Name: 음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 학습하세요 내소포체 격리 키트를 수정하여 생쥐 간에서 지질 작은 물방울과 여러 세포 기관을 동시에 분리하는 방법을. 이 기술은 지질 대사 및 간 질환 연구에 중요한 진전을 제공합니다.

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우리 가족 암 Abramson 연구소 감사. 이 작품은 다음 교부 금에 의해 지원: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, 로버트 우드 존슨 재단, 해 롤 드 모스 의료 교수진 개발 상, 7158, IDOM DRC 조종사 상을 P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (제). 이 작품 일부 NIH P30-DK050306에 의해 지원 되었다 고 그 핵심 시설 (분자 병 리 및 이미징 코어, 분자 생물학/유전자 식 코어 및 셀 문화 코어)와 그 파일럿 프로그램을 부여 합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

모든 실험 biosafety 수준 1, 실험실 외 투, 안전 고글, 장갑, 등에 대 한 적절 한 개인 보호 장비와 실험실 벤치에서 실시 했다. 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 펜실베니아 대학에 의해 찬성 하는 프로토콜에 따라 수행 했다. 모든 노력, 동물 불편을 최소화 하 고 동물 인도적인 치료로 치료 했다.
1. LD 격리 응급실 격리 키트를 사용 하 여
<ol><li>
준비 참고: 나열 된 금액은 단일 1 g 마우스 간에 적합 합니다.<ol>
<li>초순의 8 mL와 5 x IE 버퍼의 2 개 mL를 희석 하 여 1 x isotonic 추출 버퍼 (IE 버퍼, 응급실 격리 키트에서) 10 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 버퍼를 냉각 하십시오.</li>
		<li>초순의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL를 diluting 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 100 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>Diluting 500 µ L PGPE의 초순 9.5 mL에 의해 5% 폴 리 에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-페 닐 에테르 (PGPE)의 10 mL를 준비 합니다. 1 mL 주사기를 사용 하 여 PGPE로 점성 측정. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>얼음에 그들을 배치 하 여 모든 튜브를 쿨: 1.7 mL microcentrifuge 튜브, 15 mL 원심 분리기 튜브, 50 mL 고속 원심 분리기 튜브, 및 13 mL ultracentrifuge 튜브.</li>
		<li>4 모든 필요한 원심 분리기 쿨 ° c: microcentrifuge, 15 ml 높은-용량 원심 분리기 튜브, 50 mL 튜브, 그리고는 ultracentrifuge에 대 한 고속 원심 분리기.</li>
		<li>압력가 마로 소독 하 여 집게 및 해 부가 위를 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직 준비
	<ol>
<li>자 궁 경부 전위를 수행 하 여 10 분 확인 안락사에 대 한 100% CO2 로 가득 챔버에 그것을 배치 하 여 마우스를 안락사.</li>
		<li>소독 집게와 해 부가 위, 복 부의 피부와 근육 층 간 노출 후부/앞 축에 잘라 사용 합니다.</li>
		<li>격 막 및 장 간 연결 하는 인 대를 잘라. 집게를 사용 하 여 노출 인 대는 후부 쪽으로 간에서 소장을.</li>
		<li>간 및 간 해방 때까지 후부 앞쪽에서 이동 등 흉 곽 간 절단.</li>
		<li>차가운 5 cm 감기 1 x PBS의 10 mL를 페 트리 접시에 간 전송.</li>
		<li>씻어 간 2 x 5 cm 배양 접시에에서 4 ° C에서 5 분에 대 한 차가운 1 x PBS의 10 mL에 락 플랫폼에. 최종 세척 후 1 x PBS에서 부 어.</li>
		<li>크기-10 메 마른 외과 블레이드를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 간 5 cm 배양 접시 (그림 1A)에서 3-5 밀리미터 조각으로 주사위를.</li>
		<li>세척 절단된 간 2 x 5 cm 배양 접시에에서 4 ° C에서 5 분에 대 한 차가운 1 x PBS의 10 mL와 함께. 참고: 리소좀 격리, 전송 간 0.5 g 깨끗 한 45 mL 균질 화기 및 리소좀 추출에 의해 제공 된 지시에 따라 키트 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>1 x PBS를 가만히 따르다와 찬 45 mL Dounce 균질 화기를 절단된 간 조각 전송. 모든 조각은 균질 화기의 하단에가 서 확인 합니다.</li>
		<li>감기 1 x IE 버퍼 (응급실 격리 kit)의 7 mL을 추가 하 고 20 x 위아래로 유 봉 이동 하 여 얼음에 균질. 유 봉이는 균질 화기의 하단에 각 뇌졸중 동안 확인 합니다.</li>
		<li>차가운 15 mL 원심 분리기 튜브를 homogenate (그림 1B)를 전송 합니다.</li>
		<li>감기 1 IE 버퍼 (응급실 격리 kit)에서 x의 1 mL와 함께 균질 화기를 헹 구 고는 homogenate의 나머지 부분을 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD 절연
	<ol>
<li>4 ° C (그림 1C)에서 10 분에 1000 x g 대용량 원심 분리기에 homogenate centrifuging 핵을 제거 합니다.</li>
		<li>새로운, 차가운 50 mL 원심 분리기 튜브 postnuclear 상쾌한 (PNS) 전송. LD 손실을 방지 하려면 15 mL 튜브의 상단에 모여 어떤 지질 PNS를 전송 하기 전에 resuspended을 확인 하십시오.</li>
		<li>100 µ L의 순도 분석 PNS aliquot 고 차가운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에. 그것은 얼음에 옆으로 설정 합니다.</li>
		<li>PNS 샘플, 하지는 약 수, 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 냉장된 고속 원심 분리기에 원심 미토 콘 드리 아를 제거 하려면<ol>
<li>옵션:: 원유 LD (CLD)와 (cytosol 세포 막 오염), 격리 유리 피 펫을 사용 하 여 최고의 지질 레이어를 수집 고 1.7 mL microcentrifuge 관에 그것을 전송. 1.4 섹션을 계속 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ultracentrifuge 튜브에 postmitochondrial 상쾌한 (PMS)를 전송 합니다. LD 손실을 방지 하려면 상단에 모여 어떤 지질은 PMS를 전송 하기 전에 resuspended는 확인 합니다.</li>
		<li>100 µ L의 순도 분석에 대 한 PMS aliquot 고 차가운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에. 그것은 얼음에 옆으로 설정 합니다.</li>
		<li>테두리에는 ultracentrifuge 튜브를 튜브 ultracentrifugation 중 붕괴를 방지 하기 위해 IE 버퍼 x 감기 1 채우십시오.</li>
		<li>샘플을 균형 그리고 100000 x g 4 ° c (그림 1D) 60 분에서 ultracentrifuge에 원심.</li>
		<li>LD 계층을 제거 하려면 45 ° 각도에서 튜브를 기울기 고 유리 피 펫을 사용 하 여 발음. 감기 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 펠 릿을 전송. 참고: 펠 릿에는 격리 된 응급실을 포함 되어 있습니다. 다운스트림이 분수를 사용 하 여 응급실 격리에 대 한.</li>
		<li>순도 분석에 대 한 지질 층 아래 게시물-응급실 상쾌한 (당) 100 µ L를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD 세척
	<ol>
<li>1.3 mL의 총 볼륨 1.7 microcentrifuge 튜브에 수집 된 LD 분수 1 x PBS를 추가 합니다.</li>
		<li>소용돌이 샘플입니다.</li>
		<li>펠 렛의 모든 세포 파편을 4 ° C에서 5 분 최고 속도로 microcentrifuge에서 원심. Resuspend LD 레이어 수 있도록 손으로 부드럽게 튜브를 따뜻한. 상쾌한, 지질 층의 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 포함 하 여 전송 합니다.</li>
		<li>반복 단계 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, 펠 릿은 더 이상 표시 될 때까지.</li>
		<li>1.5 mL의 최종 볼륨을 표면에 뜨는 펠 렛 무료 LD를 1 x PBS를 추가 합니다. 워시 microcentrifuge 4 ° c.에서 5 분 최고 속도로 원심 분리 하 여 지질 분수</li>
		<li>지질 층을 방해 하지 않고 유리 피 펫 사용 (지질 층) 아래 1 x PBS의 1 mL를 제거 합니다.</li>
		<li>1.4.6, 1.4.5 단계를 반복 4 x-5 x, 1x PBS 시각적으로 투명 없이 탁 될 때까지.</li>
		<li>모두 제거 유리 피 펫 (그림 1E)를 사용 하 여 지질 층 아래 1 x PBS.</li>
		<li>결과, 순수 LD 분수를 사용 하 여 다운스트림 분석에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bicinchoninic 산 분석 결과 의해 LD 단백질 정량 참고: 경우 LD 형태 평가 bicinchoninic 산 분석 결과 (BCA)를 사용 하지 마십시오.<ol>
<li>5 %PGPE 500 μ에서 LD를 resuspend.</li>
		<li>95 ° C에서 5 분에 대 한 샘플을 삶아 소용돌이 그들, 그리고 냉각 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>추가 2 x 1.5.2 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>30와 함께 5 분에 대 한 샘플을 sonicate s 온/오프 주기, 중간 강도.</li>
		<li>BCA 분석 결과 의해 모든 순도 분석 샘플 및 LD 분수 단백질 농도 측정 하 여 샘플을 정상화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. LD 격리 자당 밀도 그라디언트를 사용 하 여
<ol><li>
준비
	<ol>
<li>TE 버퍼 (10 mM Tris HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]) 200 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>100 mL를 최종 볼륨을 데리고 테 버퍼에 자당의 60 g을 용 해 하 여 테 버퍼에서 60% (w/v) 자당 솔루션의 100 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>60% 자당의 4 mL 테 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 여 40% (w/v) 자당 솔루션의 6 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>TE 버퍼의 3.5 mL에 60% 자당의 2.5 mL을 추가 하 여 25% (w/v) 자당 솔루션의 6 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>3.3 ml 테 버퍼의 60% 자당의 0.7 mL을 추가 하 여 10% (w/v) 자당 솔루션의 4 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 솔루션의 10 mL 테 버퍼의 10 mL를 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 1 개의 정제를 추가 하 여 확인 합니다.</li>
		<li>60% 자당 재고 솔루션 50 mL에 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 솔루션의 4 mL를 추가 하 여 조직 homogenate 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>TE 버퍼의 50 mL에 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 오버레이 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>초순의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL를 희석 하 여 1 x PBS의 100 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>5%의 10 mL를 준비 diluting 500 µ L PGPE의 초순 9.5 mL에 의해 PGPE. 1 mL 주사기를 사용 하 여 PGPE로 점성 측정. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.</li>
		<li>얼음에 그들을 배치 하 여 다음 원심 분리기 튜브를 쿨: 1.7 mL microcentrifuge 튜브, 15 mL 원심 분리기 튜브, 50 mL 고속 원심 분리기 튜브, 및 13 mL ultracentrifuge 튜브.</li>
		<li>4 필요한 원심 분리기 쿨 ° c: microcentrifuge는, (15 mL 튜브)에 대 한 높은-용량 원심 분리기, 고속 원심 분리기 (50 mL), 튜브에 대 한 및는 ultracentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직 준비
	<ol>
<li>단계 1.2.1–1.2.9를 사용 하 여 조직 균질에 대 한 준비.</li>
		<li>차가운 조직 homogenate 버퍼의 7 mL을 추가 하 고 20 x 위아래로 유 봉 이동 하 여 그것을 얼음에 균질. 처음 다섯 스트로크 동안는 유 봉이는 균질 화기의 하단을 확인 하십시오.</li>
		<li>감기 15ml 원심 관에는 homogenate를 전송 합니다.</li>
		<li>차가운 조직 homogenate 버퍼의 1 mL와 함께 균질 화기를 헹 구 고 이전에 사용한 15ml 원심 관에 그것을 전송.</li>
		<li>homogenate의 볼륨을가지고 조직 homogenate 버퍼와 최대 10 mL.</li>
		<li>샘플 4 ° c.에서 10 분에 1000 x g 대용량 원심 분리기에 원심</li>
		<li>상쾌한 8 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송.</li>
		<li>PNS 순도 분석에 대 한 샘플으로 나머지 상쾌한의 100 µ L를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
자당 기온 변화도
	<ol>
<li>포함 된 45 ° 각도로 PNS의 8 mL 50 mL 원심 분리기 튜브 기울기. 신중 하 게 두 단계를 별도 유지를 보장 하는 40% 자당 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>비슷한 패션에 천천히 추가 25% 자당 해결책; 6 mL 그런 다음 추가 4 mL의 10% 자당 해결책; 마지막으로, 오버레이 버퍼의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>샘플 30 분에서 4 ° C에서 30000 x g 고속 원심 분리기에 원심</li>
		<li>1.7 mL microcentrifuge 튜브에 LDs를 포함 하는 상위 계층을 전송 합니다.</li>
		<li>LD 세척 1.4 절의 단계를 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
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<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
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</ol>

닥터 카 가로채 제약에서 연구 지원을 받습니다.

간장 LD 생물학은 점점 건강 및 질병에 간세포 생리학의 중요 한 레 귤 레이 터로 인식 되 고 있습니다. 타고 난 세포로 LDs는 동적와 상호 작용 다른 세포 구조, 지질 및 포도 당 항상성에서 포함 된 그들 bioactive 구성 요소에서 포함. 자당 그라데이션 LD 격리 일상적으로 사용 하 고 LD 구조, 연구 조사를 가능 하 게 하지만 그것은 수많은 버퍼를 만들기 위해 그들을 요구 한다. 우리는 증명 하고있다 상용 ER 격리 키트의 사용 뿐만 아니라 LD 격리 하지만 응급실의 리소좀, 탠덤 격리에 대 한 사용할 수 있는 다른 도구는 세포 역학 변화에 대 한 응답의 더 포괄적인 보기 허용 실험 조건, 워크플로 크게 증가 하지 않고입니다.
이 새로운 프로토콜의 힘은 상업적으로 사용 하 여 설치 또는 쉽게 사용할 수 있는 시 약 및 그것의 능력을 동시에 여러 세포를 분리의 용이성 이다. 그러나, 명심할 것이 새로운 방법에 잠재적인 단점이 있다. 이 프로토콜의 여러 단계 간에서 ...

LDs는 생리 세포 가장 진 핵 세포의 cytosol 그리고 어떤 prokaryotic 세포1,,23에서 발견. LD 코어 triglyceride (TG) 및 콜레스테롤 에스테 르와 같은 중립 지질으로 구성 된다. 그들은 또한 ceramides, 생리 활성 지질 세포 신호 통로4,5에 포함 되어 있습니다. LDs는 인지질 단층으로 둘러싸여 있으며 perilipin 단백질 perilipin 2 (PLIN2) 및 3 (PLIN3)1,,56을 포함 하 여 단백질 코팅. 또한 현재는 lipogenic 효소, lipases, 그리고 무 알콜 지방 간 질환, C 형 간염3,5, 알코올 간 질환 등 여러 가지 간장 steatotic 질병에 연결 된 멤브레인 밀매 단백질 ,6,,78,,910.
LDs는 응급실의 외부 막에서 형성 새로 합성된 안내 무료 지방산 응급실 파생11에서 공급을 포함 하 고 생각 된다. 그러나, 그것은 알 수 없는 남아 여부 풀링된 지질 버드, 연결, 유지 또는 ER6,11, LDs 기술적으로 도전적인 응급실에서의 절연을 만드는에서 excised. 무료 지방산 에너지 생산 또는 막 합성 제공할 수 표면 lipases의 행동에 의해 LDs에서 해방 될 수 있습니다. 또한, LDs 무료 지방산12를 생산 하 고 규제 메커니즘으로 lipophagy를 통해 메시지를 저하 수 있습니다.
ER와 리소좀, 다른 세포는-미토 콘 드리 아, endosomes, peroxisomes, 원형질 막 등-는 LDs11의 가까운 협회에서 찾을 수 있습니다. 이 꽉 일부 다 처 제는 순수한 LD 추출 하기 어려운 있습니다. 그러나, 중립 지질 타고 난 낮은 밀도 원심 분리5를 통해의 이점을 취할 수 있습니다.
전통적으로, LDs는 자당 밀도 그라데이션1,,513를 사용 하 여 격리 되었습니다. 그러나, 이러한 방법은 하지 다른 세포를 격리 하기 위해 설계 되었습니다. 또한, 그들은 시 약의 시간이 걸리는 준비가 필요합니다. 이 프로토콜 적응 상용 ER 격리 (참조 테이블의 재료) LD 격리 수 있도록 키트. LD 격리 단계 추가 추출 버퍼는 키트에 의해 제공 된 사용 합니다. 또한, 프로토콜 또한 응급실 및 lysosomal 격리 LDs의 라이프 사이클의 보다 포괄적인 이미지에 대 한 수 있도록 동일한 샘플을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 이 새로운 방법의 유효성을 검사 하려면 우리는 LD 생산량, 형태, 크기, 및 순도 분석 결과. 우리는 여기에 제시 된 LD 격리에 대 한 자당 기온 변화도 활용 하 여 널리 사용 되는 프로토콜을 얻은 그 결과 비교 합니다.
우리는 10-에 12 주 된 사용, 물에 자유 접근을 16 h (LD 격리 동안 오전 9 시 오후 5 시에 식품 제거) 20 g 여성 C57BL/6 마우스 금식. 안내에 대 한 일반적인 수익률 0.6 mg/g 간 이며 LD 단백질, 그것은 0.25 mg/g 간. 이 SDS 페이지 ~ 10 immunoblots에 대 한 충분 한 자료를 제공합니다. 아래의 프로토콜 사용 시 약 및 적합 한 단일 1 g 간 프로토콜을 자세히 설명 합니다. 자당 그라데이션 격리 프로토콜 사토14 와 우15에서 적응 이다.

<table><tbody><tr><td>BioExpress Vortex Mixer</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>Vortex Mixer</td></tr><tr><td>Centrifuge 54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>냉장 카운터 마이크로 원심분리기 로터: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>원심분리기 Sorvall RC6 +</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC6+</td><td>냉장 고속 원심분리기 로터: F21S-8x50Y</td></tr><tr><td>원심분리기 Sorvall Legend RT+</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT +</td> <td>냉장 고용량 원심 분리기 로터 : 75006445 버킷 : 75006441</td></tr><tr><td>cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마 Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>프로테아제 억제제 정제</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td>초음파 처리 시스템</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td> <td>Wheaton</td><td>357546</td><td>사용 느슨한 유봉</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>소포체 분리 키트</td><td>시그마 알드리치</td><td>ER0100</td><td>ER 키트 추출: 포함: 등장성 추출 버퍼 5X 100 mL Hypotonic 추출 버퍼 10 mL 염화칼슘, 2.5 M 용액 5 mL OptiPrep 밀도 그라디언트 매체 100 mL 블런트 코 바늘 1개.</td></tr><tr><td>형광 여기용 외부 광원</td><td>Leica Leica</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>염산</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Inverted Modulating Contrast Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>조직 및 배양 세포용 리소좀 농축 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89839</td><td>리소좀 절연</td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Qimaging</td><td>QICAM fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K 초원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>초원심분리기 로터: SW41Ti</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 5cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Phosphatase Inhibior 정제</td></tr><tr><td>멸균 수술용 칼날 #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td>결정질/인증 ACS</td></tr><tr><td>트리글리세라이드 Liquicolor Kit</td><td>Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>비색 트리글리세라이드 키트</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-1</td><td>TE 버퍼</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔 바이오 시약</td><td>BP151-100</td><td>5%, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르, 단백질 용해 시약</td></tr><tr><td>초순수 EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>TE <td>버퍼용</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td></tr></tbody></table>

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

지질 작은 물방울 (LDs)는 가장 진 핵 어떤 prokaryotic 세포의 cytosol 내 생리 세포. LDs는 인지질과 단백질의 단층에 의해 쌌 다 중립 지질 구성 됩니다. 간장 LD 지질, ceramides, 및 단백질 등 간 steatosis의 원인이 여러 가지 질병에 연루 됩니다. 이전 방법 LD 격리에 대 한 설립 되었습니다, 하지만 그들은 시 약의 준비 시간이 필요 하 고 여러 subcellular 구획의 격리에 대 한 설계 되지 않았습니다. 우리 민 변, 바인딩과 그물 (응급실), 및 단일 마우스 간에서 리소좀의 격리 수 있도록 새로운 프로토콜을 확립 하고자 했다.
더, 여기에 제시 된 프로토콜에 사용 된 모든 시 약 상업적으로 사용할 수 있으며 LD 순수성을 희생 하지 않고 최소한의 시 약 준비 필요. 여기 우리가 비교 순 결, 형태학, 고 수율을 보여주는 데이터를이 새로운 프로토콜 표준 자당 그라데이션 프로토콜을 비교 제시. 또한, 우리가 격리 수 응급실과 같은 샘플을 사용 하 여 리소좀 형성 및 지질 및 그들의 관련 된 단백질의 세포내 유량으로 상세한 통찰력을 제공.

우리는 약 30 쥐에 어 키트 LD 격리를 수행 하 고 약 40 쥐에 자당 격리 프로토콜을 따르고 그 결과 비교. 보고 된 연구 결과 두 프로토콜에 대 한 전형적인입니다. 마우스는 LD 수율을 높이기 위해 물에 자유 접근에와 함께 하룻밤 금식 했다. 자당 기온 변화도 사용 하 여 LD 격리 응급실 키트 LD 격리 프로토콜와 병렬로 실행 되었습니다. PNS, PMS, 샘플 당, CLDs, 그리고 LDs 응급실 키트 LD 격리 프로토콜에 걸쳐 수집 했다. 자당 격리 프로토콜의 워크플로 제한 때문만 PNS와 LD 분리 수집 했다.
형광 현미경 검사 법에 대 한 격리 LDs의 50 µ L 100 µ M 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI)의 동등한 양으로 혼합 했다. 샘플 빛에서...

이 프로토콜 지질 작은 물방울 고립과 확고 바인딩과 그물 격리 키트를 사용 하 여 마우스 간에서 정화의 새로운 방법을 설정 합니다.

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

지질 방울 생물학에 대한 연구는 정화의 어려움에 의해 방해되고있다. 또한, 세포 지질 플럭스를 연구하려면 여러 세포기관의 동시 정화가 필요하며 현재 간단한 프로토콜을 사용할 수 없습니다. 이 기술의 주요 장점은 지질 방울 정제에 더 접근 할 수 있도록하는 것입니다.우리는 동시에 하나의 샘플에서 지질 방울, 폐증 망상 및 리소좀을 분리하기 위해 시판 가능한 키트를 수정했습니다. 간 지질 방울 축적은 진보적 인 간 질환에 비만과 알코올 환자를 걸리기 쉽게. 이것은 불활성 저장 구획에서 역동적인 생물학적으로 중요한 세포기관으로 지질 방울의 보기를 옮겼습니다.시작하려면 멸균 집게와 해부 가위를 사용하여 후면 전방 축에서 안락사 마우스의 복부의 피부와 근육 층을 절단하여 간을 노출시하십시오. 내장에 간을 연결 하는 인대를 잘라. 집게를 사용하여 창자를 간에서 뒤쪽으로 끌어당깁니다.횡격막에 간을 연결하는 인대를 잘라. 그런 다음 간과 등간 흉곽 사이를 잘라 내고 앞쪽에서 후방으로 이동하여 간이 해방될 때까지 절단합니다. 감기 1x PBS10밀리리터로 차가운 5센티미터 페트리 접시에 간을 옮기고, 감기 10밀리리터의 10밀리리터에서 4°C에서 5분간 흔들기 플랫폼에서 간을 두 번 씻습니다.마지막 세척 후, 1x PBS를 부어, 접시 내에서 3 ~ 5 밀리미터 조각으로 간 을 주사위 크기 10 멸균 수술 블레이드를 사용합니다. 그런 다음, 4섭씨에서 5분간 10밀리리터의 감기 1x PBS로 다진 간을 두 번 씻는다. 1x PBS를 데치고, 다진 간 조각을 차가운 45밀리리터 Dounce 균질화제로 옮겨 모든 조각이 바닥에 있는지 확인합니다.차가운 1x IE 버퍼 7밀리리터를 추가합니다. 유봉을 위아래로 20번 이동하여 얼음에 균질화하여 각 스트로크 동안 유봉이 균질화의 바닥으로 이동하도록 합니다. 차가운 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 균모를 옮긴다.차가운 1x IE 버퍼의 1밀리리터로 균질화제를 헹구고 나머지 균질화에 추가합니다. 핵을 제거하기 위해, 원심 분리는 섭씨 4도에서 10 분 동안 1, 000 배 g에서 대용량 원심분리기에서 동형포를 원심분리합니다. LD 손실을 방지하기 위해 15 밀리리터 튜브 의 상단에 수집 된 지질이 다시 중단되었는지 확인하십시오.튜브 바닥에 핵 펠릿이 방해받지 않도록 하고, 지질 함유 후 핵 수퍼나탄을 신선한 차가운 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮춥시다. 나중에 순도 분석을 위해 얼음에 차가운 1.7 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 핵 후 상체의 100 마이크로 리터 알리쿼트. 미토콘드리아를 제거하기 위해 핵 후 상신전지 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000배의 냉장 된 고속 원심분리기에서 원심분리합니다.튜브 상단에 모인 지질이 LD 손실을 방지하기 위해 다시 중단되었는지 확인하고 미토콘드리아 후 상류체를 13 밀리리터 초센심분리기 튜브로 옮기십시오. 미토콘드리아 후 상체의 100 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 얼음에 차가운 1.7밀리리터 미세원심분리기 튜브로 전달하여 나중에 순도 분석을 한다. 초원심분리기 튜브를 미토콘드리아 후 상퍼로 차가운 1x IE 버퍼로 가장자리에 채우고 초원심 분리 중에 붕괴되는 것을 방지합니다.샘플을 균형, 다음 초원심 분리기에서 원심 분리기 100, 000 시간 g에 60 섭씨에서 60 분. LD 층을 제거하려면 튜브를 45도 각도로 기울이고 유리 파이펫으로 흡입합니다. 펠릿을 차가운 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮김한 후 순도 분석을 위해 지질 층 하에서 ER 후 퍼네티드 100마이크로리터를 수집한다.모든 세포 파편을 펠렛하기 위해, 섭씨 4도에서 5 분 동안 최고 속도로 미세 원심 분리기에서 원심분리기. 그런 다음, LD 층을 다시 중단하는 데 도움이 손으로 튜브를 부드럽게 따뜻하게하고, 새로운 1.7 밀리리터 미세 센실리후체 튜브로 지질 층을 포함한 상체를 전송합니다. 펠릿이 더 이상 보이지 않게 될 때까지 튜브를 2~3회 따뜻하게 하면서 이러한 세척 단계를 반복합니다.그런 다음 펠릿이없는 LD 수퍼나탄을 세척하려면 1.5 밀리리터의 최종 볼륨에 1x PBS를 추가하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 최고 속도로 미세 원심 분리기에 원심 분리기를 넣습니다. 유리 파이펫을 사용하여 지질 층을 방해하지 않고 지질 층 아래에있는 1 x PBS의 1 밀리리터를 제거하십시오. 1x PBS가 탁도 없이 시각적으로 투명할 때까지 LD 세척을 4~5회 반복합니다.그런 다음 유리 파이펫을 사용하여 지질 층 아래의 모든 1x PBS를 제거하고 다운스트림 분석을 위해 생성된 순수 LD 분획을 사용합니다. 대표적인 20x 형광 및 브라이트필드 LD 이미지가 ER 키트 LD 절연 및 자당 LD 격리 방법 모두에서 촬영되었을 때, 그들은 유사한 수준의 미립자 물질을 밝혀 두 개의 서로 다른 프로토콜을 사용하여 유사한 순수성을 시사합니다. 정제에 이어, LD 트리글리세라이드 및 단백질 수준은 색소측정을 사용하여 측정되었고, 데이터는 간 체중으로 정상화되었고, 시작 물질이 정상화될 때, LD 트리글리세라이드 및 단백질 수율은 ER 키트 및 자당 방법을 사용하여 유사했다.LD 직경은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화되었으며, ER 키트 LD 절연 및 자당 LD 절연이 유사한 크기의 LD를 산출한 것을 보여 주었다. LD 순도를 평가하기 위해, 샘플은 면역 blotting에 의해 분석되었다, ER 키트 LD 절연 및 자당 그라데이션 프로토콜모두에서 파생 된 LD가 모두 동일한 순도를 가지고 있음을 보여. PLIN2, LD 마커, ER 키트 LD 절연 PER 및 자당의 PNS를 제외한 모든 샘플에서 검출되었다.면역 blot를 사용하여 ER 분획의 순도 분석은 LD 마커 PLIN2의 자유롭지만 ER SEC61A 단백질의 중요한 수준을 가졌다는 것을 보여줍니다. 리소솜 농축 키트를 이용한 리소좀의 추가 정화 후 리소솜 분획의 순도도 도 평가되었다. 디스커버리는 현재 프로토콜의 가장 유용한 응용 프로그램입니다.우리는 정제 된 세포기관에서 지질학을 수행하고, 리포톡신은 알코올 성 간 질환의 지질 방울에서 특히 증가하는 것으로 나타났다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 지원되는 지질 이중층(SLB)에서 자연살해(NK) 세포의 면역학적 시냅스 형성을 시각화하는 기술을 보여줍니다. SLB는 먼저 형광단 표지된 NK 세포 활성화 수용체 리간드로 표지된 다음 NK 세포로 배양합니다. 그 후, 세포는 중합된 액틴 및 퍼포린 양성 용해 과립을 위해 염색됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용하여 시냅스 형성을 시각화할 수 있습니다.

지원되는 지질 이중층에서 NK 세포 면역학적 시냅스 형성의 초고해상도 이미징

패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

이 프로토콜은 고밀도 지단백질 small RNA의 분리 및 정량화를 설명합니다.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

지방파지(Lipophagy)는 지질 방울의 분해를 포함하는 선택적 형태의 자가포식입니다. 이 과정의 기능 장애는 암 발병과 관련이 있습니다. 그러나 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 자가포식, 지질 대사 및 암 진행 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위한 정량적 이미징 접근 방식을 설명합니다.

Lipophagy를 통한 지질 방울 이화작용의 조절 탐구

학습하세요 내소포체 격리 키트를 수정하여 생쥐 간에서 지질 작은 물방울과 여러 세포 기관을 동시에 분리하는 방법을. 이 기술은 지질 대사 및 간 질환 연구에 중요한 진전을 제공합니다.

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

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