Name: 간 질 초점으로 γ-아미노 버터 산 (GABA)의 전기 영동 전달은 생쥐의 발작을 방지 합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 배우세요 뇌 간 질환 초점으로 GABA의 전기영동 전달을 이용한 발작 조절 방법을 생쥐 모델에서. 이 기술은 정확한 약물 전달로 뇌전증 치료 및 다른 신경계 질환 연구에 활용됩니다.

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C.M.P.는 국제 교육 기관에서 관리 하는 휘 태 커 국제 학자 보조금의 기금을 인정 한다. 에반젤린는 마리 퀴리 IEF (No. 625372)의 후원을 받았습니다. A.W.는 유럽 연합 (eu)의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에 따른 유럽 연구 위원회 (ERC)의 자금 조달을 승인 합니다 (보조금 계약 번호 716867). A.W.는 엑스-마르세유 대학 A * MIDEX의 우수성 이니셔티브를 인정, 프랑스의 "Investissements" 프로그램. 저자는 일 케 Uguz 박사, 사 히 카 나 우, 빈 첸 쿠 토 박사, 메리도 나 휴 박사, 마크 페로 박사, 그리고 조 소 피아 마그리트가 유익한 토론에 참여 했음을 인정 합니다.

모든 실험 절차는 연구소 드 신경 과학 des 시스템의 윤리적 지침에 따라 수행 하 고 지역 윤리 위원회 및 수의학 사무실에 의해 승인.
참고: 17 명의 성인 남성 OF1 마우스를 실험에 사용 하였다. 마우스는 음식 및 물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 빛/어두운 주기에 훈련을 받았다.
1. 마 취
<ol><li>케 타 민과 자일 린 100 (복 강 내의 체중과 10mg/kg 체중을 각각의 혼합물에 주입 하 여 동물을 마 취 시켰다.</li>
	<li>
호흡 속도와 위스키를 관찰 하 고 통증에 대 한 마우스의 반응을 확인 하 여 마 취 수준을 확인 하십시오. 참고: 마우스의 호흡이 규칙적이 되 면, 어떤 위스키도 관찰할 수 없고, 동물이 꼬리 핀 치에 반응 하지 않으면 마 취는 계속 될 정도로 깊을 것입니다.<ol>
<li>동물을 전기적으로 프로그래밍 가능한가 열 패드 위에 놓으십시오. 석유 젤리 기반 제품 ( 재료 표참조)을 사용 하 여 직장 온도 프로브를 덮고 체온을 모니터링 하기 위해 마우스의 항문에 부드럽게 배치 하십시오 (1 ~ 2cm 깊이). 수술 절차 및 실험 기록 중에 36.5과 37.5 ° c 사이의 체온을 유지 합니다.</li>
		<li>마우스의 반사, 수염 운동 및 호흡의 주파수를 확인 하 여 마 취 수준을 모니터링 합니다. 적어도 30 분 마다 기록 된 마 취의 수준을 고려 하 여 케 타 민 lazine 칵테일 (20 ~ 50 µ L, 이전과 같은 농도로 사용 된 농도)의 소량을 근육 내에 제공 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 수술/두개 절제술
<ol><li>마우스의 머리를 입체 프레임으로 고정 합니다. 30 G 바늘을 사용 하 여 계획 된 절 개 부 위에서 피하 지방 진통제 ropivacm(5µ, 7.5 mg/mL, 재료 표참조)를 주입 하십시오. 5 분 동안 사용 하면 효과가 적용 됩니다.</li>
	<li>메스로 두개골 위의 피부에 직선 컷 중간 선을 확인 합니다. 미세 집게로 부드럽게 피부를 당겨 하 고 더 작업에 대 한 노출 두개골을 떠나 불독 serrefine 클램프 옆으로 클램프.</li>
	<li>메스 또는 유사한 도구를 사용 하 여 처마 돌림의 두개골을 청소 합니다. 표면 출혈의 경우 면봉 이나 종이 타월의 작은 조각으로 혈액을 제거 하십시오.</li>
	<li>폴 리 에틸렌 (ethylenedioxythiophene) 폴리스 티 렌 술 포 네이트 (PEDOT: PSS) 코팅 접지 나사 (크기: #00 직경: 0.047, 길이: 1/8 납땜 와이어를 사용 하 여 커넥터와 앰프 헤드 스테이지에 연결 하십시오.</li>
	<li>원하는 구멍 부 위에 두개골을 적시고 소 뇌가 보일 때까지 두개골 위에 있는 미세한 원형 드릴 비트 (0.4 mm 직경)를 사용 하 여 고속으로 구멍을 뚫습니다. 구멍에 접지 나사를 넣고 소 뇌의 상단에 도달 할 때까지 정밀 드라이버로 나사. 참고: 헤드 스크류는 PEDOT: glycidyloxypropyl) 트리메 (GOPS)를 중량 기준으로 하 여 140 ° c에서 90 분 동안 베이킹 하 여 딥 코팅 하였다. PEDOT: PSS는 생체 적합성으로 알려진 체적 커패시턴스를 갖는 공액 고분자입니다. GOPS는 PEDOT: PSS와 혼합 된 교차 링커로 수성 매체의 안정성을 높입니다 (그림 2).</li>
	<li>입체 프레임의 도움으로 원하는 뇌 영역에 대 한 입체 좌표를 측정 합니다. 예를 들어, 관심 영역은 마우스32에 대 한 뇌 아틀라스를 기반으로 하는 브 레 gma 포인트에서 해 마, 전후 (AP)-1.8 mm 및 mediolateral 1.8 mm 이다. 참고: 다음은 오른쪽 반구의 좌표입니다 (그림 2).</li>
	<li>신뢰할 수 있는 치과 용 드릴 ( 재료 표참조)을 사용 하 여 대상 영역 위의 두개골에서 약 1 ~ 2mm 직경의 면적이 얇고 잘 다듬어진 투명 한 뼈 막이 남아 있을 때까지 빠른 속도로 설정 합니다.</li>
	<li>그 후, 골 막의 두께가 충분히 얇으 면 (< 200 µm) 얇은 집게로 작은 구멍을 만들고 뼈33의 얇은 층을 부드럽게 제거 하십시오. 경질을 제거 하기 위해 주문 제작 된 훅 팁 바늘을 사용 하십시오. 부 종 절제술 및 경도 절제술의 크기를 최소화 하 여 부 종의 발병을 방지 하 고 뇌의 심장 및/또는 호흡기 진동을 최소화 합니다. 참고: 두개 절제술은 건조를 방지 하 고 실험 중에 정기적으로 리필 되는 식 염 수 용액으로 채워야 합니다 (그림 2).</li>
</ol>3. 멀티 채널 실리콘 프로브의 삽입
<ol><li>실리콘 프로브가 다른 두 임 플 란 트의 위치 지정을 위한 충분 한 공간을 두고 전극, 이온 펌프 및 마이크로 피 펫의 기록 및 주입 부위를 최대한 가깝게 유지 하기 위해 약간의 AP 각도 (20 °)로 입체 암을 사용 하십시오. 참고: 전극, 주사기 및 이온 펌프에는 디 메 틸 설 폭 사이드의 이식 흔적 (0.5 mg/ml DiI)의 사후 시각화를 위해 DiI 얼룩 용액 (1 dioctadecyl, 3, 3 tetramethylindocarbocyanine)을 떨어 트 렸 다.</li>
	<li>실리콘 프로브를 자기 홀더에 부착 된 입체 암에 놓고 입체 프레임 옆에 놓습니다. AP 각도 (20 °)를 설정한 다음 프로브를 헤드 스테이지와 접지 나사에 연결 합니다.</li>
	<li>
미크론 단위의 정밀한 입체 암이 나 전동 마이크로 매니 퓰 레이 터를 사용 하 여 실리콘 프로브를 해 마로 천천히 내려 측면 움직임을 피합니다 (그림 2 와 그림 3).
	<ol>
<li>헤드 스테이지, 커 넥 티 드 앰프 및 컴퓨터-전기 신경 신호를 사용 하 여 대상 dorsoventral (DV) 위치까지 피 질의 상단에서 멀티 채널 실리콘 프로브를 이동 하면서 기록 소프트웨어와 기록을 시작 합니다 (- 1800 대뇌 피 질 표면에서 µm). 컴퓨터 화면에 침투 하는 동안 로컬 필드 전위 신호 (LFP)를 기록 하 고 시청 합니다. 참고: 기록 하는 동안 천천히 그리고 지속적으로 이동 하 고, 침투에 대 한 더 나은 시각적 제어를가지고 대상 영역에 도달 하도록 프로브의 하강 제어.</li>
		<li>기록 된 LFP의 하 마 형성의 피라미드 층에서의 리플 활성을 표적 영역의 마커로 서 사용 한다. 참고: 리플 활동은 기록 사이트 사이에 100 µm 거리를 갖는 다중 채널 실리콘 (Si) 프로브의 하나 또는 두 개의 인접 한 채널에 표시 됩니다 (그림 4).</li>
		<li>멀티 채널 Si 프로브 (그림 4)를 사용 하 여 다채널 증폭기의 소프트웨어 ( 재질 표참조)를 통해 피 질과 해 마의 레이어에서 LFP 신호를 동시에 기록할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. µ FIP의 삽입
<ol><li>Μ FIP의 입구에 튜브 ( 재료 표참조)를 연결 하 고 0.05 M GABA 용액으로 프로브를 채 웁 니다. 튜브를 제거 하 고 파라핀 필름 포장으로 입구를 닫으십시오. 전기 리드를 소스 측정 유닛에 연결 합니다.</li>
	<li>Mediolateral (MP) 각도로 입체 암의 도움으로 µ FIP를 삽입 합니다. Si 프로브는 전체 과정에서 삽입 된 상태로 유지 됩니다. 참고: µ fip는 매우 유연 하 고 뇌 표면에 도달 할 때까지 똑바로 유지 하기 위해 작고 깨끗 한 페인트의 지원 혜택을 누릴 수 있습니다. 그 단계 후에, µ FIP는 축방향 운동으로 부드럽게 낮출 수 있습니다.</li>
	<li>Μ FIP를 천천히 축방향 움직임으로 낮추고 궤적 중에 dorsoventral (-1200 µm 대뇌 피 질 표면에서) 좌표에 도달 할 때까지 구부러지게 하십시오. 참고: Μ FIP 팁에서 출구의 300 μ m 거리를 고려 하 여 가능한 한 서로 가깝게 두 장치 (µ FIP 및 실리콘 프로브)를 넣어 보십시오. 주의: 삽입 하는 동안 장치 및 커넥터 사이에 기계적인 문제가 발생 하지 않도록 하십시오 (그림 2b 및 그림 3b).</li>
</ol>5. 발작 유도를 위한 장치 준비
<ol><li>주사기의 금속 바늘 (10 µ L)을 변경 합니다 ( 재료 표참조). 바늘 고정 금속 부분을 제거 하 고 마이크로 피 펫을 배치 하 고 고정 합니다 (외경 [OD]: 1.2, 0.75 내경 µm, 팁 지름: 20 ~ 50 섕크의 테이퍼를 ± 0.5 cm로 하 고 바늘 고정 요소를 교체 합니다.</li>
	<li>주사기와 부착 된 붕 규 산 마이크로 피 펫을 인공 뇌 척 수액에 4AP (50)의 주입을 위한 20 ° lateromedial (LM) 각도로 위치 시킵니다. 주의: 주사기의 금속 바늘 이나 마이크로 피 펫을 50 µm 보다 큰 팁으로 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>자동 마이크로 주입 펌프의 도움으로 500 nL-50 mM 4AP의 µ L을 그립니다.</li>
</ol>6.4AP 주입을 위한 주사기에 부착 된 유리 피 펫의 삽입
<ol><li>주사기에 부착 된 유리 마이크로 피 펫을 조 준 된 DV 위치 (-1500 µm)로 낮추고 4AP 솔루션의 250 nL을 주입 합니다 (그림 2 와 그림 3). 녹음 소프트웨어로 녹화를 시작 합니다. 화면을 보고 첫 번째 interictal 스파이크가 나타날 때까지 기다립니다.</li>
	<li>첫 번째 interictal 스파이크의 모양으로 즉시 µ FIP에 의해 GABA 배달을 시작 합니다. 에 대 한 소스와 대상 사이 1 V를 적용 하 여 GABA를 제공 100 s에 대 한 그 뒤에 1soff, 30 사이클에 대 한. 녹음 소프트웨어의 도움으로, 최소 2 시간을 기록 합니다. 참고: 전달 된 GABA의 총 질량은 약 1 nmol (그림 5).</li>
	<li>실험이 끝날 때 삽입 된 프로브와 접지 나사를 부드럽게 제거 하 고 입체 장비에서 동물을 제거 합니다. 동물은 약물의 과다 복용 (i. p. 100mg/kg pentobarbital을 사용 하 여 안락사 시켰다. 죽음은 호흡과 순환의 중단에 의해 확인 되었다.</li>
</ol>7. 임 플 란 트의 배치 평가
<ol><li>동물을 안락사 한 후에, 먼저 50 mL의 생리 식 염 수와 함께이를 사용 하 고 0.1 M 인산 완충 제 (PFA)34에서 4% 파라 포 름 알 데히드를 함유 하는 얼음 차가운 고정 용액을 150 ML로 첨가 하였다. 주의: PFA는 위험 하므로 주의 해 서 취급 해야 합니다.</li>
	<li>동물을 욕 한 다음 두개골의 상단과 측면에서 피부와 근육을 제거 하십시오. 포 아 멘 매그넘에서 시작 하 여 두개골을 귀 쪽으로 옆으로 절 개 하 고 시상 하 부를 절제 하 여 뇌를 손상 시 키 지 않도록 주의 하십시오. 뼈 트리머를 사용 하 여 두개골을 부드럽게 제거 합니다. 뇌를 제거 하 고 뇌 매트릭스 ( 재료 표참조)의 도움으로 관심 영역 (bregma 포인트에서-1 ~ 3mm AP)에서 조직 블록을 절단 합니다.</li>
	<li>조직 블록을 진동의 시 편 홀더에 접착 하 고, 스탠드를 넣고, PB 목욕에서 40 µm 두께로 바이브 레이 팅을 설정 하 여 40 µm 코로나 섹션을 만듭니다.</li>
	<li>0.1 M PB로 광범위 하 게 세척 하십시오. 신경 교 섬유 소 산 단백질 (GFAP) 염색31에 대 한 조직 학적 프로토콜을 따른다.</li>
	<li>슬라이드에 섹션을 장착 하 고 amidinophenyl-인 돌-carboxamidine)를 포함 하는 마운팅 매체로 커버 합니다 ( 재질 표참조).</li>
</ol>8. 공초점 현미경
<ol><li>스테인드 코 날 섹션이 있는 슬라이드를 공초점 현미경의 20x 목표 하에 배치 합니다. 대상 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>염료에 대 한 최적의 여기 및 방출 (exc/ems) 필터 세트를 다음과 같이 선택 합니다. DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm 및 형광 ( 재료 표참조) = 490/525 nm. 참고: 단면 마다 염색이 다르기 때문에 최소 및 최대 구동 및 검출의 적절 한 범위는 각 섹션에 대해 결정 되어야 하며, 여기서 가장 조밀 하 고 밀도가 가장 높은 영역은 모두 발광을 나타냅니다.</li>
	<li>밀도가 가장 낮은 영역을 선택 하 고 레이저 강도와 감지를 높은 값으로 설정한 다음,이 값이 감지 된 방출의 과다 포화를 유발 하는지 여부를 가장 깊은 영역에서 확인 합니다. 이 경우 값을 낮추고 밀도가 가장 낮은 영역으로 다시 확인 합니다. 낮은 염색 수준에서 가능한 가장 높은 검출에 도달할 때까지이 단계를 반복 하 고 높은 얼룩이 있는 영역에서 지나치게 포화 수준이 아닌 적절 한 것으로 강조 합니다. 모든 염료에 대해이 과정을 반복 합니다.</li>
	<li>타일 당 512 x 512 픽셀로 현미경의 타일 스캔 기능을 사용 하 여 사후 처리를 위한 적절 한 해상도로 프로브 삽입 사이트의 큰 개요를 얻습니다.</li>
</ol>

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간 질에 대 한 급성 마우스 모델에서 새로운 실험적 프로토콜을 개발 함으로써, SLEs는 발작 초점에 이식 된 µ FIP의 도움으로 성공적으로 제어 될 수 있었습니다. 시간 및 공간 정밀도와 GABA를 제공 하는 그것의 기능 덕분에, 4AP 유도 SLEs 포착의 개시에 통제 되었다. 간 질병의 치료는 이론적으로는 발작 시작의 장소에서 신경 네트워크 방전의 제어가 달성 되는 경우에 가능 하다. 제시 된 프로토콜은 주입 된 억제 신경 전달 물질의 국 소화가 가능한 경우이를 증명, GABA, 시간에 간 질 초점에 도달 하기에 충분히 정확 하다. 그러나, 그 경우 간 질 발작 뇌의 큰 영역에 영향을, 정확 하 게 지역화 GABA 납품에 의해 발작 제어는 불가능. Μ FIP 프로브의 영향 영역은 출구 로부터 약 550 μ m의 반경으로 추정 되었다. 이것은 SLEs가 4AP 주입이이 지역31에 국한 된 경우에만 영향을 받을 수 있다는 것이 입증 되었습니다.
<p class="jove_co...

간 질은 넷째 가장 일반적인 신경 장애: 인구의 약 1%는 간 질을 앓고 있으며, 영향을 받는의 1/3 정도 재발 발작이 있습니다. 대부분의 경우 발작을 약물로 조절할 수 있습니다. 그러나, 약물 치료는 개별적으로 모든 환자에 대 한 설정 될 필요가, 어디 적절 한 먹이 지 수 년은1,2를 찾는 데 걸리는. 추가적으로, 대부분의 약물은 삶의 질을 감소 시키는 심각한 부작용을 갖는다,4,5,6,7. 마지막으로, 환자의 30%에서 환자는 약물에 내성이 있으며, 일정 한 단일 발작 발생기 궤적의 경우에만 전염 성 신경 수술이 발작의 발생을 감쇠 할 수 있습니다8. 따라서, 현대 간 질 연구에 있는 주요한 이니셔티브는 위험한 상태에 환자에 있는 재발 하는 발작을 방지할 수 있는 새로운 전략을 발견 하는 것입니다, 강한 약물 치료 및 침략 적인 전염 하는 수술의 필수품을 감소 시키면서.
간 질 발작이 뇌의 흥분 성 및 억제 회로 내에서 불균형이 있을 때 발생 (일반화 된 뇌 전 증) 또는 두뇌의 국부 적 인 부분 (초점 간 질), 비정상적인 패션에서 뉴런 방전 등9 , 10 , 11. 항 경련 제는 발작 예방에서 두 가지 방법으로 작용할 수 있습니다: 여기를 감소 시키거나 억제를 강화12. 구체적으로, 그들은 세포 막 (13 )에서 이온 채널에 영향을 주는 것에 의해 뉴런 세포의 전기적 활성을 수정 하거나 억제 신경 전달 물질 GABA 또는 흥분 성의 영향을 미치는 신경 간의 화학적 전달에 작용 하 여 시 냅 스14,15에서 조미료. 일부 약물에 대 한, 행동의 모드는 알 수 없는18. 또한, 약물 치료는 환자에 게 지속적인 영향을 주며 발작의 유 병 역학에 적응할 수 없습니다. 이상적으로, 행동의 특정 메커니즘을 가진 약물은 근본적인 간 질 과정에 행동. 최적의 치료는 뇌의 interictally를 만지지 않을 것 이지만 발작이 발달 하기 시작할 때 즉시 작용할 것입니다. 그와는 대조적으로, 간 질의 모든 경우에, 약물은 지금 전체 뇌와 환자의 몸 전체에 영향을 미치는 체계적인 치료를 의미9.
간 질 발작 뇌 외상 등 초기 모욕 후 몇 년 동안 나타날 수 있습니다. 첫 번째 자발적 발작의 초기 모욕과 발생 사이의 기간은 신경 네트워크 연결 및 축 삭의 실종과 함께 신경 사 멸을 포함 하 여 상당한 분자 및 세포 조직 재구성을 특징으로 한다 새로운 연결의 출현으로 발 아/neosynaptogenesis19,21. 발작이 재발 되 면, 그들의 빈도와 심각도는 증가 하는 경향이 있다, 더 많은 뇌 영역을 포함. 발작 기원과 전파의 규칙이 다를 수 있기 때문에, 전파 네트워크에서 발작 개시 (epileptogenic 지역)의 사이트를 구별 하는 것이 중요 합니다. 인간 조직 및 간 질 실험 모델에서 수행 된 연구는 회로의 재 조직 및 발작 생성 능력에 관한 중요 한 데이터를 제공 하 고 있다20,21,22, 23. 그러나 이러한 재조직이 적응 적 응답 인지 또는 epileptogenesis 발작 발생 및 전파12와 관련이 있는지를 확인 하는 것은 어렵습니다.
따라서, 간 질 초점을 현지화 하 고 항 경련 제를 국 소 적으로 적용 하는 것은 현대 간에 서 연구에서 주요 과제 중 하나입니다. 간 질 및 일부 임상 연구의 동물 모델을 사용 하는 몇 가지 실험은 발작 사건의 발병을 발견 하 고 뇌24,25,26,27에서 기저 기전을 정의 하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해, 4ap-유도 간 질 모델 (28,29,30,31 )을 사용 하는 새로운 실험 프로토콜을 개발 하 여 3 개의 정밀한 삽입을 가능 하 게 하는 급성 마우스 준비 생체 내 네트워크 활동이 고도로 현지화 된 방식으로 조작 되는 해 마의 주어진 영역으로 장치. 유리 마이크로 피 펫에의 한 국부 적 4AP 주입은 해 마에서 국 소화 된 자리에서 간 질 SLEs를 유도 하는 데 도움을 주며, 한편 신규 한 중합체 기반 µ FIP 프로브의 도움으로 발작 활성의 제어가 동시에 뉴런을 기록 함으로써 달성 된다 장치의 녹화 사이트와 전기적 활동. 해 마 지역 필드 활동은 또한 피 질 및 해 수에서 동시에 층 별 방식으로 멀티 채널 실리콘 프로브로 모니터링 된다.
최근에 발명 한 µ FIP 프로브는 적용 된 전기장을 사용 하 여 마이크로 유체 채널에 저장 된 전 하 약물을 이온 교환 막 (IEM)을 통해 주변 조직으로 밀어내는 방식으로 작동 합니다 (그림 1). IEM은 한 종류의 이온 (양이온 또는 음이온)만을 선택적으로 전송 하 고, 따라서 "off" 상태에서 수동 확산을 제한 하 고 주변 조직에서 장치에 반대 하 여 충전 된 종을 수송 하는 작업을 합니다. 전기장은 미세 유체 채널 내부에 있는 소스 전극과 디바이스 외부에 있는 타겟 전극 사이에 작은 전압 (< 1V)을 인가 함으로써 필요에 따라 생성 된다 (이 경우에는 동물 모델의 헤드 스크류). 약물 전달 속도는 소스와 타겟 전극 사이에 인가 된 전압과 측정 된 전류에 비례 합니다. 약물 전달의 정확한 tunability는 µ FIP의 주요 이점 중 하나입니다. 또 다른 중요 한 이점은, 유체 또는 압력 기반 약물 전달 시스템에 비해, µ FIP에서 약물이 그들의 캐리어 용액 없이 IEM을 통해 전달 되는 약물 전달 출구에서 무시할 압력 증가가 있다는 것 이다.
Μ FIP는 "off" 때 GABA의 수동 누출의 소량이 있다, 하지만 이것은 SLEs를 영향을 하지 발견. Μ FIP는 우리가 이전에 보고 한 전통적인 미세 제조 방법에 따라 주문 제작31.
재발 성 발작을 방지 하는 한 가지 방법은 처음에 또는 심지어 첫 번째 발작 이벤트 전에 네트워크 방전의 봉쇄 이기 때문에, GABA 억제 신경 전달 물질을 간 질 초점으로 전달 하기 위한 제시 된 방법은 훌륭한 국 소 간 질 환자에서 발작 제어를 위한 치료 적 가능성. 이후 GABA는 내 인 성 기질, 그것은 생리 적 농도에서 변경 되지 본질적인 신경 속성을 나뭇잎. GABA의 낮은 수준의 로컬 응용 프로그램은 자연스럽 게 억제에 응답 하는 세포에 영향을 미칠 것입니다., 생리 적 억제에 비슷한 효과 일으킬 것입니다., 깊은 뇌 자극에 반대 (DBS), 모든 세포를 자극 하 여 비 특이 한 행동 그 환경에서 신경 네트워크의, 여기 및 억제를 포함 하는 혼합 된 응답을 일으키는. 결론적으로, 제안 된 방법은 DBS 보다 발작 제어에 대 한 보다 구체적인 접근법을 제공 한다.

<table><tbody><tr><td>4AP</td><td>시그마</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab15007</td><td></td></tr><tr><td>앰프</td><td>Neuralynx, 몬타나, USA</td><td>Digital Lynx 4SX</td><td></td></tr><tr><td>앰프</td><td>앰프liplex</td><td>KJE-1001</td><td></td></tr><tr><td>Atlas Stereotaxique&nbsp;</td><td>Allen Atlas</td><td>978-0470054086</td><td></td></tr><tr><td>Borosilica 유리 피펫</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-15</td><td></td></tr><tr><td>Brain Matrix</td><td>WPI&nbsp;</td><td>RBMA-200C</td><td></td></tr><tr><td>뼈 트리머</td><td>FST</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>커넥터</td><td>INSTECH</td><td>SC20/15</td><td></td></tr><tr><td>Coton tige</td><td>Monoprix</td><td>EMD 6107OD</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Menzel-Glass</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>FOREDOM</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>F.S.T.</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 단클론 항체</td><td>Thermofisher</td><td>53-9892-80</td><td></td></tr><tr><td>GOPS</td><td>Sigma</td><td>440167-100M</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton seringe&nbsp;</td><td>해밀턴&nbsp;</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>헤드스크류</td><td>구성 요소 공급</td><td>TX00-2FH</td><td></td></tr><tr><td>히팅 패드&nbsp;</td><td>하버드 기구</td><td>341446</td><td></td></tr><tr><td>분사 펌프</td><td>WPI&nbsp;</td><td>UMP3-3</td><td></td></tr><tr><td>Keithley</td><td>Tektoronix</td><td>216A</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Renaudin</td><td>5787419</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 홀더</td><td>Supertech Instruments</td><td>MH-1</td><td></td></tr><tr><td>마우스</td><td>Charles River</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>모터 매니퓰레이터</td><td>Scientifica, 영국</td><td>IVM</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>시그마</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>시그마</td><td>7558807</td><td></td></tr><tr><td>NeuroTrace DiI&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>N22880</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>KIMBERLY CLARK</td><td>7552000</td><td></td></tr><tr><td>PB</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>PEDOT:PSS</td><td>CLEVIOS</td><td></td><td></td></tr> 81076212 <tr><td>PFA</td><td>Acros Organic</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>직장 온도 프로브</td><td>하버드 장치</td><td>521591</td><td></td></tr><tr><td>Ropivacaine&nbsp;</td><td>KABI</td><td>1260216</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>F.S.T</td><td>AUST</td><td></td></tr><tr><td>R195806 Seringue&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine 클램프</td><td>F.S.T</td><td>18050-28</td><td>4 권장</td></tr><tr><td>실리콘 프로브</td><td>NeuroNexus, Michigan, USA</td><td>A2x16-10mm-50-500-177 또는 A1x16-5mm-150-703</td><td></td></tr><tr><td>Stereotoxic 프레임</td><td>스톨팅</td><td>51733U</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Slide</td><td>ThermoScientific</td><td>J38000AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>튜빙</td><td>INSTECH</td><td>LS20</td><td></td></tr><tr><td>바셀린&nbsp;</td><td>Laboratoire Gilbert</td><td>3518646126611</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield DAPI</td><td>Vector Laboratories, 캘리포니아, 미국</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome, Leica VT1200S</td><td>Leica Microsystems</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>바이엘</td><td>4007221032311</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 프로브</td><td>Neuromicrosystems Ltd</td><td>A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50</td><td></td></tr></tbody></table>

간 질 초점으로 γ-아미노 버터 산 (gaba)의 전기 영동 전달은 생쥐의 발작을 방지 합니다.

Electrophoretic Delivery of &#x3B3;-aminobutyric Acid (GABA) into Epileptic Focus Prevents Seizures in Mice

간 질은 전세계 수백만의 사람들에 영향을 미치는 신경학 상 무질서의 그룹입니다. 약물 치료는 70%의 경우에 도움이 되지만, 심각한 부작용은 환자의 삶의 질에 영향을 미친다. 더욱이, 간 질 환자의 높은 비율은 약물 내성; 그들의 경우에는 신경 수술이 나 신경 자극이 필요 합니다. 따라서 간 질 연구의 주요 목표는 부작용 없이 간 질을 치료 하거나 약물 내성 환자에서 재발 성 발작을 예방 할 수 있는 새로운 치료법을 발견 하는 것입니다. 신경 공학은 새로운 전략과 기술을 사용 하 여 간 질 환자를 위험에 치료할 수 있는 더 나은 솔루션을 찾도록 합니다.
간 질병의 급성 마우스 모델에서 신규 한 실험 프로토콜을 시연 하는 것으로 서, 직접적으로 현장 전기 영동 약물 전달 시스템이 사용 된다. 즉, 미세 유체 이온 펌프 (µ FIP)를 포함 하는 신경 프로브가 온 디맨드 약물 전달 및 국 소 신경 활성의 동시 기록을 위해 이식 되 고 4-aminopyridine 유도 (4AP 유도) 발작과 같은 제어가 가능한 것으로 입증 이벤트 (SLE) 활동. Γ-아미노 부 티 르 산 (GABA) 농도는 발작 집중에의 한 항 간 질 효과에 도달 하는 GABA 전달의 정밀한 제어에 의해 생리 적 범위 내에서 유지 되지만 과잉 억제 유도 된 반발 파열을 야기 하지 않는다. 이 방법을 통해 병리학 적 활동과 개입을 감지 하 여 억제 신경 전달 물질을 정확한 시 공간적 제어와 함께 간 질 초점에 직접 전달 함으로써 발작을 막을 수 있습니다.
실험 방법에 대 한 개발의 결과로 서, SLEs는 발작 발병 시에 정확 하 게 조정 된 GABA 전달을 통해 발작 제어를 허용 하는 고도로 국 소화 된 방식으로 유도 될 수 있다.

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여 마 취 된 마우스에서 4AP 간 질 모델을 이용 하 여 발작을 조절 하는 것에 대 한 항 경련 제 집중을 달성할 수 있다. 임 플 란 트의 정확한 국 소화 (그림 2)는 해 마 국부 잠재력 (Lfps, 도 4)을 기록 하 여 작은 해 마 발작을 유도 하 고 발작 발병 시 GABA를 전달 하는 데 도움이 되었습니다. 임 플 란 트의 국 소화는 사후 학적 조직학에 의해 각 실험 후에 확인 하였다 (도 3).
SLEs가 해 마에만 존재 하는 경우에, 간 질 활성은 완전 한 통제 하에 넣어 졌다. 도 5 는 µ fip를 통합...

간 질 연구의 도전은 고전적인 치료가 부적당 한 환자를 위한 새로운 치료를 개발 하는 것입니다. 새로운 프로토콜을 사용 하 여-이식 가능한 약물 전달 시스템의 도움으로-우리는 간 질 초점에 GABA의 전기 영동 전달에 의해 마 취 된 쥐에서 발작을 제어할 수 있습니다.

간 질 초점으로 γ-아미노 버터 산 (GABA)의 전기 영동 전달은 생쥐의 발작을 방지 합니다.

Epilepsy is a group of neurological disorders which affects millions of people worldwide. Although treatment with medication is helpful in 70% of the ...

우리의 프로토콜은 간질 발작의 치료에 새로운 해결책을 제안 할 수있는 매우 새로운 장치를 사용하여 자연적으로 발생하는 억제 신경 전달 물질 GABA의 지방 관리를 활용합니다. 마이크로 에어로필이온 펌프는 우리가 마약을 언제 어디서 정확히 제어할 수 있게 해줍니다. 정밀하게 나사로 스레드된 전기 전광 전달은 그밖 신경학상 질병을 표적으로 하기 위하여 수정될 수 있었습니다.이 약물 전달 기술의 또 다른 장점은 실제로 전달 되는 액체가 없기 때문에 약물 전달 콘센트에서 매우 무시할 수 있는 압력 증가 가 있다는 것입니다. 오히려, 그것은 단지 약물 분자 자체입니다. 프로브의 가까운 현지화가 가장 큰 문제를 야기하기 때문에 정렬 각도를 테스트하고 스테레오탁스 프레임의 더미 프로브로 포지셔닝하는 것은 매우 눈에 잘 띄지 않습니다.스테레오탁스 프레임에 마취 마우스의 머리를 고정하고 30 게이지 바늘을 사용하여 계획된 절개 부위에 국소 진통 피하 부위를 주입하는 것으로 시작합니다. 5분 후 메스를 사용하여 두개골에 중간 선절을 만듭니다. 미세한 집게를 사용하여 피부를 부드럽게 후퇴시킵니다.불독 세로핀 클램프로 피부를 고정합니다. 그리고 근막의 노출 된 두개골 표면을 청소합니다. 미세한 0.4밀리미터 드릴 비트가 있는 치과 드릴을 사용하여 두라가 보일 때까지 소뇌 위의 두개골에 구멍을 뚫습니다.지면 나사를 구멍에 넣고 정밀 드라이버를 사용하여 소뇌의 상단에 도달 할 때까지 나사를 켭니다. 스테레오탁스 프레임을 사용하여, 원하는 뇌 영역에 대한 스테레오탁스 좌표를 측정하고, 얇은, 잘 연마 된 투명 뼈 멤브레인이 남아있을 때까지, 대상 영역에 대한 두개골의 약 1 ~ 2 밀리미터 직경 영역을 얇게 빠른 속도로 드릴을 사용합니다. 그런 다음 사용자 정의 된 후크 팁 바늘을 사용하여 듀라를 제거하고 결과 구멍에 식염수 한 방울을 추가하십시오.멀티 채널 실리콘 프로브 삽입의 경우, 마그네틱 홀더에 부착된 스테레오탁스 암에 프로브를 놓고 팔을 스테레오탁스 프레임 옆에 놓습니다. 스테레오탁스 암을 20도 전방 후방 각도로 설정하여 다른 두 임플란트의 위치를 위한 충분한 공간을 남깁니다. 그리고 프로브를 헤드 스테이지와 지면 나사에 연결합니다.미크론 정밀 스테레오탁스 암을 사용하여 실리콘 프로브를 해마로 천천히 낮추고, 표적 등산적 위치에 도달할 때까지 피질의 상단에서 멀티 채널 실리콘 프로브를 이동하면서 전기 신경 신호를 기록하는 녹음

electrophoretic-delivery-aminobutyric-acid-gaba-into-epileptic-focus

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

γ-aminobutyric Acid (GABA)를 Epileptic Focus로 전기영동 전달하여 마우스의 발작을 방지합니다.

이 문서에서는, 우리는 수술 절차를 설명하고 마우스 모델에서 고밀도 encephalography (EEG)의 취득에 마우스 두개골에 울트라 얇은 polyimide 기반 microelectrode 배열 (PBM - 배열)의 주입을위한 도움말을 취급.

Polyimide 기반 Microelectrode를 사용하여 자유롭게 이동 마우스의 고밀도 뇌파 레코딩

이 비디오는 GABA-A 수용체 길항제인 펜틸렌테트라졸(PTZ) 주사를 사용하여 마우스에서 간질을 유발하는 과정을 보여줍니다. PTZ의 반복적인 복강 내 투여는 염화물 이온 유입을 억제하고 억제성 신경 전달을 방해하며 발작을 유발하는 뉴런의 과흥분성을 유발하여 발작 역치를 점진적으로 낮춥니다. 이 과정은 불을 붙이고 자연 발작을 일으켜 만성 간질을 모방합니다.

마우스에서 펜틸레네테트라졸 유발 간질 발작 모델 확립

출처: Slezia, A. et al. 간질 초점에 γ-아미노부티르산(GABA)을 전기영동으로 전달하면 생쥐의 발작을 예방할 수 있습니다. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 마취된 마우스에서 발작 활성을 억제하기 위한 감마-아미노부티르산(GABA)의 전기영동 전달을 보여줍니다. 치료 효능을 평가하기 위해 프로브 이식, 신경 활동 기록, 발작 유도 및 미세유체 이온 펌프를 통한 제어된 GABA 전달과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

마취된 마우스의 간질 초점에 GABA의 전기영동 전달

비 구속 된 EEG radiotelemetry 자유롭게 이동 설치류에서 생체 장기 뇌파를 기록하기위한 유용한 방법 론적 접근이다. 상세한 프로토콜은 CNS의 리듬 성 CNS와 관련된 행동 단계 안정적인 기록을 얻기 위해 다양한 뇌 영역에 정위 경막 깊은 뇌내 전극 배치를 설명한다.

비 금지 EEG Radiotelemetry : 경막 외 및 깊은 뇌내 정위 EEG 전극 위치

이 논문은 침술, 간질 모델 및 설치류의 수면 분석의 성능을 보여줍니다. 침술 절차와 경혈의 식별에 대해 설명합니다. 필로카르핀 또는 펜틸레네테트라졸(PTZ)은 간질을 유발하는 데 사용됩니다. 피질전도(ECoG), 근전도(EMG), 뇌 온도 및 운동 활동 기록이 수면 분석에 사용됩니다.

침술에 의해 쥐와 마우스에서 간질 Electrocorticograms (ECoGs)의 조작 및 절전

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작

이 프로토콜 pentylenetetrazole와 화학 점화 하는 방법에 설명 하 고 간 질의 마우스 모델을 제공 한다. 이 프로토콜은 또한 쥐에 있는 간 질 발작 후 발작 유도 및 병 인 취약점을 조사 하 사용할 수 있습니다.

Pentylenetetrazole 유도 점화 마우스 모델

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.

자유롭게 이동 하는 쥐에서 뇌 파 기록 하는 동안 흥분 성의 아미노산의 Microdialysis

이 보고서는 형질전환 VGAT-Cre 마우스의 전기적 점화를 기반으로 측두엽 간질 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 점화된 VGAT-Cre 마우스는 간질의 원인을 파악하고 새로운 치료법을 스크리닝하는 데 유용할 수 있습니다.

측두엽 간질에 대한 모델을 생성하기 위해 전기적으로 점화되는 VGAT-Cre 마우스를 위한 전극의 준비 및 이식

편도체는 측두엽 간질에서 중요한 역할을 하며, 이 간질은 이 구조에서 유래하고 전파됩니다. 이 기사는 기록 및 자극 기능을 모두 갖춘 심부 뇌 전극의 제조에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 편도체에서 유래하는 내측 측두엽 간질 모델을 소개합니다.

양극성 전극을 사용하여 편도체의 전기적 점화에 의한 측두엽 간질 마우스 모델 생성

배우세요 뇌 간 질환 초점으로 GABA의 전기영동 전달을 이용한 발작 조절 방법을 생쥐 모델에서. 이 기술은 정확한 약물 전달로 뇌전증 치료 및 다른 신경계 질환 연구에 활용됩니다.

간 질 초점으로 γ-아미노 버터 산 (GABA)의 전기 영동 전달은 생쥐의 발작을 방지 합니다.

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