색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

이 프로토콜은 S.aureus 생물막 배양에서 알칼화 된 인산염 활성을 측정하는 쉽고 신뢰할 수있는 방법을 제시했다. 그것은 우리가 생물 막 형성에 ALP의 기능을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량입니다.

그것은 매우 민감하고 수행하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 하퍼 칼리지의 전 학생 케빈 다니코프스키입니다. TSB를 준비하려면 카제인의 췌장 소화, 콩 식사의 교황 다이제스트, 염화 나트륨, 덱스트로스 및 디포타슘 인산염을 증류수에 추가하십시오.

플라스크를 알루미늄 호일로 덮고 오토클레이브에 넣어 사용하기 전에 살균하십시오. TSA를 준비하려면 TSB에 한천을 추가하고 멸균을 위해 오토클레이브에 넣습니다. 그런 다음 실온으로 식힙니다.

다음으로, 접시 당 20 밀리리터의 비율로 페트리 접시에 붓습니다. 생물막 배양 배지를 준비하려면, 리터당 10그램의 농도를 달성하기 위해 오토클레이브 TSB에 포도당을 첨가한다. 진공 여과 키트를 사용하여 0.2 마이크로미터 모공 크기의 필터로 용액을 여과합니다.

접종을 하려면, 페트리 접시에서 Staph 아우레우스의 한 개별 식민지를 선택하고 TSB의 10 밀리리터로 가득 배양 튜브에 배치 하기 위해 살균 접종 루프를 사용 하 여. 인큐베이터에 튜브를 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 자랍니다. 마이크로피펫으로, 하룻밤 문화의 100 마이크로리터를 뽑고 1:100 부피 비율 희석을 위해 포도당으로 TSB의 10 밀리리터로 채워진 배양 튜브로 전송합니다.

소용돌이는 부드럽게 혼합하여 일관된 농도를 제공합니다. 마이크로파이프를 사용하여 희석 배양 200마이크로리터를 96개의 웰 플레이트에서 총 18개의 우물로 옮기습니다. 생물막 형성을 위해 24 시간 동안 섭씨 37도에서 96 웰 플레이트를 배양하십시오.

S.aureus의 최고의 생물 막 형성을 위해, 평면 또는 라운드 하단 96 웰 플레이트를 선택하는 것이 좋습니다. 그 후, 약간 각 우물의 가장자리에서 포부에 의해 상수에 의해 상수에 접시를 기울입니다. 1X PBS로 각 것을 잘 씻으시면 됩니다.

원심분리기에 플레이트를 넣고 분당 8, 000 회전에서 5분 동안 회전하고 포부로 상수판을 장식합니다. 각 웰에 시판되는 PNPP로 구성된 버퍼링된 ALP 기판 75마이크로리터를 추가하고 타이머를 사용하여 트리플리케이트의 매 시간 지점을 기록합니다. 각 잠복 시점 후, 5개의 어금니 나트륨 수산화나트륨 75마이크로리터를 3개의 우물각각에 추가하여 반응을 멈춥춥시다.

분당 800 회전에서 5 분 동안 접시를 원심 분리합니다. 파이펫을 사용하여 100 마이크로리터의 체온화를 새로운 96 웰 플레이트로 전송하여 칼로리 측정을 합니다. 96 웰 플레이트 리더기를 사용하여 405 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.

30분 시간 점 유정을 사용하여 배경 노이즈를 제어합니다. 세 개의 96 웰 플레이트에서 전체 실험을 반복합니다. 이 프로토콜은 단백질 절연을 필요로하지 않는 S.aureus 생물막에서 ALP 활성을 측정하기 위해 빠르고 신뢰할 수있는 분석기를 개발한다.

ALP 활동의 대표적인 결과는 최대 75분 동안 증가된 추세를 보여줍니다. 75분 후 ALP 활성의 증가가 관찰되지 않았다. 좋은 생물막 문화를 확립하는 것이 매우 중요하며 마스터하는 데 꽤 많은 시험이 필요할 수 있습니다.

이전에 당사 와 다른 사람들이 보고한 것처럼 크리스탈 보라색 분석기를 수행하여 생물막 형성을 확인할 수 있거나 생물막 형성을 용이하게 하기 위해 인간 플라즈마로 플레이트를 사전 치료할 수 있습니다. 개발 후 생물막 형성을 방해할 수 있는 잠재적ALP 억제제를 검사할 수 있습니다. 그 결과 의료 분야의 생물막 관리에 중요한 정보를 제공할 것입니다.

5개의 어금니 나트륨수산화나트륨은 접촉시 위험할 수 있습니다. 취급 시 개인 보호 장비를 착용하십시오.