Name: 체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 체외 공배양을 통한 CAR T 세포 반복 종양 도전 평가법으로 교아세포종에 대한 면역항암 효능을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 고효율 스크리닝과 임상 적용 가능성을 제공합니다.

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이 작품은 캘리포니아 연구소의 재생 의학 (CIRM) 부여 TR3 05641 및 NIH 교부 P30 CA33572 (코어)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. D.W.는 NCI 친목 1F99CA234923-01에 의해 지원 됩니다.

우리의 IRB는이 프로토콜의 검토를 요구 하지 않는다. 시의 희망 병 리 학과에서 코딩은 폐기 신선한 세포종 종양 샘플을 접수 하 고 우리 연구소는 키에 액세스할 수 없습니다. 우리는 식별 데이터가 없는 생/절제의 시간에서 이전 치료 및 질병 상태에만 데이터를 견본을 받을.
1. 미디어 준비
<ol><li>GBM 셀 선 주 배양 신경 줄기 세포 미디어 준비: DMEM:F12, 1시 50분 B27, 5 µ g/mL 헤 파 린, 그리고 2 mmol/L L-글루타민; 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)와 20 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 일주일에 두 번 보충 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>T 세포 미디어 준비: X-VIVO 15 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS);을 포함 하 ( 재료의 표참조) 모든 48 h 70 IU/mL rhIL 2와 0.5 ng/mL rhIL-15 보충.</li>
	<li>공동 배양을 준비: EGF와 FGF 보충 없이 신경 줄기 세포 미디어 고 10 %FCS 추가.</li>
	<li>FACS 얼룩이 솔루션 (FSS) 준비: HBSS, 2 %FCS 할머니3 (0.5 g/500 mL).</li>
</ol>2입니다. 준비 GBM 종양 세포의
<ol><li>4 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리에 의해 낮은 통로 GBM 종양 분야 (TSs)을 수확 하 고 상쾌한 삭제. 참고: GBM 종양 분야 (TSs)에서 생성 됩니다22,,2324, 위에서 설명한 대로 종양을 절제 하 고 37 ° c.에 5% CO2 인큐베이터에서 신경 줄기 세포 미디어에서 유지</li>
	<li>37 ° C 물 욕조에 미리 따뜻한 공동 문화 미디어.</li>
	<li>GBM TSs에 찬 accutase의 1 mL을 추가 하 고 30-60 s pipetting으로 TSs 해리 따뜻한 공동 문화 미디어의 5 mL을 추가 하 여 분리를 중지. 참고: GBM TSs는 5 분 이상에 대 한 accutase에 보관해 서는 한다.</li>
	<li>4 분의 300 x g 에서 원심 분리에 의해 GBM 세포를 수확, 상쾌한, 삭제 하 고 셀 공동 문화 미디어의 2 mL에 resuspend.</li>
	<li>세포 생존 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다. 참고: 세포 생존 능력 있어야 > 70%.</li>
</ol>3입니다. 자동차 T 세포의 준비
<ol><li>분석 결과, 전에 24 시간 미만 흐름 cytometry 튜브로 경작된 차 T 세포의 100 µ L 고 금감원의 2 개 mL를 추가. 참고: 자동차 T 세포11,21 위에서 설명한 대로 생성 되었고 T 셀 미디어에서 경작.</li>
	<li>4 분 및 폐기 상쾌한 300 x g 에서 원심 분리.</li>
	<li>셀, 4 분, 300 x g 에서 원심 분리기를 씻어 FSS의 2 개 mL를 추가 하 고 상쾌한 삭제.</li>
	<li>30 분 동안 4 ° C에서 자동차 식을 나타내는 적절 한 항 체와 세포 얼룩. 참고: 예를 들어 설명 하는 IL13Rα2 대상 자동차 이전25 사용 됩니다, 그리고 안티-IL13 항 체와 함께 다음 얼룩이.</li>
	<li>FSS의 2 mL로 두 번 세척 하 고 자동차 exn 교류 cytometer를 사용 하 여 분석.</li>
	<li>그림 1B제어 전략을 사용 하 여 T 세포에 차 %를 결정 합니다.</li>
	<li>공동 문화 일에 4 분의 300 x g 에서 원심 분리 하 여 모든 자동차 T 세포를 수확 하 고 상쾌한, 폐기 공동 문화 미디어의 2 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>세포 생존 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다. 참고: 세포 생존 능력 있어야 > 70%.</li>
</ol>4. 종양 설정-T 세포 공동 문화
<ol><li>종양 세포 공동 문화 미디어 0.16 백만/mL의 농도를 희석.</li>
	<li>자동차 T 세포 공동 문화 미디어와 0.04 백만 자동차+ 셀/mL의 농도를 희석 자동차 %에 따라 달라 집니다. 참고: 예를 들어 자동차 50% 이며 T 세포 농도 0.4 백만/mL, 경우 0.04 백만 자동차+ 셀/mL의 최종 농도를 1:5 희석을 확인 합니다.</li>
	<li>-바닥이 96-잘 빠진 조직 배양 플레이트의 각 음에 희석된 종양 세포의 100 µ L를 플라스틱.</li>
	<li>에 있는 종양 세포와 혼합 잘 각 잘 희석된 차 T 세포의 100 µ L를 플라스틱. 참고: 각 종양 T 셀 공동 문화 4 시간 지점에서 분석 될 것 이다. 때마다 다른 분석을 기반으로 포인트 4-6 복제에서 필요할 수도 있지만 < 시간 포인트 당 3 복제 권장 되지 않습니다; 대표 platemap 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 접시를 유지 합니다.</li>
</ol>5. 종양 세포 Rechallenge
참고: Rechallenge 2, 4, 6 일 게시물 초기 공동 문화 설치 (그림 1A)에서 일어난다.
<ol><li>수확 하 고 (단계 2.1 2.6) 위에서 설명한 대로 GBM TSs 해리.</li>
	<li>GBM 0.64 백만/mL의 농도에서 세포 resuspend</li>
	<li>Rechallenge 필요 공동 문화 우물을 확인 (하십시오 표 1참조) 각 우물의 상단에서 50 µ L 미디어를 조심 스럽게 제거 하 고.</li>
	<li>각 우물에 GBM 세포 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 잘, 다음 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 넣어.</li>
</ol>6. 수확 샘플 및 Cytometric 분석 흐름
참고: 샘플은 각각 종양 도전의 초기 공동 문화 설치 1, 2, 3, 4 라운드는 1, 3, 5, 7 일 게시물에서 수확 될 것입니다.
<ol><li>37 ° C waterbath에 미리 따뜻한 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션.</li>
	<li>수확을 해야 하 고 새로운 라운드 아래 96 잘 접시로 미디어를 전송 하는 우물을 결정 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 37 ° C에서 남아 있는 종양 세포를 소화 하기 위해 우물에 트립 신-EDTA의 50 µ L 플라스틱.</li>
	<li>현미경으로, 세포는 바닥에서 분리 확인 합니다.</li>
	<li>분리 된 셀, resuspend 다음 전송 트립 신-EDTA 라운드 아래 96 잘 접시의 해당 우물을 분리 된 셀을 포함 하는 잘 바닥 주위 플라스틱.</li>
	<li>분리기 300 x g, 4 분, 4 ° C에서 라운드-아래 96 잘 접시 다음 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>셀, 300 x g에서 원심 분리기, 4 분, 4 ° C에 세척 하는 FSS의 200 µ L/잘 추가 후 상쾌한 삭제.</li>
	<li>Resuspend 세포 100 µ L/잘 FSS 포함 항 체 ( 재료의 표참조), 그리고 30 분 동안 4 ° C에서 얼룩 세포.</li>
	<li>셀에 100 µ L/잘 FSS를 추가, 삭제 상쾌한 다음 300 x g, 4 분, 4 ° C에서 원심.</li>
	<li>셀, 300 x g에서 원심 분리기, 4 분, 4 ° C에 세척 하는 FSS의 200 µ L/잘 추가 후 상쾌한 삭제.</li>
	<li>Resuspend 100-200 µ L/잘 500 ng/mL DAPI와 금감원의 셀 다음 cytometry에 의해 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>7. 기능 및 자동차 T 세포의 중독 Otypic 분석
<ol><li>교류 cytometer에서 데이터 파일을 검색 하 고 모든 라이브 (DAPI-) 세포 (그림 1C) 게이트.</li>
	<li>종양 세포는 CD45 게이팅 하 여 계량- 인구와 자동차 T 세포는 CD45 게이팅 하 여+, 자동차 + 인구 (그림 1C). 참고: 종양 세포 CD45 표현 하는 경우 (예: 들의 삶 문의 림프 세포), 안티-CD3 얼룩 종양 세포에서 T 세포를 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>종양 세포와 시간 코스를 통해 자동차 T 휴대폰 번호 플롯.</li>
	<li>4-1BB와 CD69 공동 식으로 T 세포 활성화를 확인 합니다. 참고: 이러한 표면 마커는 T 세포 활성화 6-24 h 게시물 초기 공동 문화 분석을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>PD-1, 지연-3 팀-3의 식에 의해 T 세포 소모를 식별 합니다.</li>
	<li>CD45RO CD62L의 식으로 T는 세포 메모리 상태를 확인 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
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<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li>
<li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Therapeutic+T+Cells%3A+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li>
<li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li>
<li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li>
<li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA%2B+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764(2018).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths+to+stemness%3A+building+the+ultimate+antitumour+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li>
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</ol>

이 작업에 설명 된 자동차 구조는 머스탱 바이오.에 의해 허가 되었습니다 Inc.는 S.J.F. 및 C.E.B. 로열티 지급 받을. 다른 작가 모든 관심의 잠재적인 충돌을 선언합니다.

이 반복적인 종양 세포 도전 분석 결과 자동차 T 세포 기능 힘, 생체 조건 종양 모델와 관련 된 높은 종양 부담이 생체 외에서 설치를 사용 하 여 평가에 대 한 편리한 접근을 제공 합니다. 두 일 분석 결과 중 차 T 세포 종양 도전 (초기 공동 문화 및 3 x rechallenge)의 4 라운드를 받 다 지쳐 T 세포 강력한 초기 대응에도 불구 하 고 종양도 전에 대응 하는 그들의 기능을 잃을 수 있습니다 환경. 종양 세포 제거 및 자동차 T 셀 확장 대표이 분석 결과에서 취득 될 수 있다 T 세포 활성화를 나타내는 표면 또는 세포내 마커 얼룩에 의해 자동차 T 세포의 고기를 쉽게 분석할 수 있는 동안 두 기본 정보 피로 또는 메모리입니다. 이 분석 결과 또한 바이어스 비 분석 자동차 T 세포 transcriptome, 프로테옴 또는 형광체 프로테옴21,26및 임상 응답27을 예측 하기 위해 채택 된 T 세포 polyfunctionality와 결합 하 여 편리 하다. 또한, 종양 세포 cytokine 분 비28같은 T 세포 면역에 대 한 그들의 적응 응답도 테스트할 수 있습니다. 예제는 여러 시간 지점에서 수확 하 고, 이후이 분석 결과 수 있습니다 정적, 뿐만 아니라 자동차 T 셀 동작의 동적 분석에 대 한 종양 세포의 과잉 수 응답.
분석 결과 비교 이펙터 힘 차 T 세포 같은 항을 대상으로 하지만 다른 디자인 및 제조 공정에 특히 강력 하다. 우리는 CD4 식별 하이 분석 결과 사용+ 차 T 세포 CD8 보다 우수한 장기 effector 기능을 중재할 수 있었다+ 세포21. 그것은 또한 그 vivo에서 차 효능 더 생체 외에서 자동차 T 셀 평가 대 한 반복적인 종양 도전 사용의 필요성을 강조,이 분석 결과 중 나중 시간 포인트 (D5-D7)에서 세포 독성을 연관 했다 표시 했다. GBM 셀은 대상 셀 여기의 예제로 사용 했다,이 분석 결과 다른 T 세포 종양 조합에 쉽게 채택 될 수 있었다. 특히, 자동차 T 셀 동작 또한 다른 항 원 밀도 및 엔지니어링 암 세포 타겟된 항 차 인식29시 순차 분자 이벤트를 조사 하는 도구를 제공의 다양 한 레벨을 표현 하 게 달라질 수 있습니다. 따라서,이 분석 결과 다른 대상에 대 한 특정 차 T 세포의 활성화 패턴을 검사 하 또한 악용 될 수 있습니다.
대상 세포 생존 능력 및 자동차 T 셀 확장이 분석이 결과의 두 가지 선행 정보 때문에, 그것은 중요 한 모든 공동 문화 가능한로 시작 (> 70%) 종양 그리고 T 세포입니다. Rechallenge 프로세스를 수행할 때 종양과 T 셀 셀의 불필요 한 변이 소개 하기 위하여 우물의 바닥에 있는 발음 미디어 (5.3 단계)의 작업 방해 한다. 정지 대상 셀 라인에서이 분석 결과 수행할 때 종양 세포 rechallenge 전에 원심 분리 하 여 남아 있는 세포를 수확 하 좋습니다.
이 분석 결과의 한 가지 한계는 설치 매개 변수 (초기 공동 문화 및 rechallenge E:T 비율) 해야 한다는 조정 될 다른 자동차 종양 조합에 따라. 예를 들어 종양 세포 면역 억제 분자 (예: PD-L1)의 상당한 수준, 표현 하는 경우 더 높은 E:T 비율 권장 주어진 전체 효율을 죽이 장애인 PD-L1-낮은 종양 세포와 비교. 새로운 자동차-종양 조합에 분석 결과 적용 하기 전에 파일럿 연구 것이 좋습니다 최적의 조건을 결정 하는 일반적으로 제거를 분석 결과에서 테스트 하는 가장 강력한 자동차 T 세포 수 > 끝점에서 종양 세포의 80%. 종양 세포 형광 표시 된 경우 직접 셀 접촉 자동차 살해 T 세포 중재를 위해 필요 하다, 이후 다음 흐름 cytometric 분석의 패널을 조정 해야 따라 (예: 종양 세포 GFP 표시, 다음 어떤 FITC 활용 된 경우 항 체 해야 사용할 수 없습니다).
자동차 T 세포 B 세포 악성 종양에 대 한의 임상 활동 두 FDA의 승인을 마약을 주도하 고 있다. 그러나, 응답 다른 환자27,,3031, 자동차 제품30의 phenotypic 속성와 상관 관계를 해명 했다에서 상당한 변화를 보이고 있다. 이 생체 외에서 반복적인 종양 도전 분석 결과 추가 phenotypic characterizations 및 polyfunctionality cytokine 생산, 자동차 이펙터 힘 기능 테스트에 대 한 접근을 제공 하 고의 높은 처리량 검열에 대 한 있습니다. 예측 정확도 유지 하면서 생체 조건 종양 모델에 비해 임상 제품. 전반적으로,이 분석 결과 자동차 T 셀 디자인, 전 임상 및 임상 개발에 대 한 T 세포 기능 테스트 사용 될 수 있습니다.

Immunotherapy 공상 항 원 수용 체 (자동차)를 사용 하 여-설계 된 T 세포 B 세포 악성 종양1,2,3,4, 동안 다른 종양을 표적으로 하기의 가능성에 대 한 유망한 결과 본 엄격한 조사가5,,67되 고 있습니다. 큰 진전이 자동차 구조, 제조 공정 및 환자 사전 주입 식이요법6,7,8, 최적화 및 새로운 합성 생물학 접근 증가 것으로 예상 된다 그들의 지 속성, 안전 및 종양 특이성9,10. 그러나, 그것은 어렵고 적절 하 게 임상 번역에 대 한 최선의 선택 가이드 위해 자동차 T 세포의 치료 잠재력을 평가 하기 위해 노동 집약 되었습니다. 가장 설립 된 모델까지 차 T 세포의 기능을 평가 하는 인간의 종양 xenografts, 그것에 의하여 차 T 세포 antitumor 효능에 대 한 검사 하 고 적정 한 셀 복용량11,12 에 비해 베어링 immunodeficient 마우스에 , 13 , 14 , 15. 이러한 생체 조건 murine 연구는 노동 집약 하 고 시간이 걸리는, 많은 수의 매개 변수를 검사 하는 경우에 특히. 더, vivo에서 학문 마우스 긴장과 동물 시설, 동물 처리 기술에의 접근에 의해 제 지 될 수 있습니다. 따라서,이 T 세포의 생체 조건 antitumor 기능 또한 충실 하 게 반영 하는 이펙터 활동의 빠른 정보에 대 한 허용 더 편리 생체 외 분석 실험을 개발할 필요가 있다.
생체 외에서 T 세포의 세포 독성을 결정 하기 위해 기존의 방법 degranulation, cytokine 생산 및 방사성 표시 대상 셀 (즉,: 크롬 방출 분석 실험) lyse 수의 탐지에 집중 했다. 이러한 분석 실험 차 T 세포 특이성 및 리디렉션된 대상 인식에 대 한 유익 하지 않습니다, 그들은 종종 조작된 T 세포12,,1316의 vivo에서 antitumor 잠재력을 반영 하지. 경우에 따라 체 외에서 단기 분석 실험에서 활동 죽이 보였다 vivo에서 antitumor 기능16역 상관 관계. 이러한 불일치 가능성이 높은 이펙터: 대상 (E:T) 비율 경향이 피로17차 T 셀 제품을 차별화 하는 데 이러한 생체 외 분석 실험에 따라서 무 능력 사용의 결과 이다. 대조적으로, vivo에서 종양 퇴치 T 동안 세포 일반적으로 응답 함으로써 사망 하 고 이후 운전 T 세포 감 별 법 및 고갈18,19, 의 여러 라운드를 요구 하는 큰 종양 부담에 대 한 20, 자동차 t 효과적인 종양 클리어런스에 대 한 주요 장벽 중 하나는 세포12,13. 한편, 대부분 단기 생체 외에서 살인 분석 실험도 할 T 세포 증식에 판독 차이 하지 반면 차 T 세포 치료 환자에서 차 T 세포 확장에 대 한 능력은 강하게 연관 임상 응답4. 따라서, 적절 한 체 외 분석 결과 높은 종양 부담, T 세포 소모의 유도의 상태를 정리 해야 하 고 T 세포 확장의 판독에 대 한 있습니다.
여기는 간단한 체 외 공동 문화 분석 결과와 잠재력을 죽이 반복적인 종양에 대 한 자동차 T 세포를 평가 하는 전략에 설명 합니다. 다른 T 세포 효과 기 활동 매개 변수 수 수 동시에, 시험 대상 셀 살인, 자동차 T 셀 확장 및 메모리 관련 또는 소모 된 고기를 포함 하 여. 이 분석 결과에서 생성 된 결과 자동차 T 세포의 생체 조건 antitumor 효력으로 잘 연결 하 고 자동차 T 셀 제품의 효능을 평가 하기 위해 악용 될 수 있습니다. IL13Ra2 대상 자동차 T 세포 주 GBM 라인21에 대 한 평가 분석 결과, 설명 하는 동안 어떤 자동차 T 셀 플랫폼에 쉽게 적응 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS의 0.05% 트립신/0.53mM</td><td>EDTA Corning</td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-글루타민</td><td>Cambrex Bio Science</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 이염산염(DAPI) - FluoroPure grade</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>혁신적인 세포 기술</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td><td>Novartis Oncology</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD137, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>Anti-CD19, PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>Anti-CD3, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>Anti-CD4, FITC</td><td>BD 생명과학</td><td>340133</td><td>SK3</td></tr><tr><td>Anti-CD45, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>Anti-CD45RO, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>Anti-CD62L, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>Anti-CD69, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340560</td><td>L78</td></tr><tr><td>Anti-CD8, APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>348793</td><td>SK1</td></tr><tr><td>Anti-IL-13, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>Anti-LAG-3, PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>Anti-PD-1, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Anti-TIM-3, APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td>, <td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 무혈청 보충제(50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Clear Flat Bottom 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, 멸균 (제품 #3596)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Defined fetal bovine serum,HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) 글루타민 미포함</td><td>MediaTech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Gluc w/o L-Gluc, Na Pyr 1 L</td><td>Invitrogen</td><td>11960051</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham의 F12 50:50 혼합물 L-글루타민 및 15mM HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨(1,000 U/mL)</td><td>미국 제약</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACS큐언트</td><td>Milteni Biotech Inc.</td><td>BIS013220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x 승 / CA 및 MG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1mM EDTA(Ca2+ 또는 Mg2+ 없음)</td><td>VWR Scientific 제품</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>R& D 시스템</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 작업 희석액(10ng/&micro; L)</td><td>CellGenix, 미국 운영</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨 (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>41693700</td><td></td></tr><tr><td>TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML&nbsp;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC CORP</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Tecnol 절차 마스크</td><td>Kimberly-Clark</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

체 외 종양 세포 rechallenge 공상 항 원 수용 체 t 세포 antitumor 기능 예측 평가

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 치료 분야는 자동차 디자인, 유전자 공학 접근 및 제조 최적화 개선 급속 하 게 전진 된다. 그러나 이러한 개발 노력에 대 한 하나의 도전, 튼튼하게 vivo에서 치료 성공 위한 최적의 자동차 T 셀 제품의 선택에 게 알릴 수 있는 생체 외 분석 실험의 설립 되었습니다. 표준 체 외 종양 세포 분석 실험 종종 상대적으로 짧은 공동 문화 시간 및 높은 T 세포 종양 비율 차 T 세포의 진정한 antitumor 잠재력을 반영 하지. 여기, 우리는 높은 종양 세포 부하에서 잠재력을 죽이 자동차 T 셀 재귀를 평가 하는 생체 외에서 공동 문화 방법 설명. 이 분석 결과, 장기 세포 독성 기능 및 자동차 T 세포의 증식 능력에 검사 체 외에 7 일 동안 추가 종양 대상 공동 문화 매일 관리 합니다. 이 분석 결과 프로 파일링 T 세포 활성화, 피로와 메모리 고기 결합 될 수 있다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 성공적으로 구분 CD4의 기능과 phenotypic 차이점+ 와 CD8+ 차 T 세포종에 대 한 세포 (GBM) 세포, orthotopic에서 그들의 차동 vivo에서 antitumor 활동 반영 이 종이 식 모델입니다. 손쉬운 접근을 자동차 T 세포 효능을 평가 하 고 기능 변화를 명료 하 게 다른 차 T 셀 제품을 제공 합니다.

위에서 설명한 분석 결과 사용 하 여, 우리 차동 이펙터 힘을 구별 해야 하 고 CD4 중재 역학을 죽이고+ 와 CD8+ 차 T 세포. 여기에 제시 된 결과 CD4의 차이 설명+ 와 CD8+ 자동차 T 우리의 이전 게시21의 독립적인 건강 한 기증자 로부터 생성 된 셀.
표준 degranulation 분석 결과 통해 우리 모두 관찰할 수 있었다 CD4+ 와 CD8+ 자동차 T CD107a 및 세포내 cytokine의 식에 의해 표시 된 대로 셀 똑같이 GBM 세포 타겟된 항 원 표현에 대 한 활성화 되었다 (그림 2A). 그러나, 우리는 발견 반복적인 종양 도전 분석 결과 사용 하 여, CD4+ CD8 하지 하지만+ 차 T 세포 전시 다중 라운드 살인 (그림 2B)의 기능. CD4+ 차 T 세포 또한이 분석 결과 (그림 2C) 동안 CD8 + 세포에 비해 더 나은 확장을 달성된. 자동차 T 세포 부분 집합 사이 확장의 차이 관찰 했다 D3에서 종양 도전 (1시 12분 E:T)의 2 라운드 후 종양 도전 (1시 20분 E:T)의 3 라운드 후 d 5에서 시작, 나타내는 세포 독성의 차이가 관찰 하는 동안 단기 분석 실험은 다른 자동차 T 셀 제품의 효능에는 차이 명료 하 게 하지 못했습니다. 때 1:1 혼합 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포는이 분석 결과에 적용 된, 그들은 것을 발견 했다 CD8 능가할+ 하지 CD4 하지만 장기 세포 독성 (그림 2B)에+ 차 T 세포. CD8의 확장+ 차 T 세포 공동 적용된 CD4에 의해 유도 되었다+ 세포, CD4 동안+ 차 T 세포 확장 CD8 존재 저해 했다+ 세포 (그림 2C).
CD4 사이 이펙터 활동을 구별 하는 메커니즘을 설명 하기 위해+ 와 CD8+ 차 T 세포, 우리가 먼저 확인 초기 후 그 24 시간 공동 문화, 두 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포 했다 comparably 활성화 (그림 3 A). 한편, CD45RO CD62L 식 두 CD4에 표시 된 대로+ 와 CD8+ 차 T 세포 중앙 메모리에서 전환 했다 (CD45RO+, CD62L+) 이펙터 메모리 (CD45RO+, CD62L-) 표현 형 동안 반복 종양 챌린지 (그림 3B). 우리는이 분석 결과의 d 3에 셀 특징 다음 차 T 세포 부분 집합 기능 차이 표시 하기 시작 하기 전에 한 번. T 세포 소모 억제 수용 체 PD-1, 지연 3과 팀-315,21, 보여주는의 공동 식에 의해 표시 되었다 그 CD8+ 차 T 세포 CD4에 비해 소모 하는 더 경향이 있었다+ 차 T 세포 ( 그림 3 C). 또한, 차이가 CD8에 보였다+ 공동 적용된 CD4의 존재/부재에 차 T 세포 소모+ (그림 3C)을 나타내는 세포는 CD4 유도 CD8+ 자동차 T 셀 확장은 더 나은 effector 기능 연관 된.
함께,이 분석 결과에서 결과 확인 그 CD4+ 차 T 실적된 CD8 세포+ 세포 특히 장기 세포 독성. 유사한 단기 세포 독성 (1-3 일, 한 번 rechallenged) CD4에도 불구 하 고+ 차 T 세포 CD8 동안 반복적인 종양 도전 시 지속적인된 effector 기능+ 세포 소진 되었고 종양 세포의 성장을 제어 하는 데 실패. 두 개의 하위 혼합 했다, CD4+ 차 T 세포 CD8의 확장을 촉진+ 차 T 세포, CD8의 고갈 상태 하지만+ 세포, 두 그룹 간의 시너지 효과의 부족의 결과로 ameliorated 하지 했다. 비슷한 차이 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포 vivo에서 모델에서 앞에서 설명한21으로 보였다. 실제로, CD8+ 차 T 세포 항 원 양성 재발;와 뒤 하지만 단기 종양 클리어런스를 중재할 수 있었다 반면, CD4+ 차 T 세포 치료 결과, 장기 종양 퇴치21, 생체 외에서 rechallenge 분석 결과 사용 하 여 그들의 반복적인 살인 잠재력의 연상입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> 그림 1 : 반복적인 도전 분석 결과의 스키마 및 분석 전략. (A) 스키마 그리고 타임 라인의 반복 종양 도전 분석 결과. 각 잘 차 T 세포 처음 PBT030-2 GBM 셀 (자동차 + 셀 4000, 16000 종양 세포)와 공동 경작 되었고 다시 32000 종양 세포 (D2, D4, D6) 매일 도전. 종양 세포와 자동차 T 휴대폰 번호 뿐만 아니라 자동차 T 세포 표현 형의 분석은 D1, D3, D5, D7에서 수행 됩니다. (B) 공동 문화를 설정 하기 전에 세포 게이팅 자동차 %T 결정 하는 전략. (C) 게이팅 라이브 세포, 종양 세포와 반복적인 과제 분석 결과에서 차 T 세포의 전략. (D) 종양 세포 rechallenge 분석 결과, untransduced T 세포와 공동 경작의 다른 시간에 번호를. 오차 막대 = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> 그림 2 : 반복적인 도전 분석 결과 밝혀 CD4 살인 및 증식 효능 차이+ 와 CD8+ 자동차 T 셀. (A) Degranulation와 CD4의 얼룩이 지는 세포내 cytokine+ 와 CD8 GBM 셀 후 공동 문화 5 h+ 차 T 세포 (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ 또는 혼합 (CD4:CD8 = 1:1) 차 T 세포 반복적인 도전 분석 결과에 적용 된 및 가능한 종양 세포 계량 했다. p &lt; 0.05 * *p &lt; 0.01, * * *p &lt; 0.001 c d 4와 비교+, Bonferroni의 여러 비교 테스트 편도 ANOVA를 사용 하 여. (C) CD4+ 와 CD8+ 반복 종양 도전 분석 결과 중 차 T 세포 확장. (왼쪽에서 오른쪽)의 비교 CD4+ vs CD8+, 단일 하위 집합; CD4+ vs CD8+, 그룹 내에서 "혼합"; CD4+, 싱글 vs 혼합; CD8+, 싱글 vs 혼합. p &lt; 0.05 * *p &lt; 0.01, * * *p &lt; 0.001 짝이 없는 학생의 t 시험을 사용 하 여. 오차 막대 = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> 그림 3 : 반복적인 도전 시험 동안 T 세포 표현 형의 분석. (A) 4-1BB와 분석 결과의 d 1에서 자동차 T 세포에 CD69 얼룩. (B) CD45RO 및 CD62L rechallenge (입력), 분석 결과를 적용 하기 전에 그리고 d 3와 D7 분석 결과의 자동차 T 세포의 얼룩. (C) 공동 식 PD-1, 지연 3 및 분석 결과의 D3에서 자동차 T 세포에 팀-3. (맨 위) 1, 2 또는 3 억제 수용 체를 표현 하는 T 세포를 식별 하는 전략 게이팅 (아래) 비교: CD4+ 셀 (단일 하위 집합), CD8+ 셀 (단일 하위 집합), CD8+ (그룹 내에서 "혼합") 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> 표 1: rechallenge 설치의 대표적인 접시 지도.

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

이러한 프로토콜은 반복성 종양 세포 도전을 통해 키메라 항원 수용체 또는 CAR T 세포의 평가를 위한 장기간, 체외, 기능적 방법을 제공한다. 이 기술은 생체 내 CAR T 세포 기능 평가보다 시간이 적게 걸리고, 실제 항종양 효능을 정확하게 나타내면서 노동 집약적이다. 이 시험관 내 기술은 CAR T 세포 항종양 효능의 높은 처리량 스크리닝 및 분화를 가능하게 한다.CAR T 셀 제품의 임상 적 효과를 평가하기위한 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 교모세포종 종양권 배양에서 교모세포종 종양스피어를 해리하는 것으로 시작합니다. 차가운 accutase의 1 밀리리터, 그리고 파이펫팅의 30~60 초.종양권이 중단되었을 때, 따뜻한 공동 배양 배지의 5 밀리리터와의 반응을 중단하십시오. 그리고 원심분리에 의한 종양 세포 현탁액을 펠릿. 교모세포종 세포를 신선한 공동 배양 배지 농도의 밀리리터당 1.6배 10배, CAR T 세포 배양으로부터 수확한 T 세포를 동배배지 농도의 밀리리터당 CAR 양성 T 세포의 적절한 비율로 희석한다.다음으로, 희석된 종양 세포의 100마이크로리터를 96개의 평평한 바닥 조직 배양 판의 각 웰에 추가한다. 그리고 CAR T 세포의 100 마이크로 리터는 부드러운 혼합과 종양 세포의 각 우물에. 그런 다음 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 놓습니다.2일, 4일, 6일 배양시, 종양세포의 각 웰에서 50마이크로리터의 배지를 신중하게 제거하고, T세포 공동배양판은 표에 따라 재도전될 예정이다. 그런 다음, 50 마이크로리터의 신선한 교모세포종 세포 현탁액을 추가하여, 방금 시연된 대로 제조되었지만, 초기 공동 배양의 세포 수의 두 배로 부드러운 혼합을 통해 각각 잘 한다. 그리고 세포를 배양하는 배양에 접시를 반환합니다.1일, 3일, 5일, 7일, 각 우물에서 상체를 새로운 96개의 둥근 바닥 플레이트로 옮기고, 사전 따뜻해지는 0.5%의 트립신 EDTA 50마이크로리터를 각 매체에 잘 고갈시켰다. 섭씨 37도에서 5분 후, 세포가 빛 현미경검사법에 의해 각 우물의 바닥에서 분리되어 있음을 확인하고, 세포를 재보습하기 위해 각 우물의 바닥 주위의 효소 용액을 부드럽게 피펫한다. 분리된 세포 현탁액을 새로운 96웰 플레이트의 적절한 해당 우물로 이송하기 전에.원심분리에 의해 세포를 펠렛하고, 200 마이크로리터의 형광 활성 세포 선별 서용액또는 제2 원심분리로 잘 FFS로 세포를 세척한다. 4섭씨에서 30분 동안 잘 100마이크로리터의 SSS에 관심이 있는 항체 칵테일 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 인큐베이션의 종은 순차적으로 100 및 200 마이크로리터 FSS에 의해 임의의 언바운드 항체를 제거하고 DAPI 핵 얼룩 및 FSS의 100~200마이크로리터에서 세포를 재중단한다.이어서, 표준 유량 세포 분석 프로토콜에 따라 세포를 분석한다. 종양 세포 공동 배양 후 CAR T 세포의 기능 및 phenotypic 분석을 위해, 유동 세포계로부터 데이터 파일을 검색하고, 모든 살아있는 DAPI 음성 세포를 게이트한다. 종양 세포를 정량화하기 위해 CD45 음성 집단을 게이트합니다.CAR T 세포를 정량화하기 위해 CD45 양성 CAR 양성 인구에 게이트. 그런 다음 실험의 시간 경과에 걸쳐 종양 및 CAR T 세포 수를 플롯하여 41BB 및 CD69의 공동 발현에 의한 T 세포 활성화를 식별한다. CD45RO 및 CD62 리간드 발현에 의한 PD1, LAG3 및 TIM3 및 T 셀 메모리 상태 LAG3 및 T 셀 메모리 상태의 발현에 의한 T 셀 고갈.CD45RO 및 CD62 리간드 식에 의해. CD4 양성, 및 CD8 양성 CAR T 세포모두 CD107a 및 세포 내 사이토카인 발현에 의해 표시된 바와 같이 표적 항원을 발현하는 교모세포종 세포에 대해 동등하게 활성화된다. 그러나, 반복적인 종양 도전 SA에 의해 평가된 바와 같이, CD4 양성, CD8 양성, CAR T 세포는 다중 원형 살수 수 있다.CD4 양수 CAR T 셀도 보다 견고한 확장을 달성합니다. CD4 양성 및 CD8 양성 CAR T 세포가 1 대 1 비율로 혼합될 때, 이 세포 조합은 CD8 양성, 그러나 장기 세포 독성 의 관점에서 CD4 양성 CAR T 세포를 수행한다. 또한, CD8 양성 CAR T 세포의 팽창은 CD4 양성 T 세포의 첨가에 의해 유도된다.CD4 양성 CAR T 세포 팽창은 CDa 양성 세포의 존재에서 억제된다. 초기 공동 배양 후 24시간, CD4 양성 및 CD8 양성 CAR T 셀 모두 유사하게 활성화된다. 반복종양 도전 중, CD4 양성 및 CD8 양성 CAR T 세포 모두 CD45RO 양성, CD62 리간 양성 중앙 메모리 표현형, CD45RO 양성 CD62 리간 음성 이펙터 메모리 표현형으로의 전환을 입증한다.CD8 양성 CAR T 세포는 또한 공동 배양 3일 후에 PD1, LAG3 및 TIM3 발현에 의해 평가된 CD4 양성 CAR T 세포에 비해 피로하는 경향이 있습니다. 또한, CD4 양성 T 세포의 존재 또는 부재에서 CDa 양성 CAR T 세포 고갈에서 관찰된 차이가 없으며, CD4 유도CD8 양성 CAR T 세포 팽창이 더 나은 이펙터 기능과 연관되지 않음을 나타낸다. 이 에세이는 또한 T 세포를 분류하는 것과 결합하여 전사, 프로테오믹스 및 관심있는 특정 유전자에 대한 추가 분석을 수행하기 위해 공동 배양을 형성할 수 있습니다.이 반복적인 종양 도전은 또한 CAR T 세포 종양 인식 후 생물학 사건을 조사하기 위한 플랫폼으로 이용될 수 있었습니다.

in-vitro-tumor-cell-rechallenge-for-predictive-evaluation-chimeric

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 종양 세포 부하가 높은 동안 CAR T 세포의 반복적인 종양 사멸 가능성을 평가하기 위한 반복 종양 챌린지 분석을 시연합니다. 또한, 유세포 분석을 사용하여 CAR T 세포를 분석하여 샘플에서 CAR T 세포의 다양한 하위 집단을 결정할 수 있습니다.

반복성 종양 챌린지 분석: 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 반복적 종양 사멸 가능성을 평가하기 위한 체외 배양 분석

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생체 외에서 제조하는 기술을 보여줍니다. 인간 T 세포는 인터루킨-2(IL-2)가 보충된 배지와 함께 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 비드로 배양되어 T 세포의 활성화 및 증식을 유도합니다. 형질전환 렌티바이러스 벡터가 도입되어 형질전환 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 전이유전자를 발현할 수 있습니다. 그 결과 형질도입된 T 세포가 표면에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현합니다. T 세포는 CAR 발현 및 동결 보존을 평가하기 위해 정의된 시점에 수확됩니다.

키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 생체 외 기술

이 비디오는 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생체 외 생성 기술을 보여줍니다. 형질전환 RNA를 운반하는 레트로바이러스 벡터는 인터루킨-2가 보충된 배지에서 비장 세포와 혼합되어 T 세포의 생존과 증식을 촉진합니다. 그런 다음 혼합물을 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트로 옮기고 원심분리하여 바이러스와 세포의 융합을 촉진함으로써 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 종양 항원을 표적으로 하는 표면 결합 CAR을 생산할 수 있도록 합니다.

종양 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하기 위한 생체 외 기술

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 활성을 검증하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. CD19 항원을 발현하는 B세포 림프종 세포와 세포질 루시페라아제를 CD19 특이적 CAR T 세포와 공동 배양합니다. 종양의 CD19에 대한 CAR 결합은 CAR T 세포가 종양 세포 독성을 유발하는 사이토카인과 독소를 방출하도록 유도합니다. CAR T 세포 활성은 종양 세포에서 방출된 사이토카인과 감소된 루시페라제 매개 생물 발광을 정량화하여 평가합니다.

종양 특이적 CAR T 세포의 항종양 활성을 평가하기 위한 In vitro 분석

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

여기에서 우리는 급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식 모델이 CD19 표적 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성을 평가하고 모니터링하기 위한 전략으로 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

학습하세요 체외 공배양을 통한 CAR T 세포 반복 종양 도전 평가법으로 교아세포종에 대한 면역항암 효능을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 고효율 스크리닝과 임상 적용 가능성을 제공합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

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