우리의 예제에서는 프로토콜 Gdf6의 조사 기능을 한다는 BMP는 등 지역화 눈과 SOS 폐쇄의 알려진된 레 귤 레이 터. 또한, 이러한 기술은 유전적 요인 또는 약리 에이전트에 적절 한 조 난 신호 형성 및 폐쇄에 영향을 식별 하는 실험 조작 결합 될 수 있다. 또한, SOS를 주변 세포를 형태학 상 변화를 관찰 하는 실험을 수 있도록 프로토콜을 통해 모든 세포 막의 형광 이미징이 가능, 포함 시켰습니다. 우리의 목표는 개발 눈의이 소설 구조에 새로운 통찰력을 제공 하는 과학적 사회 전반에 걸쳐 사용할 수 있는 표준화 된 프로토콜의 집합을 설정 하는.

<table><tbody><tr><td>1-페닐 2-티오우레아</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시</td><td>코닝</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>AGA001.1</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>DIC/형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z1</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경 카메라</td><td>Qimaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 고진공 그리스</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염(트리카인)</td><td>시그마 알드리치</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 알렉사 플루오르 488</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>시그마 알드리치</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>이미지 캡처 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>ZEN</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>VWR</td><td>모델 1545</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리(22mm x 22mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pin</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드( PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 pH 6.7 +/- 0.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1752-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-laminin 항체</td><td>Millipore Sigma</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase (2 U/&micro; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 저융점 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td> <td>Invitrogen</td><td>15525017</td><td></td></tr></tbody></table>

danio rerio embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

선 천 성 안구 coloboma 불완전 한 맥락 막 게 폐쇄에서 발생 하는 눈의 열 등 한 측면에서 분열으로 일반적으로 관찰 되는 유전 질환 이다. 최근, 홍 채, 망막, 및 비 발한 구조의 발견에 지도 하는 렌즈의 우수한 측면에서 coloboma 개인의 식별 이라고 뛰어난 균열 또는 우수한 눈 고 랑 (SOS)는 지 느 러 미에 뚜렷이 존재 하는 척추 동물 눈 개발 시 컵의 측면. 이 구조는 쥐, 병아리, 물고기, 그리고 영원에 걸쳐 보존은, 비록 SOS의 우리의 현재 이해는 제한 됩니다. 그것의 형성 및 폐쇄에 기여 하는 요인, 명료 하 게 하기 위해 그것을 관찰 하 고 이상이, SOS의 폐쇄에 지연 등 식별 수 필수적입니다. 여기, 우리 immunofluorescent 얼룩 및 mRNA와 같은 일반적인 분자 생물학 기술로 널리 현미경 기술을 결합 하 여 SOS를 효율적으로 시각화를 사용할 수 있는 프로토콜의 표준화 된 시리즈를 만들 밖으로 설정 overexpression입니다. 프로토콜의이 세트는 SOS 폐쇄 지연 관찰 하는 능력에 초점을 맞추고, 하는 동안 실험의 요구에 적응할 수 있는 하 고 쉽게 수정할 수 있습니다. 전반적으로, 친근 한 메서드는 SOS의 우리의 이해 척추 눈 개발의 현재 지식을 확장을 고급 수를 만드는 노력 하겠습니다.

Zebrafish SOS 20에 나타납니다 hpf 추정 등 망막8에. 넓은 들여쓰기의 초기 좁은 아키텍처에서 23 hpf SOS 전환 및 26 hpf 그것은 더 이상 볼 수8. 따라서, 정상적인 zebrafish 눈 개발 하는 동안 SOS를 검사, 태아는 20-23 hpf 사이 관찰 해야 합니다. 이 기간 동안 SOS와 DIC 이미징 개발 망막 (그림 1)의 비 강 및 시간 반으로 구분 하는 등 눈에 얇은 선으로 통해 해 현미경을 통해 관찰 이다. 더하여, 미묘한 들여쓰기 (그림 1) 눈의 등 쪽 경계에서 볼 수 있습니다. Immunofluorescent laminin의 얼룩, 다음 얇은 라인 될 지하실 멤브레인 (그림 1)를 ...

여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

이 표준화 프로토콜 세트는 최근 개발 중인 눈의 우수한 안구 황액 또는 SOS에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 전 세계의 모든 실험자가 제브라피시 눈 발달 중에 SOS를 명확하게 시각화할 수 있도록 합니다. 이종화 구스 성장 분화 인자 6 A 남성과 여성 얼룩말 피쉬를 분리기의 분리 된 측면에 배치하여 그들의 페어링 전날 저녁에 탈염 된 물 탱크에.다음 아침, 칸막이를 제거하고 물고기가 30 분 이상 번식 할 수 있습니다. 번식 기간이 끝나면 배아를 28.5도 인큐베이터에서 배양용 E3 배지를 함유한 페트리 접시에 배아를 수집합니다. 20시간 후 수정시, 상피제를 E3 배지로 대체하여 0.004%1-페닐-2-티우레아를 보충하여 안료 생산을 방지하고 경현미경으로 배아를 검사하여 모두 적절한 발달 단계에 있는지 확인한다.샘플을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 발달미태아를 버리고 미세한 집게를 사용하여 치리온을 부드럽게 떼어냅니다. 눈의 등부 여백에서 들여쓰기 또는 선으로 나타날 수 있는 SOS를 시각화합니다.그런 다음 SOS 폐쇄 지연을 보이지 않는 배아를 정렬합니다. 해부 현미경을 사용하여 이러한 배아를 촬영하려면 E3 배지에서 1%아가로즈를 함유한 페트리 접시를 준비하고 아가로즈 의 중심을 가볍게 찌르면 배아의 노른자를 배치할 수 있는 얕은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 마취된 배아를 아가로즈위에 측면으로 놓습니다.화합물 또는 공초점 현미경을 사용하여 배아를 이미지하기 위해, 비겔1%의 작은 볼루스를 포함하는 35mm 페트리 접시로 배아를 E3 배지로 옮기고 미세 낚시 라인을 사용하여 배아를 측면 위치에 신속하게 배치한다. 아가로즈가 식으면 아가로즈를 덮기 위해 충분한 E3 배지를 접시에 부어 20배의 물 침수 목적 렌즈를 사용하여 SOS를 시각화합니다. 이미징 후, 부드럽게 배아에서 아가로즈를 당기고 4 %의 파라 포름 알데히드에 조직을 고정하거나 제브라피쉬가 개발을 계속할 수 있도록합니다.형광 mRNA 발현에 의해 SOS를 시각화하려면, 1 세포 단계에서 배아에 향상된 GFP-CAX mRNA의 300 피코그램을 주입하는 미세 주입 장치를 사용합니다. 그런 다음, 형광 성 입체코프를 사용하여 밝은 향상된 GFP 발현을 가진 배아를 검사하고 입증된 바와 같이 이미징 방법 중 하나에 의해 배아의 이미지를 얻습니다. 배아 제브라피시 라미닌의 전산 면역형 염색의 경우, 입증된 바와 같이 배아를 비우고 실온 셰이커에서 2시간 동안 신선하게 준비된 4%파라포름알데히드의 미세센트심분리기 튜브에서 배아를 수정합니다.고정의 끝에서, PBS 플러스 Tween, 또는 PBST에서 배아를 4 번 세척한 다음 실온에서 밀리리터 당 10 마이크로 그램 또는 Proteinase K에서 투과화를 5 분 동안 세척당 5 분 동안 세척합니다. PBST에서 4회 퍼미빌화된 배아를 세척하고 실온 셰이커에서 1~2시간 동안 PBST에 있는 소 혈청 알부민의 밀리리터당 5%의 염소 세럼과 2밀리그램으로 배아를 차단합니다. 차단 인큐베이션의 끝에서, 셰이커에 하룻밤 섭씨 4도에서 관심의 1 차적인 항 라미닌 항체에 있는 배아를 배양합니다.다음 아침, PBST에서 배아를 세척 당 15 분 동안 5 번 씻고 빛으로부터 보호 되는 셰이커에 섭씨 4도에서 하룻밤 적절한 이차 항체로 조직을 라벨. 다음 아침, PBST에서 배아를 세척 당 15 분 동안 4 번 씻고 신선한 PBST가 들어있는 작은 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 부드럽게 노 른 자를 방해 하 고 노 른 자 낭의 가벼운 긁어 통해 노 른 자 세포를 제거.DEyolked 배아를 PBS에서 갓 준비된 30% 글리세롤로 옮기고, 배아를 용액 위에 놓고 가능한 한 이전 용액을 거의 옮기고 배아가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 기다립니다. 배아가 용기의 바닥에 도달하면, PBS 솔루션에서 순차적으로 50%와 70%의 글리세롤로 옮기는 것만으로도 그냥 입증된 것처럼. 배아가 70% 글리세롤 용기의 바닥에 침몰한 후 샘플을 작은 플라스틱 접시로 옮겨 해부를 위해 배아를 뒷뇌로 분리합니다.미세 해부 도구를 사용하여 한 쪽 머리를 가능한 한 적은 글리세롤이 있는 유리 슬라이드로 이동하고 미세미누티엔 핀을 내부에서 뇌 심실에 부드럽게 삽입하여 머리의 오른쪽과 왼쪽 절반을 서로 분리합니다. 머리가 미드라인 아래로 완전히 채워지면 머리의 양쪽을 중간라인 아래로, 눈쪽을 위로 올려다보세요. SOS는 20~23시간 후 의 해부 현미경을 통해 관찰할 수 있으며, 개발망막의 비강과 측두엽을 분리하는 등쪽 눈의 얇은 선으로서 차동 간섭 조영영상을 통해 관찰할 수 있다.또한, 눈의 등대 경계에서 미묘한 들여쓰기가 보일 수 있다. 라미닌의 면역형광 염색에 이어, 얇은 선은 지하 막으로 확인될 수 있다. SOS 폐쇄가 지연되면, 그것의 장기간된 존재는 해부 현미경의 밑에 눈의 등쪽쪽에 뚜렷한 갈라짐으로 관찰될 수 있습니다.차동 간섭 대비 영상을 사용하여 복합 현미경으로 관찰될 때, 이 특징은 등쪽 눈의 선으로 명확하게 보이는 SOS에 의해 분리된 눈의 비강 및 측두측으로 더욱 두드러지게 합니다. 야생형 제브라피시의 후28시간 후 수정으로 라미닌 얼룩은 SOS가 완전히 폐쇄되어 균열 폐쇄 지연을 모니터링하기에 이상적인 단계라는 것을 분명하게 보여줍니다. 향상된 GFP-CAX mRNA의 주사는 SOS 폐쇄로 이끌어 내는 세포의 형태에 있는 변경을 추적하기 위한 살아 있거나 고정된 태아의 세포막의 시각화를 허용합니다.SOS를 시각화하는 것은 좁고 일시적이기 때문에 어려울 수 있습니다. 그러나 이후 시점에서 클로저 지연을 평가할 때 일관된 채점 방법을 유지해야 합니다. 이 기술은 적당한 SOS 형성 및 폐쇄에 영향을 미치는 유전 요인 또는 약리학 에이전트를 확인하기 위한 실험적인 조작과 결합될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

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이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

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여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

여기에 설명된 프로토콜은 생후 5일 된 제브라피쉬 유충의 두개안면 연골을 염색하고 해부하기 위한 간단하고 따라하기 쉬운 절차를 제시합니다. 다양한 발달 조건에서 이러한 구조의 해부학, 모양 및 크기를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Alcian Blue로 염색한 Zebrafish 두개안면 조직의 해부

학습하세요 Danio rerio 배아에서 우수한 눈 고랑(SOS)을 시각화하는 표준화된 프로토콜을 통해 척추동물 눈 발달의 진화적 구조를 연구하는 방법을. 이 기술은 재현성 있는 실험 결과를 제공합니다.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

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