Name: 다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 골육종 연구를 위한 3차원 뼈 세포외기질 모델을 만드는 방법을. 탈세포화된 뼈 매트릭스에서 골육종 세포를 배양하여 임상 병리학적 특성을 재현하고 약물 민감도를 평가할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자 가치 뼈 기질 장비의 건설 기간 동안 그의 뛰어난 기술 지원에 대 한 그녀의 행정 지원 및 긴 Zhao Liuying 첸의 지원. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (31871413)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.

동물 관리 및 사용은 실시 건강 가이드의 국가 학회에 따르면 치료 및 사용의 실험실 동물 (NIH 간행물 NO.80-23, 1996 년에서 개정)에 대 한는 동물 윤리 위원회의 썬 얏-센 대학교에서 승인 후.
1. 뼈 준비
<ol><li>4를 6 주 된 BALB/c 마우스 (없이 섹스 관련 요구 사항)를 가져옵니다. 자 궁 경부 전위에 의해 aseptically 마우스를 안락사 하 고 신선한 비 골, 경골 및 대 퇴 골 한 hindlimb에서 불 임 수술가 위로 잘라. 상피 조직 벗기십시오 고가 위 핀셋을 사용 하 여 가능한 부드러운 조직을 많이 제거.</li>
	<li>살 균 10 m m 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 6 cm 접시에 혈액을 제거를 두 번와 다리 뼈를 씻어. 3 분, 75% 에탄올에 뼈를 담 궈 후 PBS로 두번 씻어. 깨끗 한 뼈 개월까지 필요한 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브-80 ° C에서 살 균 PBS에에서 저장할 수 있습니다. 참고: 모든 다음 단계에 사용 하는 PBS는 10 mM 포43−.</li>
</ol>2. 뼈 demineralization 및 decellularization
<ol><li>실내 온도에, 냉동된 뼈를 녹여 하 고 다시 동결-80 ° C에서 1 헤 셀 세포 및 조직 분석에 대 한 2-3 회 freeze-thaw 주기를 뼈를 주제에 대 한.</li>
	<li>0.5와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 뼈를 품 어 뼈의 완전 하 고도 범위를 보장 하기 위해 부드러운 락/동요와 락 플랫폼 또는 궤도 통에 실 온에서 하룻밤 N HCl. 참고: 뼈는 산에 모션 동안 완전히 몰입 하 고 과정에서 정착 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. HCl 솔루션의 볼륨은 뼈의 10 배 이상 이어야 한다.</li>
	<li>Decalcification, 후 완전히 HCl 솔루션을 가만히 따르다와 흐르는 물에 1 시간을 위해 린스. 그런 다음 락 플랫폼 또는 궤도 셰이 커에 증류수 세척 당 15 분 동안 두 번 뼈를 씻어. 참고: 솔루션 또는 물 세척 사이 및 최종 세척 후 증류수를 완전히 제거 해야 합니다.</li>
	<li>메탄올의 1:1 혼합 광된 뼈에 지질 및 실내 온도10에서 1 시간에 대 한 주석 호 일 포장 50 mL 원심 분리기 튜브에 클로 프롬을 추출.</li>
	<li>그런 다음 전송 30 분에 대 한 주석 호 일으로 감싸 메탄올의 다른 튜브에 뼈 완전히 메탄올을 제거 하 고 린스 부드럽게 흔들어와 15 분 동안 두 번 증류수. 최종 세척 수를 가만히 따르다 하 고 무 균 조건 하에서 다음 단계를 진행 합니다. 참고: 추출 단계에서 라이트는 클로 프롬 분해를 방지 하기 위해 피해 야 한다. 혼합물은 빛-내성 컨테이너에 저장할 수 있습니다 또는 원심 분리기 튜브 깡통 호 일으로 감싸. 모든 처리를 수행 하 고 겸손 한 회전 또는 모션 락 아래 단계를 씻어.</li>
	<li>6 cm 3 분 살 균 PBS 가진 접시에 뼈를 헹 구 고 새로운 50 mL 원심 분리기 관으로 뼈를 전송. 튜브에 40 mL 살 균 0.05% 트립 신-EDTA (테)를 추가 하 고 37 ° C18에서 CO2 배양 기에서 23 h에 대 한 뼈를 품 어.</li>
	<li>테 솔루션을 무시 하 고 살 균 PBS 90 μ g/mL 암 피 실린과 90 μ g/mL 대 보충으로 두 번 씻어. 마지막 decanting 후 완전히 씻어 PBS, 40 mL 살 균 PBS를 가진 보충. 부드러운 락 또는 항생제 담가 흔들어 실 온에서 24 h에 대 한 철저 하 게 씻는 다. 참고:이 다음 단계에 사용 되는 모든 살 균 PBS 90 μ g/mL 암 피 실린 및 90 μ g/mL 대 포함 한다. 회전 또는 모션 락 하룻밤 세척 기 공 공간의 효과적인 살 균을 달성 하기 위해 항생제와 오랜 기간 철저 한 침수에 대 한 수행 됩니다.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 살 균 PBS 가득 신선한 50 mL 원심 분리기 관으로 뼈를 전송. 준비는 광 고 decellularized 뼈 뼈 기질 (괜 찮) 라고 하며 2 개월 필요할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 셀 시드 및 문화
<ol><li>벰 4 ℃ 냉장고에서 꺼내와 두 번 30 s, 다음 PBS와 린스에 대 한 75% 에탄올에 몰두. 깨끗 한 6 잘 셀 문화 접시에 벰 전송. 2 mL 전체 문화 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간/F12 (DF12) 5% 태아 둔감 한 혈 청, 90 μ g/mL 암 피 실린 및 90 μ g/mL 대 포함)를 추가 합니다. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 벰 품 어</li>
	<li>인간의 OS 셀 선을 (MNNG/호 및 밀리 그램-63)를 가져옵니다. 표시기로 페 놀 레드를 포함 하는 100 μ PBS를 가진 105 OS 셀 x 약 1.0를 일시 중단 합니다. 참고: 더 나은 추적 하 고 관찰 하는 3 차원 벰 모델 내에서 다층 셀, MNNG/호 및 밀리 그램-63는 감염 lentiviral 벡터 형광 mCherry와 녹색 형광 단백질 (GFP).</li>
	<li>후에 괜 찮은 매체에 완전히 젖 었, OS 셀에 삽입할 벰 인접 또는 말 초 뼈에서 바늘 벰의 골 수 구멍에 도달 하면. 습도 5%에서 2 h의 최소 운영 체제-벰 모델을 품 어 삽입 된 셀 단단히 벰 준수 되도록 37 ° C에서 CO2 분위기. 참고: 사전 따뜻한 세포 배양에 대 한 모든 미디어 사용. 세포 배양에 사용 하는 인큐베이터는 습도 37 ° c.에 5% CO2 분위기</li>
	<li>완전히 하룻밤 37 ° c.에 CO2 배양 기에서에서 벰 문화의 표면 코트 접시에 1 mL 완전 한 문화 매체를 추가</li>
	<li>6 잘 플레이트 살 균 족집게와 refeed 1 mL 신선한 문화 매체의 새로운 우물으로 부드럽게 전송 OS 벰 모델. 37 ° C에서 CO2 배양 기에서 14 일에 대 한 모델을 문화 고 문화 매체 운영 체제 셀의 확산 상황에 따라 새로 고칩니다.</li>
	<li>문화 과정에서 거꾸로 형광 현미경 중간 색상 및 셀 상태를 모니터링 하십시오. OS 셀 접시를 확장, 부드럽게 다른 살 균 족집게와 새로운 운영 체제-벰 모델을 전송 합니다. 참고: 문화 매체는 대부분 포유류 세포 배양에 대 한 최적의 pH 값은 pH 7.4에 밝은 빨간색입니다. 매체 주황색 또는 노란색으로 변하면, 즉시 OS 셀에 대 한 건강 한 환경을 유지 하기 위하여 매체를 새로 고칩니다.</li>
	<li>핀셋으로 새로운 잘으로 OS 벰 모델을 전송 하 고 문화 매체를 제거 하는 PBS로 부드럽게 씻어. 그리고, 15 mL 원심 분리기 튜브로 전송 조직학 식별에 대 한 버퍼링 10% 포 르 말린으로 고정 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bone+osteosarcoma+in+the+pediatric+age%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art.</a> Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).</li>
<li>Mohseny, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+originates+from+mesenchymal+stem+cells+in+consequence+of+aneuploidization+and+genomic+loss+of+Cdkn2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2.</a> Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).</li>
<li>Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+origin+in+osteosarcoma%3A+mesenchymal+stem+cells+or+osteoblast+committed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells.</a> Bone. 62, 56-63 (2014).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+tumors+can+derive+from+Ng2%2FCspg4-Expressing+pericytes+with+%CE%B2-Catenin+modulating+the+neoplastic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype.</a> Cell Reports. 16, 917-927 (2016).</li>
<li>Patane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET+overexpression+turns+human+primary+osteoblasts+into+osteosarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas.</a> Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).</li>
<li>Poos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+heterogeneity+of+osteosarcoma+-+shift+from+single+candidates+to+functional+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules.</a> PLoS One. 10, 123082(2015).</li>
<li>Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">The genetics of osteosarcoma.</a> Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).</li>
<li>Alfranca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+microenvironment+signals+in+osteosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bone microenvironment signals in osteosarcoma development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).</li>
<li>Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+networks+in+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix networks in bone remodeling.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).</li>
<li>Sawkins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+derived+from+demineralized+and+decellularized+bone+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix.</a> Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).</li>
<li>Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+extracellular+matrix+hydrogel+enhances+osteogenic+differentiation+of+C2C12+myoblasts+and+mouse+primary+calvarial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B-Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).</li>
<li>Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bone+extracellular+matrix+synthesized+in+vitro+on+the+osteoblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells.</a> Biomaterials. 26, 971-977 (2005).</li>
<li>Rubio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+environment+is+essential+for+osteosarcoma+development+from+transformed+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).</li>
<li>Sadr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+biological+performance+of+synthetic+polymeric+materials+by+decoration+with+engineered%2C+decellularized+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix.</a> Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).</li>
<li>Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+in+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anz+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins in clinical applications.</a> Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).</li>
<li>Rochet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+expression+induced+in+human+osteogenic+and+osteosarcoma+cells+by+culture+on+a+biphasic+calcium+phosphate+bone+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute.</a> Bone. 32, 602-610 (2003).</li>
<li>Spang, M. T., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+therapies%3A+in+vivo+applications+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development.</a> Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).</li>
<li>Schenke-Layland, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+decellularization+of+xenogeneic+tissue+on+extracellular+matrix+integrity+for+tissue+engineering+of+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves.</a> Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).</li>
<li>Klein, M. J., Siegal, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+anatomic+and+histologic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: anatomic and histologic variants.</a> American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).</li>
<li>Lipinski, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+evolution+and+the+limits+of+predictability+in+precision+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine.</a> Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).</li>
<li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+and+tumor+evolution%3A+past%2C+present%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future.</a> Cell. 168, 613-628 (2017).</li>
<li>Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+bone+sarcomas+and+new+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments.</a> Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+cells-of-origin%2C+cancer+stem+cells%2C+and+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies.</a> Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).</li>
<li>Tsukamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+promote+tumor+engraftment+and+metastatic+colonization+in+rat+osteosarcoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model.</a> International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).</li>
<li>Rodriguez, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+gemcitabine%3A+preclinical+safety+and+in+vivo+antitumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Medicine+and+Pulmonary+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).</li>
<li>Rodriguez, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+canine+osteosarcoma+as+a+model+to+assess+efficacy+of+novel+therapies%3A+Can+old+dogs+teach+us+new+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).</li>
<li>Mohseny, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+osteosarcoma+zebrafish+model+implicates+Mmp-19+and+Ets-1+as+well+as+reduced+host+immune+response+in+angiogenesis+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration.</a> Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).</li>
<li>Saalfrank, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+model+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A porcine model of osteosarcoma.</a> Oncogenesis. 5, 210(2016).</li>
<li>Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+exerts+as+a+key+regulator+in+the+dedifferentiation+of+osteosarcoma+via+PAI-1%E2%80%93Sox2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis.</a> Cell Death & Disease. 9, (2018).</li>
<li>Hashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+decellularized+bone%2Fbone+marrow+produced+by+high-hydrostatic+pressurization+on+the+osteogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).</li>
<li>Benders, K. E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).</li>
<li>Grayson, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+initial+seeding+density+and+fluid+perfusion+rate+on+formation+of+tissue-engineered+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).</li>
<li>Mikulic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis+and+outcome+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Hematology+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma.</a> Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).</li>
<li>Ren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry%3A+a+new+prognostic+sign+of+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma.</a> Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).</li>
<li>Bonuccelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mesenchymal+stem+cells+in+osteosarcoma+and+metabolic+reprogramming+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells.</a> Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

일반적으로, OS로 osteoblastic 분류 될 수 있다, 그것의 지배적인 더 구성 요소에 따라 chondroblastic, 및 ﬁbroblastic 하위. 그것의 예 지는 그것의 해부학 사이트에 뿐만 아니라 더 매개 변수 뿐만 아니라 의존 합니다. 그것은 extraosseous 사이트19그리고 뼈의 표면에 (intramedullary 또는 intracortical 구획)에서 뼈 안에 발생할 수 있습니다. 출현 및이 운영 체제의 종양 이벤트 및 증가 개발 및 마이그레이션 먼 장기20,21,22에 이어서 적절 한 microenvironmental 부스트의 활용으로 해명 될 수 있습니다. ,23. 미스터리 OS 진화 하는 동안 적절 한 모델 OS 환경 및 틈...

다리 (OS)는 적극적으로 성장 하는 지역, 긴 뼈의 metaphysis 사춘기 동안에 일반적으로 발생 합니다. 운영 체제의 영향을 받는 사이트의 80% 이상이 있다 metaphysis 원심 및 근 위 대 퇴 골, 성장 판1의 위치에 해당 뿐만 아니라 근 위 경골 근 위 상 완 골의 대 한 선호. 운영 체제 여러 셀 하위 엽 속성 및 조직학 특징 및 급료에서 상당한 다양성으로 구성 되어 있습니다. 증거 원본2,3,,45의 셀으로 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), osteoblasts 커밋된 선구자 및 pericytes을 지원합니다. 이러한 세포 축적 유전자 또는 후 변경 하 고 특정 뼈 microenvironmental 신호의 영향 아래 운영 체제를 야기할 수 있습니다. 내부 및 외부 메커니즘 genomic 불안정성 및 여러 형태학 상과 임상 고기6,7운영 체제의이 결과. 개별된 치료, 새로운 의약품의 심사에 대 한 새로운 모델이 또는 다른 임상 질환에 대 한 생성 될 필요가 있다.
운영 체제는 내부 뼈가 있는 악성 고체 종양입니다. 복잡성과 활동의 microenvironment 요소를 둘러싼 OS 세포 종양의 다른 위치에 따라 phenotypic와 기능 차이 부여. 뼈 기질 (괜 찮) 미네랄 증 착 및 뼈 구조 및 생 화 확 적인 발판을 제공합니다. 세포 외 기질 (ECM)의 유기 부분은 주로 이루어져 있다 유형 나 콜라겐의 광물 화 된 부분 hydroxyapatite8의 형태로 칼슘 인산 염의 구성 하는 동안 osteoblastic 계보 세포에 의해 분 비. 세포 접착을 규제 하는 ECM 네트워크의 동적 역할, 차별화, 잡담 및 조직 기능 유지 관리9.
광된 벰 및 ECM hydrogels 성공적으로 세포 배양에 사용 되 고 세포 확산10,11을 향상 시킬 수 있습니다. 합성된 뼈 같은 ECM 수영장 크기, 운명 결정 및 MSCs12,,1314의 계보 진행을 조절할 수 있습니다. 또한, 결과 뼈 형성과 재생15,,1617중 자극 세포 프로세스 osteogenic 활동을 제공 하는 임상 의미 증거.
이 문서에서는, 우리의 그룹 수정 모델과 3 차원 장기 문화에 대 한 유리한 대안을 설정합니다. OS 셀 조직 파생 벰 주입 플라스틱 2 차원 문화에 비해 쉽게 heterogeneously 엽 형 제시. 벰에서에서 파생 된 사이트별 동종 조직 쇼 그것의 극적인 이용으로 운영 체제에 대 한 네이티브 틈새 체 외에서 세포 고 운영 체제 이론 및 임상 연구에 큰 잠재력이 있다. 이 특징이 벰 플랫폼 간단 하지만 생체 외에서 연구를 위한 효율적 이며 여러 암 모델링에 확장 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td>, <td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td>, <td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 세포 배양 접시</td>, <td>Greiner</td><td>628160</td><td></td></tr>, <tr><td>6-well plate</td>, <td>Greiner</td><td>657160</td><td></td></tr>, <tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>C57-BL/6J mouse</td><td>, Sun Yat-sen University Laboratory 동물 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 인산나트륨</td><td>광저우 화학 시약 공장</td><td>BE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>MG-63</td><td>중국과학원, 상하이 세포은행</td><td></td><td>인간 골육종 세포주</td></tr><tr><td>MNNG/HOS</td><td>중국과학원, 상하이 세포은행</td><td></td><td>인간 골육종 세포주</td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4633</td><td>페놀 레드 용액은 pH 지시약으로 사용됩니다 : 그 색상은 pH 범위 6.6에서 8.0에 걸쳐 노란색에서 빨간색으로 점진적으로 전이됩니다.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sangon Biotech</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>Sangon Biotech</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218</td><td></td></tr></tbody></table>

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

다리 (OS)는 가장 일반적이 고 매우 공격적 기본 뼈 종양 이다. 해부학 및 조직학 변화 진단 또는 전조 어려움 함께 특징입니다. 운영 체제 genotypically 그리고 phenotypically 이종 암 세포를 구성 되어 있습니다. 뼈 microenvironment 요소는 종양이 고 질병 진행에 대 한 계정에 입증 했다. 뼈 기질 (괜 찮) microstructural 행렬 및 기본 세포 외 매트릭스의 생 화 확 적인 구성 요소를 유지합니다. 이 조직의 특정 틈새 OS 셀 시드 및 확산에 대 한 유리한 및 장기 비 계를 제공 합니다. 이 문서는 벰 모델과 더 실험적인 응용 프로그램의 준비에 대 한 프로토콜을 제공합니다. OS 셀 성장 하 고 여러 고기 OS 임상 표본의 histopathological 복잡도와 일치로 분화 수 있습니다. 모델은 또한 다양 한 형태학 그리고 유전 변경 및 내부 규제 메커니즘 함께 그들의 협회의 시각화 수 있습니다. 인간의 OS에 동종로이 벰 OS 모델 개발 고 병 리 및 운영 체제의 임상 연구에 적용 될 수 있습니다.

Demineralization decellularization 후에, 벰 강한 탄력성과 기본 마우스 뼈에 비해 끈기와 반투명 것 처럼 보인다. 찌 꺼 기를 작은 근육 및 골 수 구멍의 공간은 (그림 1A, B) 명확 하 게 관찰 될 수 있다. 벰의 효과적인 decellularization를 확인 하려면 벰 파라핀에 고정, 후 포함 이며 다음 되며 오신 (H &amp; E) 얼룩에 대 한 3-5 μ m 섹션으로 슬라이스. 세포 핵의 철저 한 제거는 밝은 필드 영상으로 표시 됩니다. 자연 다공성 구조와 콜라겐 네트워크 배치 decellularized 벰 (그림 1C, D)에 잘 유지 됩니다. 또한, 네이티브 뼈 (그림 1E)에 비해 벰 decellularized immunohistoc...

다리 (OS)의 뼈 기질 (괜 찮) 모델은 잘 설립 하 고 그림 여기. 그것은 기본 종양 성장에서 생체 외에서 흉내 낸 및 OS의 조직학 및 cytogenic이 공부에 대 한 이상적인 모델을 제공 하는 적당 한 발판으로 사용할 수 있습니다.

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

이 방법은 뼈 종양 연구를 위한 기능적인 비계를 준비하기 위한 능률적인 전략을 제공합니다. 뼈 외수성 매트릭스를 탈세포화, 골육종 세포의 생존과 활동에 대한 가변 혈청 호환성을 보였다. 이 기술의 주요 장점은 뼈 유래 매트릭스에서 골육종 세포 배양임상 골육종 조직 병리학과 유사한 매우 이종성 형태를 보여준다는 것입니다.이 방법은 골육종, 유잉 육종 및 뼈에 대한 다른 악성 종양 전이와 같은 뼈 종양의 발달, 약물 민감성의 진행을 조사하기위한 이상적인 모델을 제공합니다. 시작하려면 멸균 수술 가위를 사용하여 마우스를 안락사한 후 4- 6 주 된 BALB / c 마우스를 얻고 뒷사지에서 신선한 비골, 경골 및 대퇴골을 잘라냅니다. 핀셋의 도움으로 상피 조직을 벗겨 낸 다음 가능한 한 많은 연조직을 제거하십시오.멸균 10m PBS 용액으로 다리 뼈를 헹구어 6센티미터 접시에 혈액을 제거합니다. 뼈를 75%에탄올로 3분간 담그고 PBS로 두 번 헹구습니다. 멸균 된 PBS 튜브와 멸균 50 밀리 리터 원심 분리 튜브에 깨끗한 뼈를 저장 하 고 80 섭씨.실온에서 얼어 붙은 뼈를 해동한 다음 1 시간 동안 섭씨 80도에서 다시 얼어 붙습니다. 세포 용해 및 조직 고장에 대 한 두 개 이상의 동결 해동 사이클에 뼈를 피사체. 그런 다음 0.5 개의 일반 HCl로 채워진 멸균 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 뼈를 놓고 뼈의 완전하고 균일한 커버리지를 보장하기 위해 부드러운 흔들림으로 궤도 셰이커의 실온에서 하룻밤 동안 배양하십시오.탈축 후, 염산 용액을 완전히 분해하고 흐르는 물 에서 뼈를 1 시간 동안 헹구는다. 그런 다음 증류수를 사용하여 궤도 셰이커에서 세척당 15분 동안 뼈를 두 번 씻습니다. 솔루션을 완전히 decant.탈염된 뼈에서 지질을 추출하려면 메탄올과 클로로폼의 1:1 혼합물로 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 뼈를 놓습니다. 클로로폼 분해를 방지하기 위해 빛을 피하기 위해 주석 호일로 튜브를 감쌉합니다. 그리고 한 시간 동안 궤도 셰이커에 튜브를 넣어.그런 다음 핀셋을 사용하여 뼈를 주석 호일로 메탄올의 다른 튜브로 30 분 동안 옮길 수 있습니다. 메탄올을 완전히 제거하고 궤도 셰이커에서 15분 동안 증류수를 두 번 씻습니다. 데낸스는 최종 세척수를 세척하고 멸균 상태에서 진행합니다.멸균 PBS로 6센티미터 접시에 뼈를 헹구고 3분간 헹구습니다. 멸균 0.05%TE 용액 40밀리리터를 50밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 37°C의 이산화탄소 인큐베이터에서 23시간 동안 뼈를 배양합니다. TE 용액을 버리고, 90 g/mL 암피실린과 90 g/mL 카나마이신으로 보충된 멸균 PBS로 두 번 헹구고 궤도 셰이커에서 각각 15분 동안 헹구십시오.최종 세척을 완전히 제거 한 후 항생제로 멸균 PBS 40 밀리리터로 다시 보충하십시오. 다공성 공간의 효과적인 살균을 달성하기 위해 부드러운 흔들림으로 실온에서 24 시간 동안 철저히 씻으십시오. 그런 다음 뼈를 항생제로 멸균 PBS로 채워진 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다.준비된 뼈 세포 외 매트릭스는 2 개월 동안 섭씨 4도에서 저장할 수 있습니다. BEM을 75%에탄올에 담그고 30초 동안 손으로 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 PBS로 헹구고 30초, 두 번 헹구습니다.BEM을 깨끗한 6웰 세포 배양판으로 옮기. 각 웰에 완전한 배양 배지의 2 밀리리터를 추가합니다. 1박 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 BEM을 배양합니다.표시기 페놀 레드를 포함하는 사전 따뜻워진 PBS의 100 마이크로리터에서 인간 OS 세포주를 가져옵니다. 파이펫을 사용하여 1회 10대 5의 대략적인 농도로 OS 셀을 일시 중단한다. BEM이 근위 또는 탈후 에피피스에서 배지에 완전히 담근 후 바늘을 BEM의 수질 구멍에 관통하고 OS 세포를 BEM에 주입합니다.OS-BEM 모델을 37°C의 가습된 5%이산화탄소 대기에서 최소 2시간 동안 배양하여 주입된 세포가 BEM에 단단히 부착되도록 합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 접시를 꺼내십시오. 접시에 밀리리터 배양 배지 1개를 넣고 하룻밤 동안 인큐베이터에 보관하여 BEM 배양의 표면을 완전히 코팅합니다.OS-BEM 모델을 멸균 트위저가 있는 6웰 플레이트의 새로운 웰로 부드럽게 옮기고 1밀리리터 의 신선한 배양 배지를 재공급합니다. 인큐베이터에서 14일 동안 모델을 배양합니다. 14일 잠복식 동안 중간 색상을 모니터링하십시오.매체가 주황색 또는 노란색으로 변하는 경우, 기존 배지의 절반을 버리고 OS 셀에 대한 건강한 환경을 유지하기 위해 새로운 배지를 추가하여 즉시 배지를 새로 고칩니다. 반전된 형광 현미경하에서 세포 상태를 모니터링하십시오. OS 셀이 플레이트로 확장되면 멸균 핀셋을 사용하여 OS-BEM 모델을 다른 새로운 웰로 부드럽게 전송합니다.14일 배양 후 PBS로 OS-BEM 모델을 부드럽게 헹구어 배양 매체를 제거합니다. 그런 다음 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 10%의 버퍼링 된 포르말린을 추가하여 조직학적 식별을 수정합니다. 탈염 및 탈세포화 후, BEM은 네이티브 마우스 뼈에 비해 더 강한 탄력성과 끈기로 반투명한 것으로 보입니다.수질 구멍의 공간에서 약간의 근육 잔류물을 명확하게 관찰 할 수 있습니다. 네이티브 뼈와 탈세포화된 BEM의 밝은 필드 이미징은 세포 핵의 철저한 제거를 보여줍니다. 콜라겐 네트워크 배열의 천연 다공성 구조는 탈세포형 BEM에서 잘 유지됩니다.또한, 콜라겐 I및 콜라겐 IV를 위한 면역히스토화학 염색은 세포외 매트릭스의 주요 성분이 탈세포화 후 마우스 경골에서 보존된다는 것을 보여준다. 14일 배양 시, 골막과 종말은 모두 OS 세포의 확장에 의해 침투된다. 탈세포화된 BEM의 OS 세포는 OS 섹션의 세포 병리학 적 특징과 유사한 고질적 형태학을 보여줍니다.14일 동안 BEM 모델에서 배양후 면역히토화학적 분석은 장기 배양에서 큰 이점을 보여준다. 또한, OS 세포 및 BEM 배양, 고발성 골매트릭스 당단백질, 이는 골성 매트릭스에 특이적이다. 이 체외의 3 차원 모델은 표현이 질성과 성공과 골육종 분광의 규제 메커니즘을 입증하는 데 사용되었습니다.

three-dimensional-bone-extracellular-matrix-model-for-osteosarcoma

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

여기, 우리 제시 프로토콜 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대에 대 한 Li Fraumeni 증후군 (LFS) 환자 파생된 섬유 아 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)를 통해 Ipsc의 차별화에서에서 osteoblasts, 및 모델링 비보 tumorigenesis LFS 환자 파생 osteoblasts를 사용 하 여입니다.

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

이 논문은 이전에 설명한 3차원 콜라겐 기반 스캐폴드에 신경모세포종 세포주를 파종하고, 미리 결정된 기간 동안 세포 성장을 유지하고, 다양한 실험 목표를 충족하도록 적응할 수 있는 여러 세포 성장 및 세포 행동 분석 및 다운스트림 애플리케이션을 위한 스캐폴드를 검색하는 데 필요한 단계를 나열합니다.

콜라겐 기반 스캐폴드를 사용한 신경모세포종의 3차원 체외 생체모방 모델

본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

여기에서는 인간 골수의 생체 내 구조의 복잡성을 반영하는 구현하기 쉽고 표준화된 미세생리학적 시스템을 설명하여 광범위한 정상 및 병리학적 사건을 미세하게 연구할 수 있는 관련 모델을 제공합니다.

생리학적 또는 종양적 맥락에서 상주 세포 간의 역학 및 상호 작용을 조사하기 위한 인간 골수 3D 모델

본 프로토콜은 인간 골육종 조직을 이용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명한다.

인간 골육종 조직을 이용한 환자 유래 이종이식 마우스 모델 구축

우리는 다양한 계층적 수준에서 뼈 재생을 평가하는 프로토콜을 제안합니다. 이 다중 모달 접근법은 다양한 길이 척도에서 구조 분석을 가능하게 하여 시료 준비의 문제를 효과적으로 해결합니다. 또한 생체 재료가 뼈 재생을 촉진하는 효과를 평가하는 신뢰할 수 있는 워크플로우를 제공합니다.

골 재생 및 스캐폴드 성능 평가를 위한 다중 모드 접근법

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

배우세요 골육종 연구를 위한 3차원 뼈 세포외기질 모델을 만드는 방법을. 탈세포화된 뼈 매트릭스에서 골육종 세포를 배양하여 임상 병리학적 특성을 재현하고 약물 민감도를 평가할 수 있습니다.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

더 많은 동영상 탐색