Name: 이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 학습하세요 반도체 시퀀싱을 활용한 이류성 착상 전 유전자 검사 방법으로, 2-4시간의 짧은 런타임과 5일 이내 결과 보고가 가능합니다. 이 기술은 배아의 비정수체성을 신속하고 비용 효율적으로 선별하여 생식 건강 임상 적용에 기여합니다.

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이 연구는 홍콩의 일반 연구 기금 (참조 번호 14162417) 중국 국립 자연 과학 재단 (참조 번호 81860272), 광시 지방 과학 기술 재단의 주요 연구 계획에 의해 지원되었다 (참조 번호) AB16380219), 그리고 중국에서 중국 박사 후 과학 재단 보조금 (참조 번호 2018M630993).

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<li>Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+microarray-based+24+chromosome+aneuploidy+screening+demonstrates+that+cleavage-stage+FISH+poorly+predicts+aneuploidy+in+embryos+that+develop+to+morphologically+normal+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).</li>
<li>Barbash-Hazan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+aneuploid+embryos+undergo+self-correction+in+correlation+with+their+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).</li>
<li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+cytogenetic+analysis+of+the+human+blastocyst+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage.</a> Fertility and Sterility. 90 (11), S36(2008).</li>
<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+next-generation+sequencing-based+protocol+for+24-chromosome+aneuploidy+screening+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos.</a> Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).</li>
<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+preimplantation+genetic+screening+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li>
<li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencingplatforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+PacificBiosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+preimplantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Prenatal+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li>
<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium%2FEmbryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis%2Fscreening+%28PGD%2FPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li>
<li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+performance+of+MALBAC+and+MDA+methods+in+the+identification+of+concurrent+mutations+and+aneuploidy+screening+to+diagnose+beta-thalassaemia+disorders+at+the+single-+and+multiple-cell+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+the+performance+of+four+whole+genome+amplification+kits+on+ion+proton+platform+in+copy+number+variation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection.</a> Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252(2017).</li>
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<li>Treff, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+targeted+next-generation+sequencing-based+preimplantation+genetic+diagnosis+of+monogenic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

다른 시퀀싱 화학과는 달리, 여기에 설명된 시퀀서는 뉴클레오티드 검출을 위해 반도체를 사용합니다. 칩 자체는 양성자 프로그램의 2−4 시간 시퀀싱 시간을 가능하게 하는 폴리머라제 구동 염기 통합17에의해 수소 이온을 검출하는 전자 장치입니다. 게다가, 칩은 다른 시퀀서 공급자에 의한 유동 세포 시퀀싱 화학과 다른 하나의 표적 분자의 국소화를 허용하는 마이크로웰 칩이다. 이 프로토콜은 PGT-A의 적용에 최적화된 수정된 프로토콜입니다. 최적화는 오염의 기회를 줄이기 위해 초음파 대신 효소 방법에 의해 증폭 된 DNA의 단편화뿐만 아니라 크기 선택및 저렴한 비용으로 더 나은 성능을 위한 PCR 시스템을 포함한다. 또한 임상 환경에서는 변이체 호출을 위해 검증된 사내 파이프라인을 사용했습니다.
연습 중에 주의해야 할 중요한 단계가 있습니다. 정제를 위한 에탄올은 실험 전에 신선하게 준비되어야 하며, 에탄올의 고농도는 오염된 DNA의 세척을 불...

보조 생식에 있는 전송을 위한 일반적인 염색체 사본 수 (euploid)를 가진 좋은 질 실행 가능한 태아를 선택하는 것은 임신 결과를 향상하는 것을 돕습니다. 전통적으로, 잘 확립 된 형태 학적 등급 시스템은 쉽게 가용성과 비 침습적 특성으로 인해 배아 평가에 널리 사용됩니다. 그러나, 형태학적 평가는 배아 질1 및 이식 잠재력2에대한 제한된 정보만 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 한 가지 근본적인 이유는 배아의 염색체 조성을 평가할 수 없기 때문입니다.
염색체 이수성 (염색체의 비정상적인 카피 수)은 배아 발달 체포, 이식 실패 또는 임신 손실로 이어지는 주요 원인 중 하나입니다. 이수성의 발생은 인간 배아에서 잘 문서화되어 있으며, 골반포 낭포제3,4 및 50 %-60 %에서 60 %를차지합니다5. 이는, 어느 정도, 체외 수정 (IVF) 치료의 임신 율을 개선에 병목 현상에 기여하고있다, 이는 약에서 유지하고있다35%-40% 6,7. 그러므로, 전송을 위한 euploid 태아를 선택하는 것은 임신 결과 향상을 위해 유익할 것으로 믿어집니다. 이를 위해, 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 유전 적 접근을 사용하여 배아 생존가능성을 조사하기 위해 추가로 개발되었다. PGT-A의 중요한 역할을 지원하는 무작위 통제 실험 및 코호트 연구의 수가 증가하고 있습니다. PGT-A의 적용은 유산율을 감소시키고 임상 임신율과 이식율 8,진행 중인 임신율 및 출산율9를증가시키는 것으로 입증되었다.
역사적으로, PGT-A에서 다양한 방법이 적용되어 왔으며, 이러한 경우 형광은 체자형화(FISH), 비교 게놈 혼성화(CGH), 어레이-CGH, 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)-마이크로어레이이다. 이전 연구는 물고기에 의한 분열 단계 배아에 대한 PGT-A가 59273array-CGH 또는 를 사용하여 해당 배반포의 포괄적 인 염색체 스크리닝 (CCS)에 의해 얻은 것과 제대로 일치하지 않는 결과를 산출한다는 것을 나타났습니다. SNP-마이크로어레이5927310. 이러한 불일치는 개발11동안 염색체 분리 오차의 염색체 모자이크, FISH 기술 적 유물 또는 배아 자기 교정에 기인할 수 있다. 어레이-CGH 또는 SNP-마이크로어레이와 같은 어레이 기반 PGT-A에 대한 배반포 트로프토더(TE) 생검을 사용하는 것이 배아10,12에서염색체 불균형을 식별하는 데 효과적이라는 것이 널리 인식되고 있다. 최근, 단세포 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근법을 제공하며 PGT-A13,14,15에서임상 적 적용성을 보이고 있으며, 이는 현재 사용 가능한 방법에 대한 유망한 대안.
여기에서, 우리는 인간 배아에서 이수성의 검열을 위한 빠르고, 견고하고, 저가의 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시합니다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 단일 세포 WGA 키트를 사용한 다음 시퀀싱 라이브러리를 시빙하고 반도체 시퀀싱 시스템에서 후속 시퀀싱을 수행합니다.
DNA 가닥 합성 시 각 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 혼입에서 방출되는 H+ 이온을 검출함으로써, 시스템은 반도체 소자로부터 포착된 화학적 신호(pH 변화)를 디지털 데이터를 직접 전달한다. , 이는 DNA 서열 정보로 더 해석된다. 고가의 광학 검출 및 복잡한 시퀀싱 반응에 대한 요구 사항을 제거한 이 간단한 시퀀싱 화학은 총 시약 비용을 줄이고 시퀀싱 실행 시간을 2-4시간16시간으로단축합니다. 더 중요한 것은 제조업체의 성능 사양에 따라 반도체 시퀀싱 플랫폼은 실행당 최대 15GB 의 시퀀싱 데이터(라이브러리 품질에 따라 다름)를 생성할 수 있으며, 이는 다른 시퀀서보다 훨씬 높다는 것입니다. 약 3-4GB 데이터(2 x 75bp 읽기 길이)만 생성합니다17. PGT-A의 임상 적용에서 이 플랫폼은 칩당 24개의 샘플을 생성하여 최대 8,000만 개의 읽기17개 및 각 샘플의 최소 100만 개의 고유 판독을 달성할 수 있습니다. 판독 깊이는 각 샘플이 적어도 0.05x 전체 게놈 커버리지를 가지고 있는지 확인할 수 있습니다. 이 플랫폼의 위의 장점은 이상적인 스크리닝 방법을 만들어 PGT-A18의광범위한 응용 프로그램을 용이하게합니다.

<table><tbody><tr><td>PCR 튜브, 0.2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, Ca2+ 및 Mg2+ free</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M NaOH (1.0N) 용액</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S2567</td><td>멜트오프 용액용. 분자 등급</td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ELGA PURELAB Flex 3 정수 시스템 또는 등가 18 M&Omega; 정제수 시스템</td><td>ThermoFisher</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 증폭 버퍼</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 증폭 효소</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Ion OneTouch 증폭 플레이트</td><td></td><td></td><td>키트 : Ion OneTouch 2 소모품 (부품 번호 A26367). 시트의 확장 키트 구성 요소 5</td></tr><tr><td>Ion PI Annealing Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyOne Beads Capture Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 기기</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)</td><td></td><td></td><td>키트: Ion PI Hi? Q OT2 솔루션 200(부품 번호 A26429). 시트 5의 확장 키트 구성 요소</td></tr><tr><td>: Dynabeads MyOne, Streptavidin C1</td>, <td>ThermoFisher</td><td>65001</td><td></td></tr>, <tr><td>PicoPLEX WGA 세포 추출 버퍼</td><td>, Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-00으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 세포 추출 효소</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Ion PI Chip Kit v3</td><td>ThermoFisher</td><td>A26771</td><td></td></tr><tr><td>이온 칩 미니fuge, 230 V</td><td>ThermoFisher</td><td>4479673</td><td></td></tr><tr><td>이온 PI dATP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>이온 PI dCTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>이온 PI dGTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>이온 플러스 단편 라이브러리 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ThermoQ</td><td></td>&ndash 4471252 <td></td><td>Ion Plus Fragment 라이브러리 키트</td></tr><tr><td>; 온도 건조 수조</td><td>TAMAR</td><td>HB-T2-A</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dTTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 2 Instrument</td><td>ThermoFisher</td><td>INS1005527</td><td>ThermoFisher 카탈로그 번호: 4474778.</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 라이브러리 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion One Touch ES</td><td>ThermoFisher</td><td>8441-22</td><td>ThermoFisher 카탈로그 번호: 4469495. 시트 5 에탄올의 확장 키트 구성 요소</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>51976</td><td>이것은 모든 브랜드의 분자 등급 절대 에탄올로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 추출 효소 희석 완충액</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-01로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 추출 효소 희석 완충액</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-02로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광측정기</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td>이 모델은 Qubit 4 형광측정기(카탈로그 번호: Q33226)로 대체되었습니다.</td></tr><tr><td>Qubit ds DNA HS 어세이 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>M2002-02</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>이온 PI 발포 용액</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>라이브러리 바코드 색인</td><td>BaseCare</td><td></td><td>는 사내에서 준비한 색인입니다. 사용자는 ThermoFisher Ion Xpress 바코드 어댑터 키트(Cat. 번호 4474517)</td></tr><tr><td>Ion PI loading buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>4389764</td><td></td></tr><tr><td>Agencour AMPure XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet (magnetic rack)</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td><td>Micro 17</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 뉴클레아제가 없는 정제수</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템(카탈로그 번호: PR-40-415101-03)으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>이온 OneTouch 오일 병</td><td></td><td></td><td>이온 PI 안녕? Q OT2 솔루션 200(부품 번호 A26429). Sheet 5</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>의 확장 키트 <td>구성 요소 ThermoFisher 4471252</td><td></td> Sheet 3 double-strand DNA standard <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 의 확장 키트 구성 요소 <td>라이브러리 정량화 전에 Qubit을 보정하기 위해 자체에서 준비한 DNA 표준물질입니다.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 사전 증폭 버퍼</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템(카탈로그 번호: PR-40-415101-03)으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 사전 증폭 효소</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>라이브러리 증폭 프라이머 믹스</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>시트 3의 확장 키트 구성 요소</td></tr><tr><td>이온 OneTouch 반응 필터</td><td></td><td></td><td>시트 5의 확장 키트 구성 요소 복구</td></tr><tr><td>라우터</td><td></td><td></td><td>시트 5의 확장 키트 구성 요소</td></tr> 복구 <tr><td>튜브</td><td></td><td></td><td>시트 5의 확장 키트 구성 요소</td></tr><tr><td>ISP Resuspension 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이온 양성자</td><td>ThermoFisher</td><td>DA8600</td><td>이 모델은 ThermoFisher에서 Sun Yat-Sen University의 Da An Gene Co., LTD.에서 수입했으며 임상 적용을 위해 중국 식품의약국의 인증을 받았습니다. ThermoFisher의 카탈로그 번호는 4476610입니다.</td></tr><tr><td>이온 파이 안녕하세요? Q 염기서열분석 중합효소</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 염기서열분석 프라이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>서버</td><td>Lenovo</td><td>T260</td><td></td></tr><tr><td>이온 PI 구 입자</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 PCR SuperMix 고충실도</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 25mm 주사기 필터</td><td>ThermoFisher</td><td>724-2045</td><td>기공 크기 : 0.45&m. 특히 수성 유체 용.</td></tr><tr><td>이온 파이 안녕하세요? Q: W2 솔루션</td>, <td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr>, <tr><td>이온 PI 1X, W3 솔루션</td><td>, ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>이온 OneTouch 세척 솔루션, C1</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>The Ion PGM, Hi? Q 보기 염기서열분석 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>A30044</td><td>시트 2</td></tr><tr><td>이온 플러스 단편 라이브러리 키트</td>의 확장 키트 <td>구성 요소 ThermoFisher</td><td>4471252</td> 시트 3 Ion PI Hi-Q 염기서열분석 200 키트의 <td>확장 키트 구성 요소</td></tr><tr><td>(초기화당 1개의 염기서열분석 실행)</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td>시트 4</td></tr><tr><td>Ion PI Hi? Q OT2 200 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>A26434</td><td>확장 키트 구성 요소(시트 5)</td></tr></tbody></table>

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

염색체 이수성, 배아 발달 체포, 이식 실패, 또는 임신 손실로 이끌어 내는 주요 원인의 한개는, 인간 적인 태아에서 잘 문서화되었습니다. 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 배아의 염색체 이상을 검출하여 생식 결과를 크게 향상시키는 유전자 검사입니다. 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근 방식을 제공하며 PGT-A에서 임상 적용가능성을 보여주었습니다. 여기서, 우리는 배아에서 이수성 의 스크리닝을 위한 신속하고 저비용 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시한다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 그 다음에는 시퀀싱 라이브러리의 시딩 및 반도체 시퀀싱 시스템의 후속 시퀀싱이 뒤따릅니다. 일반적으로 PGT-A 애플리케이션의 경우 각 칩에 24개의 샘플을 로드하고 시퀀싱하여 150개의 기본 쌍의 평균 판독 길이에서 60-8000만 개의 판독을 생성할 수 있습니다. 이 방법은 시퀀싱 라이브러리의 템플릿 증폭 및 보강을 수행하기 위한 정교한 프로토콜을 제공하여 PGT-A 감지를 재현 가능, 높은 처리량, 비용 효율적이고 시간 절약으로 만듭니다. 이 반도체 시퀀서의 실행 시간은 2-4 시간이며 샘플 수신에서 보고서 발행까지 소요 시간이 5 일로 단축됩니다. 이 모든 이점은 이 분석법을 배아에서 염색체 이수성을 검출하고, 따라서 PGT-A에 있는 그것의 넓은 응용을 촉진하는 이상적인 방법합니다.

이 수정된 프로토콜에 기초하여, 반도체 염기서열 분석 플랫폼은 처음으로 PGT-A에 적용되었다. 우리는 분열 단계 배반및 배반포 단계 태아 둘 다에서 생검에 시험했습니다. 생검 된 세포는 DNA의 저하를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 WGA를 겪는 것이 좋습니다. 이전 연구는 상이한 WGA 방법의 성능을 비교하고 우리가 여기서 설명한 방법은 100 KB20의빈 크기에서 최고의 균일성을 가졌다는 것을 나타냈다. 균일성과 중앙값 절대 쌍차이(MAPD)21의성능을 고려하여, 이 WGA 방법은 반도체 시퀀서를 사용하여 PGT-A에 대해 선택되었다. 186개의 분열 단계 및 1135개의 배반포 단계 배아에 대한 회고적 통계 분석을 통해, 우리는 WGA 성공률이 블라스토미어 샘플에서 95.4%,배반포시스트 샘플에서 96.9%였다는 것을 관찰하였...

여기서는 짧은 처리 시간, 낮은 비용 및 높은 처리량의 장점을 가진 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 염기서열 분석 방법을 소개합니다.

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

우리가 여기에서 제시하는 프로토콜은 배아에 있는 무분비의 검열을 위한 신속하고 저가적인 반도체, 시퀀싱 기지를 둔 방법입니다. 템플릿 증폭을 수행하기 위한 정제 프로토콜과 시퀀싱 라이브러리의 배열로 인해 PGTA 감지를 재현가능하고 높은 처리량, 비용 효율적이고 시간 절약할 수 있습니다. 이 반도체 시퀀서의 런타임은 2~4시간밖에 되지 않습니다.샘플 수신에서 보고서 발급까지 소요 시간을 5일로 단축합니다. 이 방법은 무분비 선별, 복사 번호 변형 및 단일 뉴클레오티드 다형성 호출을 위한 게놈 시퀀싱을 제공한다. 다른 시퀀싱 화학으로 인해 이 프로토콜에 의해 준비된 라이브러리는 다른 시퀀싱 시스템에서 직접 시퀀싱할 수 없습니다.그러나 동일한 시퀀서이지만 다른 라이브러리 준비는 비침습적 산전 검사를 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 샹춘 궈 (Xiangchun Guo)가 될 것입니다. 시퀀싱을 시작하려면 각 라이브러리를 희석하고 매번 3초 동안 미니 원심분리기에서 4회 회전합니다.그런 다음 각 라이브러리의 5 개의 마이크로 리터를 가져 가서 핵이없는 1 점 5 밀리리터 튜브로 풀을 짜십시오. 혼합 된 라이브러리를 소용돌이하고 3 초 동안 미니 원심 분리기를 잠시 회전시합니다. 두 개의 새로운 복구 튜브에 150 마이크로리터를 브레이킹 솔루션에 추가합니다.새로운 복구 튜브, 복구 라우터 및 증폭 플레이트를 설치합니다. 오일 병을 세 번 반전시켜 섞는다. 오일 및 복구 솔루션이 모두 3분의 2 이상 가득 차 있는지 확인합니다.마스터 믹스 PCR 버퍼를 30초 동안 소용돌이쳐 미니 원심분리기에서 3초 간 간략하게 회전합니다. 구 입자와 혼합 라이브러리를 1분 동안 소용돌이쳐 미니 원심분리기에서 3초 간 간략하게 회전합니다. 다음으로, 2400 마이크로리터 결찰 믹스를 준비하여, 뉴클레아제 없는 물 172마이크로리터, 혼합 라이브러리의 8마이크로리터, 효소 믹스의 120마이크로리터, 구입자의 100마이크로리터를 마스터 믹스 PCR 버퍼의 2000 마이크로리터를 함유하는 튜브에 첨가하여 제조한다.파이펫을 800 마이크로리터로 설정하고 샘플 포트를 통해 반응 필터에 계합 믹스를 로드합니다. 오일 병을 세 번 반전시키고 P1000 파이펫을 사용하여 반응 필터에 반응 오일의 200 마이크로리터를 추가합니다. 프로그램 Proton을 선택한 다음 보조 버튼을 선택하여 모니터의 지침을 따라 장치가 올바르게 설정되었는지 확인합니다.그런 다음 다음을 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 에멀젼 PCR 제품 샘플 100마이크로리터, 세척된 구슬 130마이크로리터, ES 세척 용액 300마이크로리터, 용융용 300마이크로리터를 8개의 튜브 스트립에 적재한다. 8개의 튜브 스트립을 농축 시스템에 배치합니다.파이펫 팁과 새로운 제로 포인트 2 밀리 리터 튜브를 설치하고 프로그램을 시작합니다. 원심 분리는 5 분 동안 15, 500 배 G에서 제로 포인트 2 밀리리터 튜브. 상체를 버리고 농축 제품의 10 마이크로리터를 유지하십시오.200 마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 튜브에 넣고 소용돌이에 섞습니다. 원심 분리제로 2 밀리리터 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 농축 제품의 10 마이크로 리터를 유지하십시오.90 마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 튜브에 넣고 소용돌이에 섞습니다. 템플릿을 준비하려면 양수 컨트롤을 소용돌이쳐 간략하게 회전합니다. 농축 제품의 100 마이크로리터에 양수 제어의 5 마이크로리터를 추가합니다.소용돌이와 원심분리기는 15, 500배 G로 5분간. 상체를 버리고 템플릿의 마이크로리터 10을 유지합니다. 다음으로, 시퀀싱 프라이머의 마이크로리터 20개, 어닐링 버퍼 15마이크로리터를 템플릿 튜브에 추가합니다.튜브를 소용돌이쳐 미니 원심분리기에서 3초 간 간단히 회전합니다. 가열 된 뚜껑열 사이클러에 튜브를 배양. 그런 다음 튜브에 로딩 버퍼의 마이크로리터 10을 추가합니다.위아래로 파이프를 통해 섞는다. 시료 55마이크로리터를 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 샘플을 칩의 하중 우물에 로드합니다. 사용된 파이펫 팁과 제로 포인트 2 밀리리터 PCR 튜브를 유지합니다.일부 샘플이 칩에 들어갈 때 칩을 칩 미니 원심분리기에 놓습니다. 위치를 확인하고 칩을 원심분리기를 10분 동안 확인합니다. 500 마이크로리터의 아닐링 버퍼와 500마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터를 1점 5밀리리터 튜브에 추가하여 50% 아닐링 버퍼를 준비합니다.1점 5밀리리터 튜브에 100%2프로판올의 500마이크로리터와 500마이크로리터를 추가하여 플러싱 솔루션을 준비합니다. 이어서, 발포 혼합물을 준비하여, 50%의 안어 버퍼의 49마이크로리터와 발포용액 1개를 2개의 새로운 1점 5밀리리터 튜브에 첨가하였다. 파이펫 공기는 발포 혼합물 중 하나에 공기를 넣고, 거품의 120 마이크로리터를 하중에 잘 적재합니다.출구에서 잘 배출된 액체를 잘 로딩으로 옮기고 칩 미니 원심분리기에서 30초 동안 칩을 원심분리합니다. 제2 발포 혼합물에 대한 과정을 반복합니다. 50% 아닐링 버퍼55마이크로리터를 제로포인트 2밀리리터 튜브에 넣습니다.유지 된 파이펫 팁을 사용하여 위아래로 파이펫을 사용합니다. 어닐링 버퍼의 55마이크로리터를 모두 적재에 잘 로드합니다. 지정된 칩 미니 원심분리기에서 칩을 30초 동안 원심분리합니다.플러싱 용액 100마이크로리터를 칩 로딩에 잘 적재하고 출구에서 배출된 액체를 잘 폐기합니다. 이 로딩 단계를 한 번 반복합니다. 50% 아닐링 버퍼의 100 마이크로리터를 칩 로딩에 잘 넣습니다.총 세 번이 로드 단계를 반복합니다. 50% 아닐링 버퍼60 마이크로리터와 시퀀싱 효소 6개를 새로운 1점 5밀리리터 튜브에 넣습니다. 위아래로 파이프를 통해 섞는다.이 혼합 용액의 65 마이크로리터를 칩 로딩에 천천히 파이펫하여 거품을 피합니다. 칩을 빛으로부터 멀리 하고 실온에서 5분간 배양하십시오. 마지막으로 인큐베이션 후 칩을 시퀀서에 즉시 로드하고 화면에서 시퀀싱 실행 시작을 클릭하여 시퀀싱을 시작합니다.186개의 분열 단계와 1135개의 배반성 단계 배아에 대한 회고적 통계 분석은 두 가지 유형의 샘플모두에서 95% WGA 성공률이상을 초래했습니다. 시퀀싱 품질 관리 실패율은 분열 단계 그룹에서 3.4%, 배반구 단계 그룹에서는 1.9%에 불과했습니다. 분석 외에도 시퀀싱 데이터는 다른 분석에 사용할 수 있습니다.예를 들어, 시퀀싱 깊이 및 품질에 따라 5메가베이스 미만의 크기 또는 mycondrial DNA 분석을 가진 숫자 변형을 복사합니다. 복사 번호 호출의 개선으로, 연구원은 인간 초기 단계 배아에 있는 염색체 모자이즘의 미래를 더 조사할 수 있습니다.

semiconductor-sequencing-for-preimplantation-genetic-testing-for

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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사전 이식 유전자 진단 생선

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