Name: 색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: 학습하세요 S. aureus 바이오필름에서 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 정량화하는 고처리량 방법을. 96웰 플레이트를 사용한 이 기술은 민감하고 간편하여 바이오필름 형성에서 효소 기능 연구에 활용됩니다.

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우리는 이러한 실험을 실시 시설에 대 한 시카고에 일리노이의 대학 윌리엄 Rainey Harper 대학 감사. 우리는 또한 그들의 관대 한 지원에 대 한 맥 그로 힐 재단을 감사합니다.

1. 매체 준비
<ol><li>1 L Tryptic 간장 국물 (TSB)의 준비:로 1 L 증류수, 카 제인, 콩 식사, 3 g의 염화 나트륨, 포도 당의 2.5 g와 dipotassium 인산 염의 2.5 g의 papaic 다이제스트의 5 g의 췌 장 소화의 15 g 추가. 사용 하기 전에 소독.</li>
	<li>TSB, 1 리터에 한 천 15 g을 추가 하는 대 한 Tryptic 간장 Agar (TSA), 오토 클레이 브. 다음 그것은 실내 온도 아래로 멋진 보자. 그런 다음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m) 당 20 mL의 비율로 붓는 다.</li>
	<li>Biofilm 문화 매체: 압력가 TSB의 1 리터에 포도의 10 g를 추가. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 여과 하 여 소독.</li>
</ol>2. 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 Biofilm 형성
참고: S. 구 균 biofilm는 앞에서 설명한6,21으로 교양 이다.
<ol><li>TSB의 10 mL에 TSA에서 S. 구 균 에의 한 개별 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 성장</li>
	<li>1: 100 (v/v) 비율로 TSB/포도 당 (10 g/L)의 10 mL에 숙박 문화를 희석. 일관 된 농도 대 한 혼합을 부드럽게 소용돌이.</li>
	<li>한 96 잘 접시에서 18 우물 (실험 그룹, ALP 활동6관계 제안 비 biofilm 컨트롤에 대 한 더 많은)의 총에 희석 문화의 200 mL를 전송. 세 쌍둥이 사용 하 여 각 시간 포인트: 0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분. 3.2 단계를 참조 하십시오.</li>
	<li>Biofilm 형성6,2124 h에 대 한 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어.</li>
	<li>열망 하 여는 상쾌한을 가만히 따르다.</li>
	<li>각 씻어 잘 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS, pH 7.4) x 1, 15000 x g 에 5 분 동안 원심과 포부에 의해는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
</ol>3. S. 구 균 Biofilm에서 ALP 활동의 측정
참고: ALP 활동 설명된6,18로 측정 되었다.
<ol><li>버퍼링 된 ALP 기판 단계 2.6에서에서 각 잘 상용 pNPP의 구성의 75 mL를 추가 하 고 시간 기록을 시작 합니다. 3 중에 각 시간 포인트를 기록 합니다.</li>
	<li>다양 한 시간에 대 한 부 화 후: 0 분 (제어), 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분 각각 75 µ L 반응을 중지를 5 M NaOH의 추가.</li>
	<li>15000 x g에 5 분 동안 접시 원심</li>
	<li>색도계 측정을 위한 새로운 96 잘 접시에 상쾌한의 100 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>각각의 흡 광도 측정 405 nm를 사용 하 여에서 잘 한 96 잘 접시 리더. 0 분 시간을 사용 하 여 405 nm 배경 잡음에 대 한 제어를 우물을 가리킨.</li>
	<li>3 개별 96 잘 접시에서 전체 실험을 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

우리의 분석 결과 우리 ALP 기판으로 pNPP를 사용합니다. ELISA를 위한 작업 솔루션 이며 아무 희석이 필요 하다. 높은 산에 의해 가수분해, 후 노란색 제품 개발 하 고 405에서 측정 될 수 있다 nm. 효소 반응의 끝에, 우리는 간단히 96 잘 접시를 centrifuged 하 고 신선한 96 잘 접시 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 하는 상쾌한 전송. 우리는이 여분의 원심 분리 단계는 중요 한, 일관성 405에서 흡 광도의 증가 때문에 발견 nm, 아마도 효소 반응 동안 발생 가능한 정지 셀을 제거 하 여.
Biofilm 형성에 대 한 우리 보고6,21로 숙박 문화에 대 한 1: 100 (v/v) 희석의 200 μ 사용합니다. 이것은 다른 희석 (데이터 표시 되지 않음)에 비해 biofilm 형성 S. 구 균 에 대 한 최적의 희석 이다...

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)는 모두 간결한 및 진 핵 세포1편 표현 됩니다. 그것은 다른 분자 뉴클레오티드, 단백질, 알 카 로이드, 인산 에스테 르, 인산의 anhydrides 등에서 monophosphate의 가수분해를 촉매 수 있습니다. 인간에서는, 진 핵 ALP는 간, 뼈, 내장과 태 반2를 포함 하 여 많은 조직에 존재. 그것은 단백질 인 산화, 세포 성장, apoptosis, 줄기 세포 프로세스 뿐만 아니라 정상적인 골격 강화에 중요 한 역할을 한다. 진 핵 ALP는 또한 뼈, 간, 그리고 다른 조직/장기 상승 하는 때에 질병의 존재에 대 한 주요 혈 청 지표3,4.
간결한 ALP 토양8에서 대장균5, S. 구 균6,7 및 몇 가지 일반적인 제일 위 박테리아 등 세균성 세포의 다양 한에서 검색 되었습니다. 세균성 ALP 활동은 농약, 중 금속9 및 세균 오염10의 검출 바이오 센서로 사용 되었습니다. ALP의 제정 식 포도 상 구 균11 을 식별 하 고 Serratia Enterobacter12에서 차별화 하는 데 사용 되었습니다. 그것은 추가 제정 ALP 생산 포도 상 구 균13pathogenicity와 상관은 좋습니다. ALP 다른 설정3,4, 공부는 비록 아직 약간 biofilms 문화에 그것의 기능과 활동에 대 한 보고 됩니다.
Biofilm는 그것의 자유 롭 살아있는 세균성 세포 대응14에 비해 다르게 작동 세균성 생활을 문서화 되었습니다. S. 구 균, biofilm의 형성 다양 한 임상 조건 및 항 생 저항 및 만성 염증15,16에 대 한 계정에서에서 확인 되었습니다. 많은 분자 등 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질, biofilm 매트릭스에서 찾을 수 보고 왔다 하지만 biofilm 형성의 메커니즘은 완전히 이해14. Biofilm 형성에서 ALP의 역할을 이해 하려면 우리 미 균 biofilms 96 잘 조직 배양 접시에 배양 하 고 파라-nitrophenylphosphate (pNPP)를 사용 하 여 높은 산 활동 측정.
분자 pNPP 높은 산에 대 한 준비-사용 기판 이며 ALP 활동6,,1718측정에 널리 사용 되었습니다. 이 색도계 분석 결과 파라 nitrophenyl 인산 염 (pNPP)의 변환에 파라-nitrophenol 405에서 색된 제품의 결과를 기반으로 nm. 와 같은 agarose 젤 전기 이동 법19, 밀 세균 agglutinin (WGA) 강 수, WGA HPLC20이 분석 결과 매우 구체적인 다른 기존의 ALP 분석 결과에 비해, 민감한, 쉽게 재현, 그리고 가장 중요 한 것은, 허용 높은 처리량입니다.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 원심분리기</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluose</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 펠릿</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)에 자주 사용되는 pNPP 액체 기질의 일반적인 농도는 10 - 50mM 사이입니다. 여기에 사용된 것과 같이 대부분의 즉시 사용 가능한 pNPP 액체 기질과 유사하게, 정확한 pNPP 농도는 이의 독점적 특성으로 인해 공개되지 않습니다.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 소이 한천&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 소이 국물:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; g/L 카제인의 췌장 소화제............ 15.0 간장 식사의 파파익 다이제스트......... 5.00 염화나트륨.............................. 3.00 포도당........................................ &nbsp; 2.50 인산이칼륨.................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96 우물 조직 배양 플레이트</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>U자형 바닥</td></tr></tbody></table>

색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 s. 구 균 biofilm에서

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 간결한와 진 핵 세포에서 표현 하는 일반적인 효소 이다. 그것은 인산 염 monoesters 기본 pH에 많은 분자에서의 가수분해를 catalyzes 고 인산 대사에 필수적인 역할을 한다. 인간에서는, 진 핵 ALP cholestasis 구루병 등 다양 한 질병을 진단에 가장 자주 사용된 효소 신호 중 하나입니다. 미 에 균, ALP 세포 막;에 감지 되 그것은 또한 뿐만 아니라 분 비 양식으로 표현 된다. 그러나, 약간 biofilm 형성에서 기능에 대 한 알려져 있다.
이 원고의 목적은 단백질 격리를 필요로 하지 않는 미 균 biofilm에서 ALP 활동 측정을 신속 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과 개발 하는 것입니다. P-nitrophenyl 인산 염 (pNPP)를 사용 하 여 기판으로, 96-잘 조직 배양 배지에서 형성 된 미 균 biofilm에서 ALP 활동을 측정 했습니다. 활동은 405 nm 흡 광도 측정 성 반응 제품의 형성을 기반으로 합니다. 96 잘 조직 문화 접시 방법의 높은 처리량 자연 ALP 활동 분석에 대 한 과민 하 고 재현할 수 있는 방법을 제공합니다. 같은 실험 설정 또한 biofilm 형성에 관련 된 다른 세포 외 분자 마커 측정을 확장할 수 있습니다.

그림 1 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 의 biofilm 문화에서 ALP 활동의 대표적인 결과 보여 줍니다. 상업적으로 사용 가능한 pNPP 솔루션의 75 μ 각각 잘 하 고 실 온에서 incubated에 추가 되었습니다. 서로 다른 시간에 대 한 부 화 후 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분, 각각) 75 μ 5 M NaOH의 반응을 중지에 추가 되었습니다. 제품은 다음 405에서 96 잘 접시 리더에서 측정 되었다 nm. 각 시간 점에 단일 96 잘 접시에서 세 쌍둥이에 반복 되었다 그리고 전체 실험 3 개별 96 잘 접시에 반복 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59285...

이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법 설립

색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

이 프로토콜은 S.aureus 생물막 배양에서 알칼화 된 인산염 활성을 측정하는 쉽고 신뢰할 수있는 방법을 제시했다. 그것은 우리가 생물 막 형성에 ALP의 기능을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량입니다.그것은 매우 민감하고 수행하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 하퍼 칼리지의 전 학생 케빈 다니코프스키입니다. TSB를 준비하려면 카제인의 췌장 소화, 콩 식사의 교황 다이제스트, 염화 나트륨, 덱스트로스 및 디포타슘 인산염을 증류수에 추가하십시오.플라스크를 알루미늄 호일로 덮고 오토클레이브에 넣어 사용하기 전에 살균하십시오. TSA를 준비하려면 TSB에 한천을 추가하고 멸균을 위해 오토클레이브에 넣습니다. 그런 다음 실온으로 식힙니다.다음으로, 접시 당 20 밀리리터의 비율로 페트리 접시에 붓습니다. 생물막 배양 배지를 준비하려면, 리터당 10그램의 농도를 달성하기 위해 오토클레이브 TSB에 포도당을 첨가한다. 진공 여과 키트를 사용하여 0.2 마이크로미터 모공 크기의 필터로 용액을 여과합니다.접종을 하려면, 페트리 접시에서 Staph 아우레우스의 한 개별 식민지를 선택하고 TSB의 10 밀리리터로 가득 배양 튜브에 배치 하기 위해 살균 접종 루프를 사용 하 여. 인큐베이터에 튜브를 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 자랍니다. 마이크로피펫으로, 하룻밤 문화의 100 마이크로리터를 뽑고 1:100 부피 비율 희석을 위해 포도당으로 TSB의 10 밀리리터로 채워진 배양 튜브로 전송합니다.소용돌이는 부드럽게 혼합하여 일관된 농도를 제공합니다. 마이크로파이프를 사용하여 희석 배양 200마이크로리터를 96개의 웰 플레이트에서 총 18개의 우물로 옮기습니다. 생물막 형성을 위해 24 시간 동안 섭씨 37도에서 96 웰 플레이트를 배양하십시오.S.aureus의 최고의 생물 막 형성을 위해, 평면 또는 라운드 하단 96 웰 플레이트를 선택하는 것이 좋습니다. 그 후, 약간 각 우물의 가장자리에서 포부에 의해 상수에 의해 상수에 접시를 기울입니다. 1X PBS로 각 것을 잘 씻으시면 됩니다.원심분리기에 플레이트를 넣고 분당 8, 000 회전에서 5분 동안 회전하고 포부로 상수판을 장식합니다. 각 웰에 시판되는 PNPP로 구성된 버퍼링된 ALP 기판 75마이크로리터를 추가하고 타이머를 사용하여 트리플리케이트의 매 시간 지점을 기록합니다. 각 잠복 시점 후, 5개의 어금니 나트륨 수산화나트륨 75마이크로리터를 3개의 우물각각에 추가하여 반응을 멈춥춥시다.분당 800 회전에서 5 분 동안 접시를 원심 분리합니다. 파이펫을 사용하여 100 마이크로리터의 체온화를 새로운 96 웰 플레이트로 전송하여 칼로리 측정을 합니다. 96 웰 플레이트 리더기를 사용하여 405 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.30분 시간 점 유정을 사용하여 배경 노이즈를 제어합니다. 세 개의 96 웰 플레이트에서 전체 실험을 반복합니다. 이 프로토콜은 단백질 절연을 필요로하지 않는 S.aureus 생물막에서 ALP 활성을 측정하기 위해 빠르고 신뢰할 수있는 분석기를 개발한다.ALP 활동의 대표적인 결과는 최대 75분 동안 증가된 추세를 보여줍니다. 75분 후 ALP 활성의 증가가 관찰되지 않았다. 좋은 생물막 문화를 확립하는 것이 매우 중요하며 마스터하는 데 꽤 많은 시험이 필요할 수 있습니다.이전에 당사 와 다른 사람들이 보고한 것처럼 크리스탈 보라색 분석기를 수행하여 생물막 형성을 확인할 수 있거나 생물막 형성을 용이하게 하기 위해 인간 플라즈마로 플레이트를 사전 치료할 수 있습니다. 개발 후 생물막 형성을 방해할 수 있는 잠재적ALP 억제제를 검사할 수 있습니다. 그 결과 의료 분야의 생물막 관리에 중요한 정보를 제공할 것입니다.5개의 어금니 나트륨수산화나트륨은 접촉시 위험할 수 있습니다. 취급 시 개인 보호 장비를 착용하십시오.

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치아 표면에 형성 Biofilms는 매우 복잡하고 그들의 아키텍처를 조절 상수 타고난 및 외인성 환경 문제, 생리 및 transcriptome에 노출되어 있습니다. 우리는 조성, 구조 조직 및 biofilm 연구의 다른 분야에 적용할 수 있습니다 경구 biofilms의 유전자 발현을 검사하는 도구 상자를 개발했습니다.

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비색 분석을 이용한 박테리아 막 결합 피로포스파타제의 스크리닝 억제제 

출처: Tay, S. B. 외 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 병원성 박테리아에서 바이오필름 생체량을 정량화하는 방법을 시연하며, 처리되지 않은 대조군과 쿼럼 소환 효소로 처리된 샘플을 비교합니다. 이 효소는 초기 배양 과정에서 박테리아의 신호를 방해하여 세포 부착을 감소시킵니다. 세척 후 추가 배양 후 대조 우물은 밀도가 높은 바이오필름을 형성하는 반면, 처리된 우물은 형성이 감소합니다. 양이온염료를 사용해 바이오필름을 염색하고, 흡수도를 측정하여 생체량을 평가합니다.

병원성 박테리아에서 효소 유도 바이오필름 억제의 정량화

이 비디오는 호중구-생물막 상호 작용을 연구하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 생물막에 내장된 병원성 세균과 분리된 호중구는 형광 표지를 사용하여 태그를 지정하고, 호중구에 의한 면역 반응과 박테리아에 의한 면역 반응 회피를 형광 현미경을 사용하여 평가했습니다.

호중구와 생물막 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 체외 분석

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막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

대부분의 박테리아 감염은 생물막을 생성합니다. 환경 덕분에, 생물막 관련 박테리아는 종종 표현형 약물 내성을 가지고 있습니다. 따라서 생물막에서 박테리아를 죽이는 새로운 항균 분자는 최우선 순위입니다. 당사는 생물막을 박멸하는 데 효과적인 항균 화합물을 신속하게 스크리닝하기 위한 분석을 수립합니다.

바이오 필름 관련 타겟팅<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 사용 레사 주린 기반 약물 감수성 분석

이 원고는 황색 포도상구균 biofilm에 5-aminolevulinic 산-중재 photodynamic 치료 (PDT ALA)의 항균 효과 연구 하는 프로토콜을 설명 합니다. 미래에 PDT와 박테리아 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

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D11 scFv-알칼리성 포스파타제 융합 단백질 및 면역형광을 이용한 조직 내 이솔레부글란딘의 직접 검출

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인간 호중구와 황색포도상구균 생물막 사이의 상호작용을 시각화하고 정량화하기 위한 표준화된 체외 분석

학습하세요 S. aureus 바이오필름에서 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 정량화하는 고처리량 방법을. 96웰 플레이트를 사용한 이 기술은 민감하고 간편하여 바이오필름 형성에서 효소 기능 연구에 활용됩니다.

색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

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