Name: 경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 블루 네이티브 PAGE를 사용하여 배양된 인간 세포에서 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 조립을 분석하는 방법을. 이 기술은 산화적 인산화 복합체의 무결성을 평가하는 데 필수적입니다.

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헬싱키 대학 도서관에 게시 재정 지원에 대 한 감사입니다.

spaNOTE:이 프로토콜은 기반 관련된 간행물 Hilander 외.13 .
1입니다. 버퍼 솔루션의 준비
참고: 모든 버퍼 및 프로토콜에 사용 되는 솔루션 표 1에 요약 됩니다. 버퍼의 지정 된 볼륨 준비 하 고 10 샘플을 실행 하기에 충분 한 있습니다. 모든 버퍼 + 4 ° C에서 최대 1 년 동안 저장할 수 있습니다.
<ol><li>젤 버퍼 1.5 M aminocaproic 산, 150mm 두번째-트리 증류수 (dH2O)에 포함 된 x 3의 20 mL를 준비 합니다. 7.0에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>DH2오 2 M aminocaproic 산의 10 mL를 준비</li>
	<li>다음 결합 하 여 미토 콘 드 리아 버퍼의 1 mL를 준비: 0.5 mL 젤 버퍼, 2 M aminocaproic 산의 0.5 mL 및 500 mM EDTA의 4 µ L x 3의.</li>
	<li>두번째-트리 스와 50 m m tricine dH2O. 조절 pH 7.0의 15 m m를 포함 하는 음극 버퍼의 1000 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>0.04 g Coomassie 파란 G-250의 음극 버퍼의 200 mL를 추가 하 여 파란색 음극 버퍼의 200ml를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50mm 두번째-트리 스 dH2O. 조절 pH 7.0에 포함 된 양극 버퍼의 1000 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>750 mM aminocaproic 산 및 5 %Coomassie 파란 포함 하는 샘플 버퍼의 2.5 mL 준비 dH2O. G-250</li>
</ol>2입니다. 미토 콘 드리 아 lysates의 준비
<ol><li>플레이트 셀 컬렉션 전날. HEK293 또는 143B 셀 사용 Dulbecco의 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 %L-글루타민, 100 mg/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스가 글의 중간 (DMEM) 수정. +37 ° c 5% CO2 습도 분위기에서 셀 문화 인큐베이터에서 세포 성장. 컬렉션의 날에 각 샘플에 대 한 적어도 500000 셀 인지 확인 합니다.</li>
	<li>부드럽게 한번 얼음 처럼 차가운 PBS로 세포 세척. 접시에서 세포를 분리 하지 마십시오. 세포를 긁어와 800 x g + 4 ° c.에서 10 분 동안에 작은</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS로 두 번 셀 펠 릿을 세척 하 고 단계 2.2에서 원심. 브래드 퍼 드 방법 상업 키트를 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 800 x g + 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포를 작은 참고: 셀 컬렉션 후 + 4 ° C에서 모든 단계를 수행 하 고 소용돌이 하지 마십시오.</li>
	<li>PBS의 20 mL를 100 x protease 억제제의 200 µ L을 추가 하 여 20 mL PBS의 protease 억제제와 함께 준비 합니다. 얼음에 계속. 5 mg/mL의 최종 단백질 농도에 protease 억제제와 함께 PBS에 셀 resuspend<ol>
<li>5 mg/mL에서 세포를 resuspend 하는 데 필요한 효소 억제제와 PBS의 볼륨을 계산 하려면 각 샘플의 단백질 양을 계산 합니다. 이 계산에 대 한 단백질 농도 측정 단계 2.3 단계 2.3에서에서 세척 후 셀을 resuspend 하는 데 사용 하는 PBS의 볼륨에서 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>효소 억제제와 PBS에서 3.3 m m digitonin의 1 mL를 준비 합니다. 1.65 m m의 최종 농도를 3.3 m m digitonin를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.<ol>
<li>Protease 억제제와 PBS에서 3.3 m m digitonin의 1 mL를 준비 될 때까지 아무 침전 볼 수 하 고 시원한 얼음에 즉시 100 ° C에서 PBS의 1 mL에 digitonin의 4 mg를 분해. Digitonin 솔루션의 1 mL를 100 x protease 억제제의 10 µ L를 추가 합니다. 참고: digitonin의 신선한 솔루션만을 사용 합니다. 주의: Digitonin은 독성! 사용 하 여 얼굴 마스크, 장갑 및 실험실 외 투.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL의 최종 볼륨을 가수분해 억제 물 (준비 단계 2.4에서에서)와 PBS를 추가 합니다. 10000 x g에서 원심 분리기에서 10 분 동안 + 4 ° c. 제거는 상쾌한. 이 단계에서 미토 콘 드리 아는 일지도.</li>
	<li>미토 콘 드 리아 버퍼에 미토 콘 드리 아 펠 릿을 resuspend. 미토 콘 드 리아 버퍼의 볼륨 단계 2.4에서에서 PBS의 볼륨의 절반 이다.</li>
	<li>신선한 10% 라우릴 maltoside 프로 테아 제 억제 물 (준비 단계 2.4에서에서)를 포함 하는 PBS에 준비 합니다. 1 mL 10 샘플에 대 한 충분 하다입니다. 1%의 최종 농도를 10% 라우릴 maltoside를 추가 합니다. (이 단계는 몇 시간까지 긴 될 수 있습니다) 15 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>20000 x g 에서 원심 분리기에서 20 분 + 4 ° c. 새로운 관으로는 상쾌한을 수집 합니다. 키트를 사용 하 여 Bradford 메서드에서 단백질 농도 측정 합니다. 샘플 버퍼, 라우릴 maltoside 단계 2.8에서에서 사용의 볼륨의 볼륨을 추가 합니다. 샘플-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 그라데이션 젤 BN-페이지에 대 한 준비
<ol><li>실 온에서 10 억-페이지에 대 한 그라데이션 젤 하 거 라. 그라데이션 메이커를 저 어 접시에 놓고 유연한 튜브 연동 펌프를 연결 합니다. 주입 튜브에 바늘 세트를 연결 합니다. 그라데이션 메이커의 인접 챔버로 자력 장소. 10 분 최대 펌프 속도에서 dH2O와 튜브를 세척.</li>
	<li>빈 관과 그라데이션 메이커. 피펫으로 사용 하 여 그라데이션 메이커의 챔버 사이 채널에 남은 dH2O를 제거. 채널 및 튜브 밸브를 닫습니다.</li>
	<li>캐스팅 프레임 및 클램프를 사용 하에 하단에 있는 구멍은, 홀더 2 개의 유리 접시를 조립 하 고 스탠드에 배치. 그것이 물 균형 직선 표면에 더 많거나 적은 다는 것을 확인 하십시오. 장소 바늘 유리 접시 사이 배관에 연결.</li>
	<li>6%와 15% 젤 솔루션 (표 2)를 준비 합니다. 얼음에 계속. 암모늄 persulphate (AP) 및 tetramethylenediamine (TEMED) (그들은 시작 중 합) 추가 마지막. 부드럽게 공기를 만드는 방지 하려면 믹스 거품.</li>
	<li>6% 젤 그라데이션 젤 믹서 튜브 챔버의 근 위 끝과 15% 젤 선단부를 로드 합니다. 총 볼륨 젤의 유리 접시 사이 분리 젤의 볼륨을 동일 해야 합니다. 따라서, 2.6 mL 6% 젤의 그리고 15% 젤 그라데이션 젤 믹서의 2.1 mL를 사용 하 여 하나의 8.3 cm x 7.3 c m 크기의 젤.</li>
	<li>자력에 스위치와 튜브와 그라데이션 메이커의 챔버 사이 채널을 엽니다. 연동 펌프에 5 mL/분으로 즉시 전환 유리 접시를 거품 젤 입력을 허용 하지 않습니다. 때 아무 젤 튜브에 바늘을 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 dH2오 유지 중 합에 대 한 1 시간 이상 실 온에서 젤 젤 오버레이.</li>
	<li>젤을 붓는 후 즉시 씻어 튜브 dH2O 그라데이션 챔버를 작성 하 고 최대 속도로 연동 펌프를 사용 하 여. 2 더 많은 젤을 준비할 때 항상 깨끗 한 시스템 사이.</li>
	<li>젤 버퍼 x 3의 3 mL를 혼합 하 여 1 x 젤 버퍼를 준비 하 고 필터 종이 젤의 표면에서 부드럽게 dH2O. 제거 dH2O 6 mL를 추가 합니다. 젤 젤 버퍼 x 1의 표면 세척. 부드럽게 필터 종이 젤 버퍼 x 1을 제거 합니다.<ol>
<li>젤에 필터 종이에서 섬유를 하지 마십시오. 이 보장 하기 위해,가 위, 종이 작은 조각으로 잘라 하지만 종이 찢 어 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리 접시 사이 빗을 배치 하지만 그것을 완벽 하 게 부 어 빗에서 겹쳐 쌓이는 젤 수 담그지 마십시오. 겹쳐 쌓이는 젤 (표 2) 4%를 준비 합니다. APS와 TEMED 추가 그들은 쉽게 중 합을 시작으로 최근. 부드럽게 피하 공기 방울 혼합.</li>
	<li>오버레이 겹쳐 쌓이는 젤, 빗, 아래 거품을 방지 하 고 빗을 완전히 몰입할. 하자 겹쳐 쌓이는 젤 유해 적어도 30 분 빗을 제거 하 고 세척 젤 버퍼를 피펫으로 사용 하 여 x 1와 우물.<ol>
<li>중 합, 후 며칠에 대 한 젤 + 4 ° C에서 저장 수 있습니다. DH2O와 플라스틱 젖은 종이에 젤 포장 저장 젤, 젤의 건조를 방지 하기 위하여 필름.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 블루 기본 젤 전기 이동 법
참고: OXPHOS의 저하를 방지 하기 위해 단지 실행 법 + 4 ° c.에 미리 냉장된 버퍼를 사용 합니다.
<ol><li>우물의 바닥까지 블루 음극 버퍼와 젤 카세트를 로드 합니다. 샘플의 로딩 때 카세트 상단에 가득 하지 쉽습니다. 블루 음극 버퍼와 우물을 세척 하 고 피펫으로 사용 하 여 블루 음극 버퍼를 채울 우물.</li>
	<li>웰 스에 샘플 (5-30 µ g 단백질)를 로드 합니다. 부드럽게 블루 음극 버퍼와 양극 버퍼 탱크 상단에 젤 카세트를 작성.</li>
	<li>40 V의 정 전압에서 15 분 동안 젤을 실행 합니다. 다음 80 V 전압을 증가 (또는 6의 정 전류를 사용 하 여 mA), 10을 초과 하지 않는 엄마. 염료의 젤 길이 2/3에 도달할 때까지 젤을 실행 합니다.</li>
	<li>음극 버퍼와 블루 음극 버퍼를 교체 하 고 전기 이동 법 염료 전면 밖으로 실행 하고있다 때까지 계속. 총, 전기 이동 법 약 3 시간 걸립니다.</li>
	<li>유리 접시를 검색 하 고 세미 드라이 blotting에 의해 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 단백질을 전송. 25 V와 전류 1.0 A 30 분 제한의 정 전압을 사용 합니다.<ol>
<li>또는 사용 하 여 젖은 blotting PVDF 막에 OXPHOS 단지 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>계속 표준 immunoblotting 프로토콜에 따라 멤브레인과 항 체 외피의 차단 합니다. OXPHOS 복합물의 소 단위에 대 한 1 차 항 체를 순차적으로 사용 합니다. 참고: 예를 들어 복잡 한에 대 한 안티-NDUFA9 항 체 (1: 2000)를 사용 나, 복잡 한 II, 복잡 한 III, 안티 COX1 복잡 한 IV 및 안티-ATP5A 항 체 (1: 2000) 복잡 한 v에 대 한 항 체 (1: 2000)에 대 한 안티-UQCRC2 항 체 (1:1000)에 대 한 안티-SDHA 항 체 (1: 2000). 항 체의 목록 자료의 테이블에에서 표시 됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

샘플 준비, 저장 하는 동안 그대로 OXPHOS 단지를 보존 하 여 젤 전기 이동 법 프로토콜의 가장 중요 한 부분 중 하나입니다. 따라서, 미토 콘 드리 아 + 4 ° C에서 격리 되어야 합니다 및 샘플 하지 freeze-thaw 주기를 받아야 한다. OXPHOS 단지만 전체 절차 동안 한 동결-해 동 주기를 용납 수 있습니다. 여러 freeze-thaw 주기 파괴 OXPHOS 복합물 (그림 1B). 컨트롤과 비교 하는 실험 샘플 저장 조건, 잘못 된 결과 줄 수 있는 차이 피하기 위해 동시에 준비 되어야 한다. 씻어 셀 알 약-80 ° C (이 프로토콜에서 1.4 단계)에서 동결 하 고 나중에 수행 모든 샘플에 대 한 프로토콜의 나머지 함께 적어도 젤 elec까지 하는 것이 좋습니다 모든 예제와 함께 병렬로 프로토콜의 모든 단계를 수행할 수 없는 경우 trophoresis입니다. (탱크, 카세트) 전기 기구의 청결에 특별 한 주의 지불 합니다. SDS 페이지 같은 장치를 사용 하는 경우 그것은 매우 잘 하기 전에 세척 BN 페이지. 모든 잔여 SDS 전기 이동 법 동안에 OXPHOS 복합물의 분리를 일으킬 수 있습니다.
고급 그라데이션 젤 프로토콜의 또 다른 중요 한 부분입니다. 블루 기본 페이지에 대 한 캐스트 젤은 상업적으로 사용할 수; 그러나, 이후 상업 젤 사용 하는 버퍼는 다른 샘플 버퍼는 구성 있을 그들을 사용을 권장 하지 않습니다. 여기에 사용 된 젤 (6-15%)의 그라데이션은 개별 OXPHOS 복합물의 분리에 적합 합니다. OXPHOS, 일컬어 호흡 체인 supercomplexes14의 더 높은 순서 supramolecular 구조를 검출 하기 위하여 일부 최적화 필요한11입니다.
OXPHOS의 시각화를 위한 단지 사용 하 여 특정 항 체 순차적으로, 그들의 속성에 따라. 예를 들어 사용 하 여 먼저 마지막 약한 신호 및 가장 강한 신호를 가진 항 체를 제공 하는 항 체. 이것은 탐지 (그림 1D) 약화는 스트립 때문에 중요 한입니다. 호흡 사슬 복합물의 구성 비 엔 페이지 후 젤에 2 차원 SDS 페이지15복종 되는 경우 조사 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 순차적으로 개별 OXPHOS 단지에 대 한 항 체를 사용 하 여 제안 합니다. 그러나, 동시에 모든 5 개의 OXPHOS 단지 감지 하 칵테일 상용 OXPHOS 항 체를 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 불완전 하 게 조립된 OXPHOS 복합물을 감지 하 여 자신의 정체성을 정의 수, 개별 OXPHOS 단지에 대 한 항 체 사용 해야 순차적으로. 이 단계는 시간이 오래 걸릴; 그러나, 그것은 새로운 실험 조건 및 모델 테스트를 위한 필수 수 있습니다.
미토 콘 드리 아 격리에 사용 되는 digitonin의 농도 특정 세포 유형에 대 한 최적화 되어야 합니다. 세제로 digitonin permeabilizes 세포 막. Digitonin의 최적 농도 효율적으로 그대로 미토 콘 드리 아 막 세포의 원형질 막 permeabilizes. 너무 높은 농도 미토 콘 드리 아 막 손상 총 미토 콘 드리 아 생산량 감소 하는 동안 digitonin의 너무 낮은 농도의 미토 콘 드 리아 추출 물 높은 오염을 발생 합니다. 최적의 digitonin/단백질 비율 (g/g) 1 0.3에서 다릅니다. 서쪽 오 점 분석 펠 릿과 supernatants에서 추출 하는 단백질의 digitonin16의 최적 농도 테스트를 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 단백질; immunoblot에 컨트롤 로드 따라서, 추출 된 복합물의 단백질 농도 측정 되어야 한다 신중 하 게 적어도 동등한 로드 되도록 triplicates에. 또한, 샘플 복제에 BN 페이지에서 실행할 수 있습니다. 선택적인 OXPHOS 복합물의 어셈블리 장애인 경우 영향을 받지 않는 단지 컨트롤 로드 될 수 있습니다.
18억 페이지에 단백질 복합물의 분자 질량의 추정은 도전 이다. 현재 프로토콜에는 분자량 마커; 따라서, OXPHOS 단지의 어셈블리를 예상 하려면 영향을 받지 않는 단지를 포함 하는 컨트롤 샘플 항상 분석에 포함 되어야 합니다. BN-페이지에 대 한 컨트롤 샘플은 일반적으로 치료 또는 강포한 유형 세포.
여기에 제시 된 방법은 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물;의 검출에 대 한 최적화 그러나, 그것은 또한 미토 콘 드리 아 단백질19의 oligomerization의 평가 대 한 적용할 수 있습니다. 또한, OXPHOS 복합물의 어셈블리 속도 페니와 페니10제거 후 그들의 회복 다음 첫 없애고 인코딩된 미토 콘 드 리아 소 단위 포함 복합물에 의해 공부 될 수 있다. 따라서, BN 페이지 정상 수준 및 인간 미토 콘 드 리아 장애9,11의 분자 진단 등 다른 응용 프로그램에 대 한 OXPHOS의 어셈블리를 사용할 수 있습니다.

미토 콘 드리 아 에너지 생산, 세포 물질 대사, 신호, apoptosis, 노화, 등1,2,3의 규칙에에서 중요 한 역할을 재생 하는 다기능 세포입니다. 미토 콘 드리 아에서 에너지 생산 호흡 ATP 합성 커플 산화 인 산화 기능에 의존 합니다. 인간 세포에 있는 미토 콘 드 리아 산화 인 산화 시스템 (OXPHOS) 5 단지의 구성 됩니다. 단지 I-IV 복잡 한 V ATP를 생산 하는 데 사용 되는 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에서 전기 양성자 기온 변화도를 만듭니다. 복잡 한 각 OXPHOS multimeric 이며, 복잡 한 II, 제외 하 고 핵과 미토 콘 드리 아 유전자에 의해 subunits의 구성. 어떤 결함 돌연변이 또는 환경 스트레스에 기인 하는 OXPHOS 복합물의 핵심 구성 요소에는 어셈블리 및 산화 인 산화 시스템의 기능 교란 수 있습니다. 또한, 기능 OXPHOS 복합물의 적절 한 어셈블리는 어셈블리 요소4,,56의 많은 필요합니다.
블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그대로 단백질 복합물의 분석을 사용 하는 기본적인 기술 이며 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다. 첫째, 미토 콘 드리 아는 격리 된 세포에서 digitonin에 의해 세포의 원형질 막 permeabilizes 온화한 세제. 그런 다음, 라우릴 maltoside를 사용 하 여 OXPHOS 단지 미토 콘 드리 아 막에서 해제 됩니다. 그라데이션 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 OXPHOS 단지 그들의 질량에 따라 분리 된다. Coomassie 파란 G-250 (하지 R-250) 샘플 버퍼와 블루 음극 버퍼에 추가 세제 정한 연결을 분리 하지만 개별 호흡 사슬의 단지 그대로8을 유지. 전기 이동 법, 동안 블루 음극 버퍼 염료를 포함 하는 염료, PVDF 막8OXPHOS 단지의 효율적인 전송을 보장 없이 음극 버퍼도 대체 됩니다. OXPHOS 단지 시각화, PVDF 막 5 OXPHOS 단지의 선택 된 하위 단위에 해당 하는 항 체와 incubated 순차적으로.
여기에 설명 된 몇 가지 수정 하는 방법은 어떤 교양된 셀에 적용할 수 있습니다. 또한, 조직 샘플9에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 OXPHOS 복합물의 분석을 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. BN-페이지 실행 당 각 샘플에 대 한 미토 콘 드리 아의 적어도 5-10 µ g을 필요합니다. 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 500000 교양 HEK293, SH-SY5Y와 같은 셀 또는 143B 세포는 미토 콘 드리 아의 약 10 µ g을 얻을 수 있습니다. 그러나, 충분 한 양의 비 엔 분석에 대 한 셀 특정 셀 형식에 따라 달라 집니다.
미토 콘 드리 아 OXPHOS 단백질을 공부 하는 가장 일반적인 방법은 SDS 페이지 이며 서 부 럽. 그러나, SDS 페이지만 개별 OXPHOS 소 단위를 공부 하 고 있으며, BN-페이지, 달리 평가 전체 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 사용할 수 없습니다. 분명 기본 페이지 분리 부정 청구 염료의 존재 없이 기본 조건에서 단백질 복합물 그리고 억 페이지에 비해 훨씬 낮은 해상도. 그러나, 분명 기본 페이지 이므로 10 억 페이지 보다 온화한 조건10억 페이지 아래 해리 OXPHOS supercomplexes 같은 단백질 복합물의 정한 supramolecular 어셈블리를 유지할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 그라데이션 젤 복합물; 분리 하는 그러나, 또는, 비 그라데이션 분리 사용할 수 있습니다 경우 상대적으로 비싼 그라데이션 메이커 사용할 수11.
중요 여기에 설명 된 메서드는 단지의 기능 평가 하지 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 분석할 수 있습니다. 고해상도 BN 페이지 젤에 활동 분석 결과11 미토 콘 드 리아 단지12 의 spectrophotometric 효소 활동 분석 결과 의해 다음 OXPHOS 단지의 기능 분석에 대 한 효율적인 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 두 가지이 방법 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 시험 하지 않습니다.
따라서, BN 페이지 개별 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 조사 하는 최적의 방법입니다. 예를 들어 Leber 유전 눈 신경 병 (LHON), 유산 증 및 뇌졸중 같은 에피소드 (MELAS), 미토 콘 드리 아 뇌 등 일부 미토 콘 드 리아 장애, 하나 이상의 구성 요소는 OXPHOS의 변경 된 어셈블리와 관련 된 시스템5. 를 사용 하 여 설명 하는 BN 페이지 방법을 여기 미토 콘 드 리아 질병의 분자 메커니즘을 공부 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>100 mm cell plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/Bis 37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>아미노카프로산</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>14748</td><td>Complex V subunit</td></tr><tr><td>Anti-MTCOI</td><td>Abcam</td><td>14705</td><td>Complex VI 서브유닛</td></tr><tr><td>Anti-NDUFA9</td><td>Abcam</td><td>14713</td><td>Complex I 서브유닛</td></tr><tr><td>Anti-SDHA</td><td>Abcam</td><td>14715</td><td>Complex II 서브유닛</td></tr><tr><td>Anti-UQCRC2</td><td>Abcam</td><td>14745</td><td>Complex III 서브유닛</td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B7535</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 단백질 분석 키트</td><td>BioRad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>피셔</td><td>11597692</td><td></td></tr><tr><td>쿠마시 블루 G250 (세르바 블루 G)</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>시그마</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F/12</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Life 기술</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>(Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>그라디언트 메이커</td><td>Bio-Rad</td><td>1654120</td><td></td></tr><tr><td>라우릴 말토사이드(n-도데실 &베타;-D-말토시드)</td><td>시그마</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>EPS 301</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Thermo Scientific</td><td>10137963</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot 터보 미니 PVDF</td><td>BioRad</td><td>1704156</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T9784</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco 15400054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수직 전기영동 장치</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

경작 된 인간 세포 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

미토 콘 드리 아 호흡 미토 콘 드리 아에서 산화 인 산화 (OXPHOS) 단지에 의해 수행 됩니다. 내부 및 환경 요인 어셈블리 및 OXPHOS 단지의 안정성을 교란 수 있습니다. 이 프로토콜 응용 프로그램을 경작된 한 인간 세포에 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지)에 의해 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물의 분석을 설명합니다. 첫째, 미토 콘 드리 아 digitonin를 사용 하 여 셀에서 추출한 다음 라우릴 maltoside를 사용 하 여, 그대로 OXPHOS 단지 미토 콘 드리 아 막 으로부터 격리 됩니다. OXPHOS 단지 다음 부정 청구 염료 Coomassie 파란, 단백질 집단을 방지 하 고 음극 쪽으로 단백질 복합물의 전기 이동 기동성을 보장 앞 그라데이션 젤 전기 이동 법에 의해 해결 됩니다. 마지막으로, OXPHOS 단지 표준 immunoblotting에 의해 검색 됩니다. 따라서, BN 페이지 평가 기본 SDS 페이지 수만 개별 OXPHOS 복잡 한 subunits의 연구와 달리 전체 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 사용할 수 있는 편리 하 고 저렴 한 기술 이다.

BN-페이지를 사용 하 여, 미토 콘 드리 아 OXPHOS 복합물의 어셈블리에 결함 조사 수 있습니다. 그림 1A 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y) 페니, 특히 번역 mtDNA 인코딩된 OXPHOS subunits의 억제와 치료에 호흡기 체인 단지의 어셈블리를 보여 줍니다. 페니 고갈 mitochondrially 인코딩 하위 단위를 포함 하는 OXPHOS 복합물 (복잡 한 전, 3 세, 4; 그림 1A), 복잡 한 2 차 핵 유전자에 의해 인코딩된 독점적으로 upregulated compensatorily 동안. 단지 V immunoblotted 여기 아니었다.
여러 freeze-thaw 주기 OXPHOS 단지 파괴. 그림 1B freeze-thaw 주기에 의해 OXPHOS 단지의 저하를 보여 줍니다. 여러 freeze-thaw 주기 받은 샘플 3에서에서 미토 콘 드리 아 호흡 단지 낮은 밴드 강도 있고 한 번만 냉동 같은 샘플에 비해 이동 된다. 그림 1B 의 자르지 서쪽 오 점 이미지 보 그림 1에 표시 됩니다.
젤의 품질이 선명 하 고 뚜렷하게 밴드에 대 한 중요 합니다. 그림 1 C 에서 잘 유해 하지 않은 젤 immunoblot을 보여줍니다. 막의 스트립 또한 OXPHOS 복합물의 감지를 발생할 수 있습니다. 그림 1 D, 복잡 한 내가 검색 되었습니다 스트립 전후. 신호 대 잡음 비 스트립 후 훨씬 낮습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59269/59269fig1.jpg"> 그림 1. 성공적이 고 최적의 실험에서 BN 페이지 immunoblots. (A) 미토 콘 드 리아 번역의 억제제에 의해 고갈의 OXPHOS 단지. 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y)는 48 시간 동안 페니 (CAP)으로 치료 했다. Ctrl 키, 페니 치료 없이 제어 셀입니다. 하단 패널은 immunoblot의 정량화를 보여줍니다. 컨트롤의 값은 1 (점선으로 표시 된)가지고 간다. 데이터는 ± SD, 의미 하는 대로 표시 됩니다 n = 3, * P 제어를 사용 하 여 비교 &lt; 0.0001 짝이 없는 학생의 t 시험. (B) 여러 동결-해 동 하 여 OXPHOS 복합물의 주기. 샘플 1-3은 동일한 조건에서 인간의 다리 셀 (143B)에서 준비 되었다. 샘플 숫자 1과 2는 동결 되었고 샘플 번호 3 수술 4 freeze-thaw 주기 동안 한 번만 녹아. (C) OXPHOS 단지 HEK293 세포에서 고립의 BN 페이지 immunoblots. 밴드의 번짐 젤의 낮은 품질에 의해 발생 합니다. (D) OXPHOS 복합물의 검출에 스트립의 효과. 복잡 한의 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y) 같은 막의 제거 전후에서 나. OXPHOS 단지 안티-NDUFA9 항 체를 사용 하 여 검색 된 (복잡 한 나), 안티-SDHA 항 체 (복잡 한 II), 안티-UQCRC2 항 체 (복합물 III)와 안티 COX1 항 체 (복잡 한 IV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/59269fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>버퍼 또는 솔루션</td>
			<td>구성</td>
			<td>레시피</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">젤 버퍼 x 3</td>
			<td>1.5 M aminocaproic 산</td>
			<td>aminocaproic 산의 3.94 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM 두번째-트리 스</td>
			<td>두번째-트라이앵글 0.63 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 20 mL을 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>7.0에 pH를 조정</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">음극 버퍼</td>
			<td>15mm 두번째-트리 스</td>
			<td>3.14 g 비스-트리 스의</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 m m tricine</td>
			<td>tricine의 8.96 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 1000 mL에 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>7.0에 pH를 조정</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">블루 음극 버퍼</td>
			<td>0.02 %coomassie 파란 G</td>
			<td>0.04 g Serva 블루 G의</td>
		</tr>
<tr>
<td>15mm 두번째-트리 스</td>
			<td rowspan="4">음극 버퍼의 200 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 m m tricine</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">양극 버퍼</td>
			<td>50mm 두번째-트리 스</td>
			<td>20.93 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 2000 mL을 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>7.0에 pH를 조정</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">미토 콘 드 리아 버퍼</td>
			<td>1.75 M aminocaproic 산</td>
			<td>3 배 젤 버퍼의 0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>75mm 두번째-트리 스</td>
			<td>2 M aminocaproic 산의 0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM EDTA</td>
			<td>500 mM EDTA의 4 µ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">샘플 버퍼</td>
			<td>750 mM aminocaproic 산</td>
			<td>2 M aminocaproic 산의 0.94 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 %comassie 블루 G</td>
			<td>블루 Serva G의 0.125 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 2.5 mL을 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2 M aminocaproic 산</td>
			<td>2 M aminocaproic 산</td>
			<td>aminocaproic 산의 2.62 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 10 mL을 추가</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 버퍼 및 BN-페이지에 사용 하는 솔루션
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>블루 기본 젤</td>
			<td>6% 젤을 분리</td>
			<td>15% 젤을 분리</td>
			<td>누적 4% 젤</td>
		</tr>
<tr>
<td>젤 버퍼 x 3</td>
			<td>3.3 mL</td>
			<td>3.3 mL</td>
			<td>1.64 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% 아크릴/두번째 37.5:1</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>3.75 mL</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>5.14 mL</td>
			<td>0.93 mL</td>
			<td>2.77 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤</td>
			<td>0</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% 염화 persulfate *</td>
			<td>60 Μ L</td>
			<td>10 Μ L</td>
			<td>60 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
			<td>4 Μ L</td>
			<td>2 Μ L</td>
			<td>6 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 볼륨</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* DH2O에서에서 항상 신선한 10% 염화 persulfate 확인</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. BN 페이지 젤의 조리법입니다.
보충 그림 1. 자르지 서쪽 오 점 이미지의 그림 1B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/Supplementary_figure_1.eps" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에서는 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물의 분석을 보여 줍니다. 여기 경작된 한 인간 세포에 적용 하는 방법을 설명 합니다.

경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

블루 네이티브 폴리아크릴아미드 젤 전기포광은 미토콘드리아 산화 인산화 시스템의 인택트 복합체를 분석할 수 있습니다. 미토콘드리아 산화 인산화 시스템의 전체 복합체의 조립을 오버레이하는 데 사용할 수있는 편리하고 저렴한 기술입니다. 미토콘드리아 용액을 준비하려면 먼저 얼음-차가운 PBS 용액을 사용하여 세포를 한 번 부드럽게 씻으십시오.세포를 긁어 내고 10 분 동안 800 G에서 섭씨 4도에서 펠릿을 긁습니다. 그런 다음, 10 분 동안 800 G에서 4섭씨에서 얼음 차가운 PBS및 원심분리기로 셀 펠릿을 두 번 씻습니다. 다음으로, PBS의 20 밀리리터에 100x 프로테아제 억제제의 200 마이크로리터를 추가합니다.PBS 프로테아제 억제제 혼합물의 세포를 밀리리터 당 5밀리그램의 최종 단백질 농도로 재중단한다. 프로테아제 억제제와 PBS에서 3.3 밀리머 디지토닌을 준비하려면 침전이 보이지 않을 때까지 100섭씨 1밀리터에 4 밀리그램의 디지토닌을 녹입니다. 얼음을 즉시 식히고 디지토닌 용액의 1 밀리리터에 100x 프로테아제 억제제 10마이크로리터를 추가합니다.다음으로, 1.65 밀리머의 최종 농도에서 세포에 디지토닌 프로테아제 억제제 혼합물을 첨가한다. 잘 섞어서 얼음에 5분간 배양하세요. 그런 다음, 1.5 밀리리터의 최종 부피에 세포에 PBS 프로테아제 억제제 혼합물을 추가한다.10분, 000G에서 섭씨 4도에서 원심분리기. 상체를 제거하고 미토콘드리아 완충제에서 미토콘드리아 펠릿을 다시 중단하십시오. PBS 억제제 용액에 장착된 신선한 10% loreal 마운트1밀리리터를 준비합니다.미토콘드리아에 10% 로레알 마운트를 넣고 얼음에 1%인큐베이션을 15분 이상 넣으세요. 20분 동안 섭씨 4도, 000 G에서 원심분리기. 상체를 새 튜브에 수집하고 샘플 버퍼를 추가합니다.블루 네이티브 페이지를 위한 그라데이션 젤을 준비하려면 그라데이션 메이커를 교반 판에 넣고 유연한 튜빙과 연동 펌프에 연결하십시오. 튜브에 바늘이 있는 주입 세트를 부착합니다. 마그네틱 교반기를 그라데이션 메이커의 근위 챔버에 넣고 10분 동안 최대 펌프 속도로 증류수로 튜브를 세척합니다.다음으로 튜빙과 그라데이션 메이커를 비웁습니다. 파이펫을 사용하여 그라데이션 메이커의 챔버 사이의 채널에서 남은 증류수를 제거합니다. 밸브로 채널과 튜브를 닫습니다.홀더에 유리 판 두 개를 조립하고 스탠드에 놓습니다. 젤 홀더 의 바닥에 구멍을 사용하여, 유리 플레이트 사이의 튜브에 연결된 바늘을 배치합니다. 8.3 x 7.3센티미터 젤을 만들기 위해 먼저 6%와 15%의 젤 솔루션을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.기포를 만들지 않도록 부드럽게 섞습니다. 이어서, 그라데이션 젤 믹서 튜빙 챔버의 근열끝을 6%젤의 2.6 밀리리터와 15%젤의 2.1 밀리리터로 말단을 적재한다. 다음으로, 자기 교반기켜서를 켜고 그라데이션 메이커의 챔버 사이의 튜브와 채널을 엽니다.연동 펌프를 분당 5밀리리터로 즉시 켭분으로 전환합니다. 튜브에 젤이 없을 때 유리 판을 채우고 바늘을 제거하십시오. 부드럽게 증류수와 젤을 오버레이하고 적어도 한 시간 동안 실온에서 젤을 유지합니다.그라데이션 챔버를 증류수로 채우고 최대 속도로 연동 펌프를 사용하여 튜브를 즉시 세척하십시오. 증류수 6밀리리터를 3x 젤 버퍼 3개에 추가하여 1x 젤 버퍼를 만듭니다. 필터 용지를 사용하면 젤 표면에서 증류수를 부드럽게 제거합니다.젤 표면을 1x 젤 버퍼로 씻고 필터 용지로 버퍼를 부드럽게 제거합니다. 원고에 따라 4 %의 스태킹 젤을 준비하십시오. 거품을 만들지 않도록 부드럽게 섞습니다.그런 다음, 유리 접시 사이에 빗을 놓고 빗 아래에 스태킹 젤을 붓습니다. 빗을 완전히 담그면 됩니다. 스태킹 젤을 30분 이상 중합하게 하십시오.그런 다음 빗을 제거하고 파이펫을 사용하여 1x 젤 버퍼로 우물을 씻습니다. 블루 네이티브 젤 전기 포를 수행하려면 먼저, 젤 카세트에 파란색 음극 버퍼를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 우물을 씻고 파란색 음극 버퍼로 채웁니다.그런 다음 5~30마이크로그램의 단백질 샘플을 우물에 적재합니다. 젤 카세트를 파란색 음극 버퍼로 상단에 부드럽게 채우고 탱크는 양극 버퍼로 채웁니다. 먼저 젤을 40볼트의 일정한 전압으로 15분간 실행합니다.그런 다음 전압을 80볼트로 늘립니다. 염료가 젤 길이의 2/3에 도달 할 때까지 젤을 실행합니다. 파란색 음극 버퍼를 음극 버퍼로 교체하고 염료 전면이 젤에서 벗어날 때까지 전기 전광을 계속합니다.유리 판을 회수하고 반건조 블롯팅을 통해 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮길 수 있습니다. 25볼트의 일정한 전압과 30분 동안 1암페어로 제한되는 전류를 사용합니다. 인간 신경모세포종 세포내호흡기사슬 복합체의 조립은 치료 없이 대조세포에 비해 클로람페니콜 치료에 의해 억제되었다.대조적으로, 핵 유전자에 의해 인코딩된 복합체는 위로 통제되었습니다. 산화 인산화 복합체의 분해는 여러 동결 해동 주기에 따라 관찰되었다. 젤의 품질산화 인산화 복합체의 검출에 영향을 미칠 수 있습니다.또한 멤브레인의 제거는 신호 대 잡음 비율을 낮췄습니다. 절차를 수행할 때, 선극 OXPHOS 복합체를 보존하기 위해 추운 조건 하에서 간단한 준비 및 젤 전기 포이를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 파란색 네이티브 페이지에 이어, 두 번째 차원 SDS 페이지는 호흡기 사슬 복합체의 단백질 하위 단위를 연구하기 위해 적용 될 수있다.블루 네이티브 페이지는 연구원이 복합체의 조립과 산화 인산화 시스템의 심지어 슈퍼 복합체를 연구 할 수 있습니다.

analysis-mitochondrial-respiratory-chain-complexes-cultured-human

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

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파란 천연 Polyacrylamide 젤 전기 이동법: 본래 Mitochondrial 호흡 사슬 복합물의 분석을 위한 Non-denaturing 별거 기술

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

이전에 냉동 보관 된 고체 조직에서 미토콘드리아 농축 샘플의 준비는 다양한 실험 양식에서 미토콘드리아의 기능적 및 분석 평가를 모두 수행 할 수 있었습니다. 이 연구는 냉동 심장 조직에서 미토콘드리아농축 제제를 준비하고 미토콘드리아의 분석 평가를 수행하는 방법을 보여줍니다.

소우의 자손에서 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 전자 전송 복합체 측정 : 운동 유발 미토콘드리아 생물 에너지 변화를 평가하는 모델

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

분열 효모인 Schizosaccharomyces pombe 는 미토콘드리아를 연구하기 위한 매력적인 모델로 부상하고 있습니다. 여기에서는 S. pombe에서 미토콘드리아 호흡 복합체의 풍부함과 조립을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 미토콘드리아 호흡 사슬에서 보존된 유전자의 새로운 기능을 특성화할 수 있습니다.

핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

Denaturing 그라디언트 젤 전기 영동 (DGGE)

Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동은 단일 좌초 DNA를 분리 또는 500 세포핵의 한계까지 RNA하는 데 사용됩니다. 열 denatures 샘플 및 구조화되지 않은 단일 가닥와 함께 요소는 분자량에 따라 겔 매트릭스 내에서 마이 그 레이션.

Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

배우세요 블루 네이티브 PAGE를 사용하여 배양된 인간 세포에서 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 조립을 분석하는 방법을. 이 기술은 산화적 인산화 복합체의 무결성을 평가하는 데 필수적입니다.

경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

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