경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

블루 네이티브 폴리아크릴아미드 젤 전기포광은 미토콘드리아 산화 인산화 시스템의 인택트 복합체를 분석할 수 있습니다. 미토콘드리아 산화 인산화 시스템의 전체 복합체의 조립을 오버레이하는 데 사용할 수있는 편리하고 저렴한 기술입니다. 미토콘드리아 용액을 준비하려면 먼저 얼음-차가운 PBS 용액을 사용하여 세포를 한 번 부드럽게 씻으십시오.

세포를 긁어 내고 10 분 동안 800 G에서 섭씨 4도에서 펠릿을 긁습니다. 그런 다음, 10 분 동안 800 G에서 4섭씨에서 얼음 차가운 PBS및 원심분리기로 셀 펠릿을 두 번 씻습니다. 다음으로, PBS의 20 밀리리터에 100x 프로테아제 억제제의 200 마이크로리터를 추가합니다.

PBS 프로테아제 억제제 혼합물의 세포를 밀리리터 당 5밀리그램의 최종 단백질 농도로 재중단한다. 프로테아제 억제제와 PBS에서 3.3 밀리머 디지토닌을 준비하려면 침전이 보이지 않을 때까지 100섭씨 1밀리터에 4 밀리그램의 디지토닌을 녹입니다. 얼음을 즉시 식히고 디지토닌 용액의 1 밀리리터에 100x 프로테아제 억제제 10마이크로리터를 추가합니다.

다음으로, 1.65 밀리머의 최종 농도에서 세포에 디지토닌 프로테아제 억제제 혼합물을 첨가한다. 잘 섞어서 얼음에 5분간 배양하세요. 그런 다음, 1.5 밀리리터의 최종 부피에 세포에 PBS 프로테아제 억제제 혼합물을 추가한다.

10분, 000G에서 섭씨 4도에서 원심분리기. 상체를 제거하고 미토콘드리아 완충제에서 미토콘드리아 펠릿을 다시 중단하십시오. PBS 억제제 용액에 장착된 신선한 10% loreal 마운트1밀리리터를 준비합니다.

미토콘드리아에 10% 로레알 마운트를 넣고 얼음에 1%인큐베이션을 15분 이상 넣으세요. 20분 동안 섭씨 4도, 000 G에서 원심분리기. 상체를 새 튜브에 수집하고 샘플 버퍼를 추가합니다.

블루 네이티브 페이지를 위한 그라데이션 젤을 준비하려면 그라데이션 메이커를 교반 판에 넣고 유연한 튜빙과 연동 펌프에 연결하십시오. 튜브에 바늘이 있는 주입 세트를 부착합니다. 마그네틱 교반기를 그라데이션 메이커의 근위 챔버에 넣고 10분 동안 최대 펌프 속도로 증류수로 튜브를 세척합니다.

다음으로 튜빙과 그라데이션 메이커를 비웁습니다. 파이펫을 사용하여 그라데이션 메이커의 챔버 사이의 채널에서 남은 증류수를 제거합니다. 밸브로 채널과 튜브를 닫습니다.

홀더에 유리 판 두 개를 조립하고 스탠드에 놓습니다. 젤 홀더 의 바닥에 구멍을 사용하여, 유리 플레이트 사이의 튜브에 연결된 바늘을 배치합니다. 8.3 x 7.3센티미터 젤을 만들기 위해 먼저 6%와 15%의 젤 솔루션을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.

기포를 만들지 않도록 부드럽게 섞습니다. 이어서, 그라데이션 젤 믹서 튜빙 챔버의 근열끝을 6%젤의 2.6 밀리리터와 15%젤의 2.1 밀리리터로 말단을 적재한다. 다음으로, 자기 교반기켜서를 켜고 그라데이션 메이커의 챔버 사이의 튜브와 채널을 엽니다.

연동 펌프를 분당 5밀리리터로 즉시 켭분으로 전환합니다. 튜브에 젤이 없을 때 유리 판을 채우고 바늘을 제거하십시오. 부드럽게 증류수와 젤을 오버레이하고 적어도 한 시간 동안 실온에서 젤을 유지합니다.

그라데이션 챔버를 증류수로 채우고 최대 속도로 연동 펌프를 사용하여 튜브를 즉시 세척하십시오. 증류수 6밀리리터를 3x 젤 버퍼 3개에 추가하여 1x 젤 버퍼를 만듭니다. 필터 용지를 사용하면 젤 표면에서 증류수를 부드럽게 제거합니다.

젤 표면을 1x 젤 버퍼로 씻고 필터 용지로 버퍼를 부드럽게 제거합니다. 원고에 따라 4 %의 스태킹 젤을 준비하십시오. 거품을 만들지 않도록 부드럽게 섞습니다.

그런 다음, 유리 접시 사이에 빗을 놓고 빗 아래에 스태킹 젤을 붓습니다. 빗을 완전히 담그면 됩니다. 스태킹 젤을 30분 이상 중합하게 하십시오.

그런 다음 빗을 제거하고 파이펫을 사용하여 1x 젤 버퍼로 우물을 씻습니다. 블루 네이티브 젤 전기 포를 수행하려면 먼저, 젤 카세트에 파란색 음극 버퍼를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 우물을 씻고 파란색 음극 버퍼로 채웁니다.

그런 다음 5~30마이크로그램의 단백질 샘플을 우물에 적재합니다. 젤 카세트를 파란색 음극 버퍼로 상단에 부드럽게 채우고 탱크는 양극 버퍼로 채웁니다. 먼저 젤을 40볼트의 일정한 전압으로 15분간 실행합니다.

그런 다음 전압을 80볼트로 늘립니다. 염료가 젤 길이의 2/3에 도달 할 때까지 젤을 실행합니다. 파란색 음극 버퍼를 음극 버퍼로 교체하고 염료 전면이 젤에서 벗어날 때까지 전기 전광을 계속합니다.

유리 판을 회수하고 반건조 블롯팅을 통해 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮길 수 있습니다. 25볼트의 일정한 전압과 30분 동안 1암페어로 제한되는 전류를 사용합니다. 인간 신경모세포종 세포내호흡기사슬 복합체의 조립은 치료 없이 대조세포에 비해 클로람페니콜 치료에 의해 억제되었다.

대조적으로, 핵 유전자에 의해 인코딩된 복합체는 위로 통제되었습니다. 산화 인산화 복합체의 분해는 여러 동결 해동 주기에 따라 관찰되었다. 젤의 품질산화 인산화 복합체의 검출에 영향을 미칠 수 있습니다.

또한 멤브레인의 제거는 신호 대 잡음 비율을 낮췄습니다. 절차를 수행할 때, 선극 OXPHOS 복합체를 보존하기 위해 추운 조건 하에서 간단한 준비 및 젤 전기 포이를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 파란색 네이티브 페이지에 이어, 두 번째 차원 SDS 페이지는 호흡기 사슬 복합체의 단백질 하위 단위를 연구하기 위해 적용 될 수있다.

블루 네이티브 페이지는 연구원이 복합체의 조립과 산화 인산화 시스템의 심지어 슈퍼 복합체를 연구 할 수 있습니다.