Name: 그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans에서 산소 소비 속도를 측정하여 미토콘드리아 기능을 평가하는 방법을. 살아있는 선충을 이용해 격리 없이 정확한 생물학적 데이터를 얻을 수 있습니다.

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저자 그의 실험실에서 해 마 XFp를 설정에 대 한 박사 케빈 Bittman 인정 하 고 싶습니다. 국립 보건원 부여 GM088213이이 작업을 지원 합니다.

참고: 그림 2 는 전체 프로토콜의 개요 개요를 제공합니다.
1. 성장과 선 충 인구9,10 의 동기화
<ol><li>원하는 유전 배경의 L4 애벌레를 전송 (예: N2 [야생 유형] 및 sel 12 동물) 갓 대장균 (OP50)11의 잔디와 시드 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시 (제조 법에 대 한 표 1 참조)에. 두 개 이상의 100 m m 또는 3 개의 60 m m 플레이트를 사용 하 여 각 변형에 대 한. 3-4 일 또는 격판덮개는 계란과 벗 벌레의 큰 수로 집중 될 때까지 적절 한 성장 온도 (15-25 ° C) 사이 벌레를 품 어.</li>
	<li>계란과 M9 버퍼의 약 6 mL를 사용 하 여 격판덮개 떨어져 벌레 세척 (제조 법에 대 한 표 1 참조) 선 충 및 전송의 100 mm 접시 당 그들 각 변형에 대 한 개별 15ml 원심 분리기 튜브로 파스퇴르 펫을 유리. 6,180 x g와 M9 버퍼, 단지 동물과 계란 펠 릿을 유지 밖으로 aspirate에서 3 분 다운이 튜브를 회전 합니다.</li>
	<li>표 백제 솔루션의 3-4 mL를 추가 (제조 법에 대 한 표 1 참조) 각 튜브와 간헐적으로 6 분 추가 M9 버퍼 채우기 각 튜브 6,180 x g 1 분 동안에 회전 하 고 상쾌한 발음에 대 한 소용돌이. M9이이 세척 3 번 반복을 계란 펠 릿을 M9 버퍼의 약 9 mL를 포함 하는 신선한 15 mL 튜브.</li>
	<li>1.5 분 6,180 x g에서 nutating 16-48 h. 회전 20 ° C에 의해 갓 부 화 한 벌레가이 튜브 아래로 동기화 하 고 갓 OP50의 잔디와 시드 개별 NGM 접시에 동기화 된 L1 동물을 내려 (약 100 m m 당 6000-10000 동물) 20 ° c.에 계속 하 고</li>
	<li>이 동물 후 ~ 42 h L4 애벌레 단계에 도달 한다. 이 시점에서 OP50에 백 금 선택을 사용 하 여 L4 애벌레 시드 NGM 이동 접시 포함 된 0.5 mg/mL 5-플 루 오로-2'-deoxyuridine (FUdR) 자손을 생산에서 그들을 방지 하기 위해. 참고: 실험 내 모든 종자가 비슷한 양의 시간에 대 한 동기화는 다는 것을 확인 하십시오. FUdR 치료 동물 sterilizes OCR에 영향을 미칠 수 있는 달걀 누워 및 자손 생산을 방지 한다. 이러한 멸 균된 동물 분석 결과 대 한 다음 날 (~ 66 h 1 일 성인 동물) 분석 됩니다. FUdR은 생리학 특정 돌연변이 벌레의 수명에 미치는 영향에 보고 되었습니다. 따라서,이 취해야 한다 고려 사항으로 살 균12,,1314에 대 한 약물을 사용 하는 경우. 벌레도 feminizing 돌연변이 fem-1(hc17) 또는 fem-3(e2006) 등의 방법으로는 멸 균 수 있습니다. 그러나, 이러한 돌연변이 미토 콘 드 리아 기능 영향을 줄 수 있습니다.</li>
</ol>2. 주입 하는 화합물과 프로브 수 분의 준비
참고: 실행 하는 분석 결과 중 선 충의 두 기저와 최대한 호흡 속도 측정 됩니다. 최대한 호흡 동물 생성 시안-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP)의 추가에 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하는 연결을 푸는 ionophore 따라서 양성자를 운반 하 여 ATP 합성에서 시작 미토 콘 드 리아 멤브레인을 통해 양성자를 펌핑 하면서 전자 수송과 산소 소비4,15 진행 상태로 ATP 합성 (그림 1)에서. 나트륨 아 지 드 (NaN3)의 추가 포함 하는 분석 결과 마지막 단계 복합물 IV와 V 하나 비-미토 콘 드리 아 호흡16 (그림 1)을 확인 하려면 허용 등을 억제 하는 약물. 다음 단계는 실제 분석 결과 실행 전에 하루 수행할 수 있습니다.
<ol><li>준비 1 mL는 FCCP의 재고 솔루션 (디 메 틸 sulfoxide [DMSO]에서 10 mM: 최종 분석 결과 농도 x 1000)-20 ° c.에가 게와 할머니3 (dH2소개할 10 최종 분석 결과 농도 x 400 mM) 참고: 실행 FCCP의 농도 최적화 하는 농도 곡선 각 악기 및 실험실 설정에 대 한 최대한 OCR 응답을 유도 하는 데 필요한.</li>
	<li>센서 프로브는 dH2O 및 실 온에서 하룻밤 저장소에 잠긴 되도록 각 잘 (그리고 주변 저수지), 접시에 dH2O의 200 µ L을 추가 하 여 센서 카트리지 하이드 레이트. 참고: 프로브를 남아 있을 수 있는 카트리지 최대 72 h에 대 한 침수 하지만 장기간된 수 분의 경우 판 한다 파라핀 필름에 싸서 4 ° c.에 저장 숙박 수 화 불가능, 센서 카트리지 분석 결과 전에 적어도 4 h 하이드레이션 해야.</li>
	<li>Respirometer 인터페이스 내에서 히터를 끄고 하룻밤 분석 결과 실행 동안 과열에서 동물을 방지 하기 위해 악기 내에서 낮은 코어 온도를 15 ℃ 인큐베이터 안에 악기를 저장. 참고:는 respirometer가 열 요소를 갖추고 있지만 냉각 될 수 없습니다. 15 ° C 배양 기 내는 respirometer C. 선 충 유지 보수에 대 한 건강 온도 18-22 ° C 사이의 안정적인 온도 가질 것 이다.</li>
</ol>3. 마약 로드 및 카트리지 평형
<ol><li>밖으로 플라스틱 그리고 dH2센서를 수 화 하는 데 사용 하는 O 조사 하 고 각 잘에서 calibrant 솔루션 (pH 7.4)의 200 µ L를 삭제. DH2O 100 µ m FCCP FCCP 재고 솔루션을 희석 하 고 센서 카트리지에서 주입 포트 A에 희석된 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다. 세 뇨 르 카트리지 포트 B 400 m m 나트륨 아 지 드의 22 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>respirometer를 켜고 홈 스크린 선택 시작; 서식 파일 페이지에 표시 됩니다. 서식 파일 페이지에서 빈 또는; 이전에 디자인된 서식 파일 선택 그룹 페이지에 표시 됩니다. 그룹 페이지에서 배경 우물으로 웰 스 A와 H를 선택 하 고 실험 계획에 따라 적절 한 그룹에 나머지 6 웰 스를 할당 합니다.</li>
	<li>프로토콜 페이지에가 서 오른쪽 아래 모서리에 있는 화살표를 밀어. 프로토콜 페이지에서 평형, 기초 및 주사 1과 2 단추 선택 되어 있는지 확인 합니다. 이 페이지에서 조정 (FCCP와 주입 1) 후 기저 OCR로 최대한 OCR 판독의 수 및 비-미토 콘 드리 아 (사출 2 나트륨 아 지 드와 함께) 후 OCR. 참고: 각 측정 앞에 혼합 하 고 대기 단계 및 이러한 매개 변수에 대 한 시간 프레임 표 2에 나와 있습니다.</li>
	<li>오른쪽 아래 모서리에 있는 화살표를 선택 하 고 센서 카트리지 접시를 로드 하 라는 메시지가 나타납니다. 센서 카트리지 접시 지침 알림 프롬프트 화면에 오른쪽 방향으로 로드를 확인 합니다. respirometer 카트리지를 equilibrate 지금 것입니다. 참고:이 평형 동물 세포 격판덮개의 적절 한 우물으로 분석을 배치 하는 충분 한 시간을 제공 합니다.</li>
</ol>4. 웜 플레이트 및 분석 결과 실행 준비
<ol><li>각 셀 판의 8 우물의 우물 주변 저수지에 M9 버퍼의 200 µ L를 추가.</li>
	<li>Unseeded NGM 접시에 각 스트레인에서 ~ 100 웜 선택과 M9 버퍼와 2-3 분 젖은 백 금 선택의 끝에 휴식 하 고 우물 B-G, 배경 웰 스 A와 H를 빈 떠나는로 20 나이 동기화 동물을 선택 수 있습니다. 참고: 후 각 음, 약 2 분을 기다릴 우물의 바닥에 침전 하는 동물을 허용. 그것은 또한 웜 번호 곡선 각 악기 및 실험실 설정 잘 당 웜 수를 최적화 하기 위해 실행 될 것이 좋습니다.</li>
	<li>지금까지,는 respirometer를 보정 해야 합니다 하 고 클릭 하 여 확인 화면에, 교정 버퍼를 포함 하는 접시 나옵니다 악기 내부 센서 카트리지 유지 하는 동안 respirometer에서 제거할 수 있습니다. 동물을 포함 하는 접시에 calibrant 플레이트를 바꿉니다. 플레이트 로드 고 문을 계속 타격 하 여 닫고 실행 분석 결과 허용 합니다.</li>
</ol>5. 후 실험 데이터 분석
<ol><li>분석 결과 실행 완료 되 면 화면에 나타나는 메시지에 따라 셀 판 및 센서 카트리지를 제거 하 고.war 형식에서 실행된 데이터를 저장 하는 USB 포트에 플래시 드라이브를 삽입. 센서 카트리지를 제거 하 고 약 2 분 장소 스테레오 해 부 현미경 아래 셀 접시 대 한 우물의 바닥에 정착을 잘 당 동물의 수를 세 동물 허용.</li>
	<li>컴퓨터에 분석 소프트웨어 열고 동물 수 OCR 정상화 정규화 탭을 엽니다. 수정 탭의 다양 한 그룹에 대 한 적절 한 레이블을 적용 하 고 파일 추가 분석을 위해 프리즘 파일로 내보냅니다. 참고: 처음 5 측정, FCCP의 추가 5 측정 후 FCCP 추가 최대한 OCR의 평균 동안 기저 OCR 전에의 평균 및 마지막 5 측정 (최소 두 측정 할 수)의 평균 후에 나트륨 아 지 드 추가 비-미토 콘 드리 아 호흡 속도입니다. 분석 결과 재현성을 보장 하기 위해 세 번을 반복 한다.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
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<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

미토 콘 드리 아 호흡은 통찰력 있는 미토 콘 드 리아 기능; 따라서, 생체 외에서 또는 vivo에서 생물 학적 시스템에 산소 소비 속도 측정할 수 있는 매우 귀중 한입니다. Respirometers 산소 또는 산소 압력 전기 전류 비례의 생성에 의존 하는 amperometric 산소 센서를 통해 침묵 얻을 포 르 피 린 기반 형광체를 사용 하 여 산소 레벨을 감지 한다. 클라크 전극 후자의 범주에 폭포와 C. 선 충에 호흡을 분석 하는 동안 특히 문학, 광범위 하 게 사용 되어 있다. 그러나, 큰 샘플 크기와 무 능력 한 번에 하나 이상의 샘플을 평가 대 한 필요는 amperometric 산소 센서 비효율적.
이 프로토콜 미토 콘 드리 아, 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 영향을 줄 수 있는 과정을, 따라서, OCR을 분리 하지 않고, 그대로 C. 선 충 에서 측정 OCR에 간단한 가이드를 제공 합니다. 그 동물 전시 다양 한 생활 단계를 통...

아데노신 3 인산 염 (ATP), 세포 에너지의 주요 소스는 미토 콘 드리 아에 안 미토 콘 드리 아 막에 위치한 전자 전송 체인 (등)에서 효소에 의해 생산 됩니다. 어디 그것 decarboxylated 아 세 틸 보 효소 A (CoA)를 생산 하는 미토 콘 드리 아 모체로 pyruvate, 미토 콘 드리 아의 ATP 생산을 위해 활용 하는 주요 대사 산물 가져옵니다. 그 후, 아 세 틸 CoA 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)는 주요 전자 캐리어 분자의 세대의 결과로 구 연산 산 성 주기를 입력 합니다. NADH에서 전자는 등을 통해 산소에 전달 됩니다, 양성자 전기 화학 기온 변화도의 세대에서 막에 걸쳐 결과 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에 구축. 이러한 양성자 것입니다 다음 회전 그리고 ATP1 (그림 1)의 합성 ATP synthase의 양성자 기 공 통해 미토 콘 드리 아 모체로 다시이 전기 화학 기온 변화도 걸쳐 intermembrane 공간에서 흐른다.
미토 콘 드 리아 기능 에너지 생산에 국한 되지 않습니다 하지만 칼슘 항상성, 반응성 산소 종 (선생님), 청소 및 apoptosis, organismal 건강2에 그들의 기능을 비판적으로 위치에 대 한 중요 한 또한 이다. 미토 콘 드 리아 기능 분석 실험를 포함 하 여 그 미토 콘 드리 아 막 잠재력 측정 분석, ATP 및 선생님 수준, 그리고 미토 콘 드리 아 칼슘 농도에 국한 되지 않는 다양 한을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 그러나, 이러한 분석 미토 콘 드 리아 기능의 단일 스냅숏으로 제공 하 고 따라서 미토 콘 드리 아 건강에 대 한 포괄적인 보기를 제공 하지 않을 수 있습니다. ATP 생성 하는 동안 산소 소비 순차적 반응의 무수 한 의존 때문에, 그것은 미토 콘 드리 아 기능의 우수한 지표 역할. 흥미롭게도, 산소 소비 속도 있는 변이 결과로 미토 콘 드 리아 기능 장애3,,45관찰 되었습니다.
생활 샘플의 산소 소비 속도 (OCR) 기술을 광범위 하 게 두 그룹으로 분할 될 수 있다 사용 하 여 측정 될 수 있다: amperometric 산소 센서와 포 르 피 린 기반 형광체 산소6침묵 될 수 있습니다. Amperometric 산소 센서 측정 OCR 배양된 세포, 조직, 그리고 모델 시스템, C. 선 충등을 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, respirometers를 포함 하는 포 르 피 린 기반 형광체 다음과 같은 이점을: (1) 그들은 허용 3 중, 2 개의 샘플을 나란히 비교 (2) 그들은 작은 샘플 크기를 요구 (예를 들어, 잘 ~ 2, 000−5, 대 당 20 벌레 000 벌레는 상공 회의소)7, 그리고 (3)는 respirometer에서 4 개의 다른 복합 주사 할 프로그래밍 될 수 있다 수동 응용 프로그램에 대 한 필요성을 제거 실험 실행에 걸쳐 시간을 원하는.
이 프로토콜에는 포 르 피 린 기반 산소 감지 respirometer 라이브, 그대로 C. 선 충 에서 측정 OCR 사용 하 여 관련 된 단계는 설명된. 그러나 거기에 대형, 높은 처리량 respirometer8의 사용에 대 한 서 면된 프로토콜이이 프로토콜을 더 많은 예산 친절 하 고, 작은 규모 장비 사용에 대 한 적응 되었습니다. 이 프로토콜은 특히 OCR 두 긴장, 높은 처리량 검사는 필요 하지 않습니다와 그것의 사용은 과도 한 것 간의 차이 평가 하기 위한 유용 합니다.

<table><tbody><tr><td>100 mm, 60 mm 페트리 접시</td><td>Kord-Valmark Labware Products</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원심분리기 튜브</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 튜브</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 22 mm 커버슬립</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 트립톤</td><td>BD, Bacto</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>BD, Bacto</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수(dH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 헵타하이드레이트 (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>피셔 사이언</td>티픽 <td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성(K2HPO4)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH2PO4)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 무수(Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp 분석기</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

미토 콘 드리 아 기능을 최적의 건강 한 세포 활동, 특히 높은 에너지 요구 같은 신 경계와 근육에 있는 셀에에서 대 한 중요 하다. 일관 된,이 미토 콘 드 리아 기능 장애 신경 퇴행 성 질환 및 일반적으로 노화의 무수와 연결 되었습니다. 꼬마 선 충 elucidating 미토 콘 드 리아 기능의 많은 복잡 한에 대 한 강력한 모델 시스템 되었습니다. 미토 콘 드리 아 호흡 미토 콘 드리 아 기능의 강한 지시자 이다 고 최근에 개발 된 respirometers 세포에서 호흡을 측정 하는 최신의 플랫폼을 제공 합니다. 이 프로토콜, 라이브, 그대로 C. 선 충을 분석 하는 기술을 제공 합니다. 이 프로토콜 ~ 7 일의 기간에 걸쳐 (1) 성장 하 고 주입 하는 화합물의 C. 선 충, (2) 준비 및 프로브, (3) 약물 로드 및 카트리지 평형, 웜 분석 결과의 준비 (4) 수 분의 동기화에 대 한 단계를 포함 하 고 플레이트 및 실행, 분석 결과 (5) 후 실험 데이터 분석.

프로토콜을 사용 하 여 여기, OCR 야생 유형 동물 및 3 명의 다른 sel 12 돌연변이 종자 결정의 설명. sel-12 presenilin17의 선 충 C. ortholog을 인코딩합니다. 인간의 presenilin에 돌연변이 가족 Alzheimer의 질병18의 개발과 관련 된 가장 일반적인 유전 착오. 우리의 연구는 야생 타입 동물3에 비해 돌연변이 동물 sel- 12에서 상승 된 미토 콘 드리 아 칼슘 수준을 보여줬다. Sel 12 돌연변이 및 야생 유형 동물에 OCR sel 12 돌연변이의 효과 검사 측정 되었다 칼슘 dysregulation 변경 된 미토 콘 드리 아 기능3,...

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

미토콘드리아 기능은 세포 항상성에 중요하며 산소 소비율은 미토콘드리아 건강의 결정적인 지표입니다. 이 프로토콜은 C.elegans의 산소 소비속도를 분석하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능의 법적 측정을 제공하는 라이브, 모바일 C.elegans를 사용합니다.미토콘드리아를 분리할 필요성을 높이는 것은 무결성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 단계입니다. 시작하려면, 선충 성장 매체 또는 NGM 플레이트에 에샤리치아 대장균의 갓 씨를 뿌린 잔디밭에 원하는 유전 배경의 L4 애벌레를 전송합니다. 각 변형에 대해 적어도 두 개의 100mm 또는 3 개의 60mm 플레이트를 사용하십시오.3~4일 동안 적절한 성장 온도에서 벌레를 배양하거나, 판이 많은 수의 계란과 중력 벌레로 농축될 때까지 배양합니다. 선충의 100밀리미터 플레이트 당 약 6 밀리리터의 M9 버퍼를 사용하여 계란과 벌레를 접시에서 씻어냅니다. 유리 목초지 파이펫을 사용하여 계란과 벌레를 각 변형에 대해 개별 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다.6, 180g에서 3 분 동안 체튜브를 아래로 회전시하십시오. 원심 분리에 따라, M9 버퍼만 동물과 계란 펠릿을 유지 밖으로 흡인. 각 튜브에 3~4밀리리터의 표백제 용액을 넣고 간헐적으로 소용돌이를 6분간 추가합니다.그런 다음 M9 버퍼를 추가하여 각 튜브를 채우고 1 분 동안 6, 180g에서 회전합니다. 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 M9로 이 세척을 세 번 반복합니다. 세척 후, 계란 펠릿을 M9 버퍼의 약 9 밀리리터를 포함하는 신선한 15 밀리리터 튜브로 이동합니다.16~48시간 동안 섭씨 20도에 누디징하여 갓 부화한 벌레를 동기화합니다. 이 튜브를 6, 180g에서 1.5분 동안 아래로 회전한 후 동기화된 L-1 동물을 개별 NGM 플레이트에 OP50의 갓 시드잔디에 놓습니다. 동물이 약 42 시간 후에 L-4 애벌레 단계에 도달 할 때까지 접시를 섭씨 20도에서 유지하십시오.이때, 플래티넘 픽을 사용하여 L4 애벌레를 OP50 시드 NGM 플레이트로 이동하여 FUdR의 밀리리터당 0.5 밀리그램을 함유하여 자손 생성을 방지합니다. 플레이트의 각 우물에 증류수 200 마이크로리터를 추가하여 센서 카트리지에 수분을 공급하여 센서 프로브가 침수되도록 합니다. 접시를 실온에서 하룻밤 동안 보관하십시오.호흡로메터 인터페이스 내에서 가열 요소를 끕니다. 기계를 섭씨 15도 안에 보관하면 기계 내의 핵심 온도가 낮아지고 분석 중에 동물이 과열되는 것을 방지합니다. 하룻밤 동안 배양 한 후, 파이프 아웃 및 센서 프로브를 수화하는 데 사용되는 증류수를 폐기하고 각 우물에서 교정 용액의 200 마이크로 리터로 교체하십시오.FCCP 스톡 솔루션을 증류수에 100 마이크로몰러 FCCP로 희석합니다. 그런 다음 센서 카트리지에 주입 포트 A에 희석 된 용액의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 센서 카트리지의 주입 포트 B에 400 밀리머 나트륨 아지드22 마이크로리터를 추가합니다.이제 호흡을 켜십시오. 홈 화면에서 시작 을 선택하고 템플릿 페이지가 나타납니다. 템플릿 페이지에서 빈"또는 이전에 디자인된 템플릿을 선택합니다.그룹 페이지가 나타납니다. 그룹 페이지에서 우물 A와 H를 배경 우물로 선택하고 실험 계획에 따라 나머지 6개의 우물을 적절한 그룹으로 할당합니다. 오른쪽 아래의 화살표를 클릭하여 프로토콜 페이지에 액세스하고 평형, 기초 및 주사 하나 및 두 개의 버튼이 선택되었는지 확인합니다.기초 OCR의 판독값 수와 최대 OCR 및 비 미토콘드리아 OCR의 판독 값을 조정합니다. 오른쪽 아래 모서리에 있는 화살표를 선택합니다. 센서 카트리지 플레이트를 로드하라는 메시지가 나타납니다.미리 알림 프롬프트 화면의 지침에 따라 센서 카트리지 플레이트가 올바른 방향으로 로드되었는지 확인합니다. 호흡보호계는 이제 카트리지를 평형화합니다. 200 마이크로리터의 M9 버퍼를 8개의 우물과 세포판 주변 저수지에 넣습니다.각 변형에서 약 100개의 웜을 시드되지 않은 NGM 플레이트에 선택하고 2~3분 동안 휴식을 취하십시오. 그런 다음, M9 버퍼로 백금 픽의 끝을 적시고 20 나이 동기화 된 동물을 G를 통해 우물 B로 선택하여 배경 우물 A와 H가 비어 있습니다. 이제 respirometer 소프트웨어에서 확인을 클릭하여 교정 버퍼가 포함된 플레이트를 배출합니다.센서 카트리지를 기기 내부에 두고 호흡로메터에서 플레이트를 제거합니다. 교정판을 동물을 포함하는 접시로 교체합니다. 플레이트를 적재하고 계속 타격하여 문을 닫고 분석이 실행되도록 합니다.분석 실행이 완료되면 화면의 프롬프트를 따라 셀 플레이트와 센서 카트리지를 제거합니다. 실행 데이터 전쟁 형식을 저장하려면 USB 포트에 플래시 드라이브를 삽입합니다. 센서 카트리지를 제거하고 동물이 약 2 분 동안 우물 바닥에 정착 할 수 있도록합니다.세포판을 스테레오 해부 현미경 아래에 놓고 우물당 동물의 수를 계산합니다. 분석 소프트웨어를 열고 정규화 탭을 통해 산소 소비율을 동물 수로 정상화합니다. 수정"탭 의 다양한 그룹에 적합한 수준을 적용하고 추가 분석을 위해 프리즘 파일로 파일을 내보냅니다.처음 다섯 측정의 평균은 기저 OCR입니다. FCCP 추가 후 5가지 측정값의 평균은 최대 OCR입니다. 마지막으로, 나트륨 아지드 첨가 후 마지막 5가지 측정의 평균은 미토콘드리아 호흡률이 아니다.칼슘 dysregulation변경된 미토콘드리아 기능을 초래할 수 있기 때문에, 셀-12 돌연변이및 야생형 동물 모두에서 OCR은 미토콘드리아 기능 및 건강에 대한 셀-12 돌연변이의 효과를 검사하기 위해 측정하였다. 야생 형 동물은 지속적으로 웜 당 분당 5 피코몰 보다 기저 OCR 비율을 보였다. 셀-12 돌연변이의 세 가지 변종은 모두 상당히 상승 된 OCR을 보였지만, 분당 약 7 개의 피코몰이 웜 당 나타났습니다.FCCP가 추가되면 예상대로 야생 유형의 OCR뿐만 아니라 셀-12 돌연변이가 증가했습니다. 야생 형 동물은 벌레 당 분당 약 7 개의 피코몰의 최대 OCR을 보였습니다. 셀-12 돌연변이는 분당 약 10 개의 피코몰을 가지고 있었지만 웜 당.이 분석에서 라이브, 잘 먹이고 비동기 동물을 사용하고 계란이나 시체를 분석 우물로 옮기는 것을 피하십시오. 또한, 기기의 내부 온도는 섭씨 25도를 초과해서는 안됩니다. 표백제, FCCP, FUdR 및 아지드 나트륨은 독성이 있습니다.따라서 재고 솔루션 및 약물 적재 를 준비하는 동안 보호 장갑을 착용해야합니다.

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연구

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생물학

O의 정의 농도와 대기를 생성하는 지속적인 흐름 hypoxia 챔버를 사용하는 방법을 본 논문 세부...

에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기<em&gt; C. elegans</em

이 비디오에서는 불임 성인 예쁜꼬마선충의 발달 동기화된 개체군을 생산하는 방법을 보여줍니다. 예제 프로토콜은 살아있는 동물의 산소 소비율을 연구하기 위해 벌레를 동기화합니다.

선충 동기화(Nematode Synchronization): 동일한 발달 단계에 있는 벌레 개체군을 얻는 방법

C. elegans는 에탄올의 행동 영향을 연구하는 데 유용한 모델입니다. 우리는 기어가는 벌레의 운동 속도에 에탄올의 영향을 정량화하는 행동 분석을 제시합니다. 이 분석으로 초기 민감도와 에탄올에 대한 급성 기능적 내성의 발달을 모두 측정할 수 있습니다.

의 로코 속도에 에탄올의 효과를 측정하는 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

C. elegans는 산화 스트레스 저항성과 관련된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 매력적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 96개의 웰 플레이트에서 여러 산화제를 사용하여 액상에서 C. elegans 동물의 산화 스트레스 저항성을 측정하는 프로토콜을 제공합니다.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

신진 대사 속도 있는 변경은 측정 하는 것은 다양 한 질병과 노화의 진행을 이해의 중심입니다. 여기, 우리는 더 밀접 하 게 유사한 생리 적인 상태와 미토 콘 드리 아 활동을 수정 하는 새로운 약물 노출에 도움이 있습니다 전체 머리 산소 소비를 측정 하는 새로운 기법을 제시.

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O2 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

배우세요 Caenorhabditis elegans에서 산소 소비 속도를 측정하여 미토콘드리아 기능을 평가하는 방법을. 살아있는 선충을 이용해 격리 없이 정확한 생물학적 데이터를 얻을 수 있습니다.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

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