Name: 유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 마우스 유방 땀샘 유래 오가노이드를 이용한 방사선이 종양 세포 모집에 미치는 영향 분석 방법입니다. 이 기법은 삼중음성유방암 재발 메커니즘 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 GFP와 dTomato 표지 된 원시 264.7 대 식 세포를 제공 하는 닥터로 라 l. 브 론 사르 감사 합니다. 이 연구는 재정적으로 NIH 그랜트 #R00CA201304에 의해 지원 되었다.

동물 연구는 밴 더 빌 트 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 제도적 지침 및 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.
1. 쥐 및 세포 취득의 준비 (응 우 옌-옥 외11)
<ol><li>아 티 믹 Nu/Nu 마우스 (8-10 주)를 희생 하 여 자 궁 경부 탈 구가 이어지는 co2 질 식 사용. 70% 에탄올을 사용 하 여 피부를 청소 합니다.</li>
	<li>사전 멸 균 된가 위 및 집게를 사용 하 여 쥐에서 복 부 및 사 타 구니 유 방 동맥을 절제 하십시오. 절제술 전에 림프절을 제거 하십시오. 멸 균 된 1x 인산 완충 식 염 수가 (도 1a)로 헹 궈 냅니다.</li>
	<li>Dulbecco의 변성이 글 미디어/영양 혼합물 10ML(DMEM/F12)를 사용 하 여 15 mL 튜브에 넣고 운반 하십시오. 샘플은 4°c에서 밤새 보관 하거나 즉시 처리 될 수 있다. 얼음을 계속.</li>
	<li>세 슘 소스를 사용 하 여 20gy에서 샘플을 조사 합니다 (그림 1b).</li>
	<li>조사 후 45 분이 지나면 유 방 땀 샘을 35 mm의 멸 균 셀 플레이트에 놓고 scalpels를 사용 하 여 다진에 놓습니다 (그림 1c, D). 약 40 획이 있는 mince는 조직이 이완 되 고 조각이 얻어질 때까지 약 1mm2 의 지역 보다 크지 않습니다.</li>
	<li>50 mL 원심 분리기 튜브에 콜라 게 나아 제 용액으로 옮깁니다. 콜라 게 나아 제 용액은 2mg/ml의 콜라 게 나아 제 ( 물질 표참조), 2mg/ml의 태아 소 혈 청 (FBS), 5 μ g/m l 인슐린 및 50 μ g/m l의 겐 타 마이 신을 DMEM/F12 배지에서 구성 하였다. 마우스 당 10ml의 콜라 게 나아 제 용액을 사용 하십시오.</li>
	<li>37 ° c의 수조에 넣고 10 분 간격으로 30-60 분 동안 볼 텍 싱 합니다. 콜라 게 나아 제 용액이 흐린 경우에는 소화가 완료 된다 (도 1e, F).</li>
	<li>실 온 (RT)에서 10 분 동안 450 x g 의 소화 용액을 아래로 돌립니다. 세 개의 레이어가 관찰 됩니다. 상기 상층 액은 지방으로 구성 되 고, 중간층은 수 용액 이며, 바닥은 펠 렛 이다. 펠 릿은 상피 세포, 개별 기질 세포 및 적혈구의 혼합물로 서 적색으로 나타난다 (그림 1g).</li>
	<li>접촉 하기 전에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 용액으로 모든 파이 펫, 피 펫 팁 및 원심 분리기 튜브를 미리 코팅 하십시오. BSA 솔루션은 Dulbecco의 인산 완충 식 염 액 (DPBS)에서 2.5% BSA로 구성 되어 있습니다. 사전 코팅을 위해, 단순히 다음 파이 펫 팁과 튜브의 내부에 BSA 솔루션을 제거 추가. BSA 솔루션을 재사용할 수 있습니다., 비록 그것은 각 실험 전에 멸 균 필터링 해야.</li>
	<li>추가 회복을 위해, 상층 액을 신선한 BSA 코팅 15 mL 튜브로 전달 하십시오. 위 아래로 적극적으로 지방 층을 분산 하는 파이 펫. RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 원심 분리기를 사용 하 여 상층 액을 흡입 하 여 세포 펠 렛을 흡입 하지 않도록 튜브에 소량의 배지를 남깁니다.</li>
	<li>원래 펠 릿 튜브에서 수성 층을 흡입.</li>
	<li>원래 펠 렛으로 튜브에 10ml의 DMEM를 넣고 두 번째 튜브로 이동 합니다. 파이 펫은 두 개의 펠 릿을 결합 하 고 소생 시킵니다.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 원심 분리기를 통해 상층 액을 흡입 하 고 튜브에 DMEM/F12를 추가 합니다.</li>
	<li>40 μ l (DNase)을 현 탁 액에 추가 하 고 deoxyribonuclease에서 2-5 분 동안 손으로 부드럽게 흔들어 DMEM/F12에서 4U/mL DNase로 구성 됩니다.</li>
	<li>DMEM/F12 및 파이 펫 6 mL을 철저히 추가 하십시오. RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 튜브를 원심 분리기.</li>
	<li>0.5 mL 마크에 상층 액을 흡입. 10ml의 DMEM 및 피 펫에 완전히 소생 시킵니다.</li>
	<li>450 x g 에 펄스를 하 고 그 속도에 도달 하면 4 초를 중지 합니다.</li>
	<li>1.16-1.17 단계를 3 회 더 반복 하 여 원심 분화를 통해 소기관을 정화 합니다. 펠 릿은 이제 상피 소기관 으로만 구성 된 오프 화이트 색상 이어야 합니다 (그림 1h). 참고: 유기 Oid는 멸 균 메시 40 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 할 수도 있습니다. 1.16 단계 후, 필터를 통해 유기 oid를 포함 하는 피 펫 배지를 원심 분리기 튜브에 넣고, 5 내지 10ml의 DMEM/F12 배지로 헹 궈 냅니다. 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브 위로 필터를 뒤집습니다. DMEM/F12 미디어 10ml를 통과 하 여 그 반대 방향으로 헹 궈 냅니다. 리 텐 테이 트는 오 르가 노이 드로 구성 되어야 하며, 여 액은 주로 폐기 되거나 원할 경우 보관할 수 있는 기질 세포로 구성 되어야 합니다.</li>
</ol>2. 밀도 및 도금 유기 oid 결정
<ol><li>10MlDMEM/F12에서의 소생 펠 렛. 완벽 하 게 균질 한 용액을 만듭니다.</li>
	<li>50 µ L을 30 mm 페 트리 디쉬로 전송 하 고, 위상차 현미경을 20x로 볼 수 있습니다. 집계 카운터를 사용 하 여 소기관 수를 셉니다. 참고: 여기에서 피 펫 팁은 457 μ m의 최소 지름과 함께 일관 되 게 사용 되었으며,이는 시드 된 소기관의 지름 5-10 배입니다. 2 mL 이상의 부피를 전송 하는 경우 (예: 1.16 및 2.1 단계), 팁 직경이 1500 μ m를 초과 하는 혈 청 피 펫을 사용 하십시오.</li>
	<li>다음 방정식을 사용 하 여 관 능 밀도를 계산 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59293/59293eq1.jpg"> 원하는 밀도는 1000 유기 체/m l은 추가 희석을 단순화 합니다. 밀도가 너무 낮으면, 5 분 동안 450 x g 에서 원심 분리 하 고 미디어를 흡 인 한다. 1000 유기 체/m l에 도달 하는 데 필요한 매체를 추가 하 고 균질 한 혼합물을 생성 하기 위해 피 펫을 철저히 합니다.<ol>
<li>단백질 매트릭스에서 오 르가 노이 드를 성장 시키기 위해, 콜라겐 유형 1에서 1 개의 세포/L의 농도로 씨앗 소기관을 87%로 희석 하 고, 엥 겔 브 스-홀 름-군단의 쥐 육 종에서 추출한 지 하 막에서 추출 하였다. 샘플로 작업 하는 동안 얼음을 유지 하십시오.</li>
		<li>소기관을 동결 하려면 원하는 체적을 별도의 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 450 x g 에서 5 분 동안 스핀 다운 하 여 미디어를 흡 기 한 다음 동일한 부피의 90% FBS을 추가 합니다. 유기 체를 소생 시킨 다음, 동결 튜브로 분해 합니다. -80 ˚ C로 이동한 다음 1 주일 이내에 액체 질소로 전송 합니다.</li>
		<li>해 동 하려면, 37 ˚ C 수 조에서 1 분간 따뜻하게 하 고, 5 분간 450 x g 에서 원심 분리 한 다음, 동결 매체를 흡 인 한다. 멸 균 된 DPBS로 헹 군 다음 다시 원심 분리기. DPBS를 흡입 하 고 소기관 매체를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피 펫 50 µ L (50 소기관)을 저 밀착 판의 각 웰에 투입 한다 (그림 1i).</li>
	<li>150의 µ L을 추가 하 여 총 작업 볼륨을 200 µ l. 유기 체 미디어는 DMEM/F12 미디어에서 1% 페니실린 streptomycin 및 1% 인슐린 트랜스 페 린 셀레늄으로 구성 됩니다.</li>
	<li>이틀 마다 미디어를 주의 해 서 교체 하십시오. 참고: 낮은 접착 판은 조직 배양 처리 되지 않습니다; 따라서, 세포는 쉽게 분리 될 수 있다. 플레이트를 기울여 각 웰의 가장자리에 파이 펫 팁을 삽입 하 여 미디어를 천천히 흡입 합니다. 우물의 바닥에 소량의 매체를 남겨 두십시오. 새 미디어를 천천히 추가 하 여 유기 체에 불필요 한 전단 력을 적용 하지 않도록 합니다.</li>
</ol>3. 대 식 세포와의 공동 배양
<ol><li>10% FBS 및 1% 페니실린 streptomycin로 보충 되는 DMEM 매체에 있는 GFP 또는 dTomato-라벨링 된 원시 264.7 대 식 세포를 유지 하십시오. 종자 1 x 104×104 또는1 x 105 세포/ m l을 관 능 적 매체에 투입 한다.</li>
	<li>살아있는 세포 상 대조 및 형광 성 화상 진 찰을 사용 하 여 시간에 따른 대 식 세포 침투를 모니터링 합니다.</li>
</ol>4. 유기 oid의 면역 형광 염색
참고: 유기 Oid는 낮은 접착 웰에 얼룩이 있거나 챔버 슬라이드로 옮길 수 있습니다. 전달 하려면, 유기 체를 접시에서 분리할 때까지 부드럽게 발라 주세요. 챔버 슬라이드에 전송 하 고 4-8 h에 대 한 배양을 통해 유기 oid가 플레이트 표면에 부착 되도록 합니다.
<ol><li>조심 스럽게 흡입 하 여 우물에서 소기관 매체를 제거 합니다. RT에서 15 분 동안 10% 중성 완충 포 르 말린으로 샘플을 수정 합니다.</li>
	<li>PBS 1 개에서 3x 5 분을 씻으십시오. 원하는 경우, 고정 된 샘플은 추가 염색을 위해 1 주일 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>5 분 동안 0.1%의 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜과의 투과와 Tetramethylbutyl. 참고: 액 틴에 대 한 얼룩을 위해 phalloidin 희석 1:1000 및 1.67 nM의 비 벤 제 이미 드 핵 염료를 RT에서 1 시간 동안 1% PBS/BSA에서 시료를 배양 합니다. 그런 다음 4.8 단계로 진행 합니다.</li>
	<li>0.5 PBS와의 가용성. 샘플은 4opy 이미지와 면역 형광 이미지에 저장할 수 있습니다. 0.1%의 정상 염소 혈 청으로 CTC rlock에 기여 하는 기계 장치 RT에서 1 시간 동안 pbs/폴 리 에틸렌 글리콜 소 르 비 탄 monolaurate (PBST)를 사용 하 여 3 ~ 5 분.</li>
	<li>항 사이토 케 라틴 (14) 희석, 전자 Cadherin 희석 1:200 또는 타이트 접합 단백질을 RT에서 1 시간 동안 PBST에서 1% NGS로 희석 1:100을 사용 하 여 PBST에서 3x 5 분간 씻으십시오.</li>
	<li>RT에서 1 시간 동안 1% NGS/PBST의 염소 반 토끼 2 차 희석 1:200으로 배양 합니다. 빛 노출을 피하기 위해 호 일 커버.</li>
	<li>PBS에서 3 배 5 분간 씻으십시오. 핵 염료 ( 재료 표참조)를 사용 하 여 핵 염색을 합니다.</li>
	<li>PBS에서 3 배 5 분간 씻으십시오. 챔버 슬라이드를 사용 하는 경우 커버 슬립으로 장착 하십시오. 4 ° c에서 최대 2 주 동안 포 일에 싸서 보관 하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

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이 프로토콜에서, 우리는 조사 된 유 방 유기 체의 성장 및 특성화를 재현 하기 위한 방법을 개발 했습니다 (그림 1). 20gy의 조사 량은 종양 세포 모집5의 생체 내 모델 이전에 거울에 적용 되었다. 유 방 땀 샘의 조사는 생체 내 형성 이전에 면역 세포의 상응 하는 침 윤 없이 방사선 손상 효과의 분리를 허용 하였다. 시험관 내 조사 된 정상 조직 모델의 개발은 방사선 유도 CTC 모집11,12에 기여할 수 있는 세포 상호작용의 실시간 시청을 가능 하 게 한다.
오 관 능 수율을 극대화 하기 위해 1.5-1.18 단계를 밀접 하 게 수행 하는 것이 중요 했습니다. 우리는 소화 용액에 농축 된 콜라 게 나아 제를 해 동 하는 것을 추가 했습니다. 농축 된 콜라 게 나아 제 분...

삼중 음성 유방암 (TNBC)의 약 60% 환자는 치료1의 한 형태로 서 유 방 보존 요법 (bct)을 선택 한다. 이러한 치료 양상에서, 유 방 조직의 일부를 포함 하는 종양은 제거 되 고, 주변 정상 조직은 잔류 종양 세포를 죽이기 위해 이온화 방사선에 노출 된다. 치료는 유방암 인구의 다량에 있는 재발을 감소 시킵니다; 그러나 TNBC를 사용한 치료 대상 환자의 약 13.5%가 locoregional 재발2를 경험 한다. 따라서, 방사선은 순환 종양 세포를 모집 할 수 있는 방법을 연구 (ctcs) 로컬 재발에 대 한 중요 한 통찰력으로 이어질 것입니다3,4.
이전 작업에서는 정상 조직의 방사선이 다양 한 세포 유형5의 모집을 증가 시킨다는 것을 보여주었습니다. TNBC의 전 임상 모델에서 정상 조직에 대 한 대 식 세포 증가 및 후속 적 종양 세포의 조사는 정상 조직5에 관한 것 이다. 면역 상태는 조사 된 사이트에 종양 세포 모집에 영향을 미쳤다, 종양 세포 이동은 면역 손상 된 과목에서 관찰. 유 방 땀 샘에서 파생 된 오 르가 노이 드를 사용 하 여 이러한 상호 작용은 현미경 및 살아있는 세포 이미징을 통해 실시간으로 세포 이동 및 세포 간 질 상호 작용을 관찰 하 여 변경 시 방사선 손상의 역할을 결정할 수 있습니다. 종양 세포 행동.
마우스 유 방 소기관은 유선의 발달에서 주요 단계를 명료 하 게 도왔습니다. 유 방 소기관은 50 μm6,7,9,10보다 큰 고립 된 유 방 상피의 다중 세포, 3 차원 구조입니다. 1 차적인 상피 소기관을 사용 하 여, 시 미안 외. 유선에서 분기에 필요한 요인을 평가7. 샤미르 외. 확산은 중간 엽 전이에 상피 없이 발생할 수 있음을 발견, 전이성 캐스케이드에 대 한 통찰력을 제공8. 유선 조직 으로부터 유기 oid를 생성 하 고 특성화 하는 방법은 잘 확립 되어 있다6,11,12,13. 그러나, 우리의 지식에, 유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체를 성장 시키는 방법은 보고 되지 않았습니다. 조사 된 오 르가 노이 드의 성장 및 특성화를 위한 프로토콜은 방사선-유도 면역 및 종양 세포 모집을 탈환 하는 중요 한 단계 일 것 이다.
이 논문에서, 우리는 구상 된 유 방 상피 소기관의 성장 및 특성화를 위한 방법을 보고 하며,이는 구형 oid의 형성을 지 원하는 친수성 고분자로 코팅 된 저 밀착 마이크로 플레이트입니다. 이들 유기 체는 면역 세포 침투 동역학을 조사 하기 위해 대 식 세포와 공동 배양 하였다. 이 작업은 종양-면역 세포 상호 작용을 연구 하기 위해 종양 세포 모집 및 CD8 + T 세포를 가시화 하기 위해 유 방 특성, 유방암 세포를 다시 캡처하는 지방 세포와의 공동 배양을 포함 하도록 확장 될 수 있다. 이전에 확립 된 프로토콜은 조사 된 유기 체를 평가 하는데 사용 될 수 있다. 이전 모델은 유 방 소기관 및 면역 세포를 공동 배양 하 여 전이 및 보급 메커니즘에 빛을 발산 했습니다. DeNardo et al. 종양 관련 대 식 세포의 CD4 + T 세포 규제가 유 방 암 종의 전이성 표현 형을 향상시켰다는 것을 발견 하였다. 공동 배양 모델은 또한 생물학적 개발의 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 사용 되었습니다. Plaks et al. 유선의 다운 조정기로 서 CD4 + T 세포의 역할을 명확히 했다15. 그러나, 우리 그룹은 정상 조직 조사가 면역 세포 행동에 미치는 영향을 시각화 하는 절차를 확립 하는 첫 번째입니다. 정상 조직 조사는 종양 세포 모집5를 강화 하는 것으로 나타났습니다 때문에,이 프로토콜은 종양 세포 행동이 정상 조직과 세포의 조사에 의해 변경 되는 방법을 분석 하기 위해 추가로 개발 될 수 있기 때문에, 더 큰 이해를 선도 암 재발.

<table><tbody><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>항시토케라틴 14</td><td>abcam</td><td>ab181595</td><td>로트: GR3200524-3</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I</td><td>코닝</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐 분해 효소, 유형 VIII</td><td>시그마</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermofisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin</td><td>세포 신호</td><td>전달 24E10</td><td>Lot : 13</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 보조</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td>green 로트: GR3203000-1</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 보조</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>red 로트: GR3192711-1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>로트: TG2611041</td></tr><tr><td>인슐린(10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>i9278</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄, 100x</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane (Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종에서 추출한 기저막)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclon Sphera 96 well plates</td><td>Thermo</td><td>174927</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>10128-856</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Phalloidin</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>Lot: GR3214582-16</td></tr><tr><td>Tight Junction Protein 1</td><td>Novus</td><td>NBP1-85047</td><td>Lot: C115428</td></tr><tr><td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트)</td><td>시그마</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

소화 조직 으로부터 유래 된 오 르가 노이 드는 세포 단층 보다 생체 내 조건에서 더 잘 탈환 되는 다중 세포 3 차원 (3d) 구조 이다. 비록 그들은 완전히 생체의 복잡성을 모델링할 수 없습니다., 그들은 원래 장기의 일부 기능을 유지. 암 모델에서, 오 르가 노이 드는 일반적으로 종양 세포의 침략을 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 정상 조직에서 방사선 반응을 평가 하기 위해 정상 및 조사 된 마우스 유선 조직에서 유기 체를 개발 하 고 특성화 하는 것을 목표로 합니다. 이러한 유기 oid는 방사선 조사 된 소기관과의 종양 세포 상호작용을 평가 하기 위해 미래의 시험관 내 암 연구에 적용 될 수 있다. 유 방 땀 샘은 절제 되었고, 20 Gy에 조사 되었으며, 콜라 게 나아 제 VIII 용액으로 소화 되었습니다. 상피 소기관은 원심 분화를 통해 분리 되었고, 3 차원 유기 체는 96-잘 저 접착 마이크로 플레이트에서 개발 되었다. 유기 oid는 특징적인 상피 마커 사이토 케 라틴 (14)을 발현 시켰다. 대 식 세포와 소기관 간의 상호작용은 공동 배양 실험에서 관찰 되었다. 이 모형은 종양 간 질 상호 작용, 면역 세포의 침 윤 및 조사 된 미세 환경 내에서의 대 식 세포 분극을 연구 하는 데 유용할 수 있습니다.

조사 된 상피 유선 유기 체는 마우스 유 방 땀 샘에서 성공적으로 장악 되 고, 처리 되 고, 저 접착 판에서 배양 되었습니다 (그림 1). 오 르가 노이 드 수율은 상이한 성장 환경에서 시 딩에 의해 시험 되었다 (도 2Ag). 10 cm 세포 판을 처리 한 조직 배양 물에 직접 세포를 파 종 하는 것은 섬유 아 세포의 자라 난을 산출 했습니다. 섬유 아 세포는 유기 체와 같은 초점의 동일 평면에 또는 가까운 상 대조 현미경에서 확인 되 고, 그들은 며칠 안에 도금 된 소기관에서 빨리 성장 했습니다. 섬유 아 세포의 성장 또한 지 하 막 및 콜라겐 단백질 매트릭스에서 소기관 될 때 관찰 되었다 (도 2e, F).
조사 된 소기관 성장을 최적화 하기 위해 다양 한 조건이 테스트 되었습니다 (그림 2h). 콜라 게 ...

마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

이 프로토콜은 이온화 방사선이 종양 세포 모집에 어떻게 영향을 미치는지 분석하기 위하여 이용되고 추가 개발될 수 있습니다, 암 재발의 더 중대한 이해로 이끌어 내는. 유방 오르가노이드는 강력한 모델입니다. 그들은 생체 내 특성의 기본을 모방하지만 생물학적 변수를 쉽게 분리 할 수 있습니다.저유착판의 사용은 단백질 행렬과 관련된 작업 흐름 문제를 무효화합니다. 삼중 음성 유방암 환자는 치료 다음 높은 비율로 지역 재발을 경험합니다. 방사선이 종양과 면역 세포 행동에 어떻게 영향을 미치는지 연구하면 재발 메커니즘에 대한 중요한 통찰력이 발생할 수 있습니다.오르가노이드의 공초점 현미경 검사를 시연하는 것은 실버라 바티스타 연구소의 대학원생인 하비에르 고메즈입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 희생된 마우스에서 복부 및 잉게인 유방 선지를 제거하는 이 절차를 시작합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 시료를 조사한 후 45분 후, 35mm 멸균 세포판에 매머 땀샘을 놓고 메스를 가진 다진다.조직이 이완하고 지역에서 약 1 평방 밀리미터보다 크지 않은 조각을 얻을 때까지 약 40 스트로크를 가진 다진. 이제 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 콜라게나제 용액으로 조직을 전달합니다. 마우스당 콜라게나아제 용액 10밀리리터를 사용하십시오.샘플 튜브를 30~60분간 섭씨 37도에 놓고 10분마다 5초 동안 소용돌이를 피합니다. 콜라게나아제 용액이 흐리면 소화가 완료됩니다. 소화된 용액을 450회-G에서 실온에서 10분간 회전시보시면 됩니다.이제 세 개의 레이어가 관찰됩니다. 상체는 지방으로 구성되며, 중간 층은 수성 용액이며, 바닥은 펠릿이다. 펠릿은 상피 세포, 개별 기질 세포 및 적혈구의 혼합물이기 때문에 빨간색으로 나타납니다.BSA 용액을 추가 및 제거하여 접촉하기 전에 BSA 솔루션으로 모든 파이펫, 파이펫 팁 및 원심분리기 튜브를 미리 코팅합니다. BSA 용액은 각 실험 전에 멸균 필터링해야하지만 재사용할 수 있습니다. 추가 복구를 위해 상체를 신선한 BSA 코팅 15 밀리리터 튜브로 옮길 수 있습니다.피펫은 지방 층을 분산시키기 위해 힘차게 위아래로 합니다. 원심 분리는 실온에서 10 분 동안 450 배-G에서 샘플을 원심 분리합니다. 셀 펠릿을 흡입하지 않도록 튜브에 소량의 미디어를 남기며, 초퍼를 흡인한다.이제 원래 펠릿으로 튜브에서 수성 층을 흡인합니다. 원래 펠릿으로 튜브에 DMEM/F12 10 밀리리터를 추가하고 두 번째 튜브로 옮습니다. 파이펫은 두 개의 펠릿을 결합하고 재중단하기 위해 적극적으로 결합합니다.실온에서 10분 동안 450배-G에서 원심분리한 후, 슈퍼나탄을 흡인시키고 튜브에 DMEM/F12 4밀리리터를 추가합니다. 서스펜션에 40 마이크로리터를 넣고 실온에서 2~5분 동안 손으로 부드럽게 흔들어 줍니다. DMEM/F12의 6밀리리터와 파이펫을 철저히 추가합니다.실온에서 10분 동안 450회-G에서 튜브를 원심분리한 후, 슈퍼너처를 0.5밀리리터 마크로 흡인시합니다. DMEM/F12의 10 밀리리터와 파이펫으로 펠릿을 완전히 재놓습니다. 이제 450회-G로 맥동하고 그 속도에 도달한 후 4초 간 정지하여 튜브를 원심분리합니다.원심 분화를 통해 오르가노이드를 정화하기 위해 세정 단계를 세 번 더 반복하십시오. 펠릿은 이제 상피 오르가노이드로만 구성된 오프 화이트 컬러여야 합니다. DMEM/F12의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.파이펫을 철저히 만들어 균일한 용액을 만듭니다. 50 마이크로리터를 30mm 페트리 접시로 옮기고 20X의 위상 대비 현미경으로 볼 수 있습니다. 집계 카운터가 있는 오르가노이드 의 수를 계산합니다.파이펫 50 마이크로리터의 오가노이드는 저접착 플레이트의 각 우물에 넣습니다. 150 마이크로리터의 오구노이드 배지를 추가하여 총 작업량을 200 마이크로리터에 넣습니다. 2일마다 배지를 조심스럽게 교체하십시오.DMEM 미디어에서 GFP 또는 D-토마토 라벨이 부착된 생 264.7대식세포를 10%FPS와 1%페니실린-연쇄 절제술으로 보충합니다. 원하는 밀도에서 세포를 오르가노이드 배지로 시드합니다. 라이브 세포 상 대비 및 형광 이미징을 사용하여 시간이 지남에 따라 대식세포 침투를 모니터링합니다.조심스럽게 흡입하여 우물에서 오르간성 배지를 제거합니다. 실온에서 10% 중성 버퍼링 된 포르말린으로 샘플을 수정합니다. 고정 된 오르가노이드를 1X PBS에서 5 분 동안 세 번 씻으세요.원하는 경우 고정 시료를 1주일 동안 섭씨 4도에 보관하여 염색할 수 있습니다. 세척 후 고정 된 오르가노이드를 5 분 동안 투약하십시오. PBS로 5분 동안 3회 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 0.1%PBST로 고정 된 오가노이드를 차단하십시오.고정 된 오르가노이드를 항 사이토케라틴-14, E-cadherin 또는 단단한 접합 단백질 1개를 PBST에서 1%NGS로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST에서 5 분간 세 번 씻습니다. 이제 상온에서 1 시간 동안 1 %NGS PBST와 염소 안티 래빗 이차 항체와 오르가노이드를 배양.광 노출을 피하기 위해 호일로 덮습니다. 이전과 같이 세척 한 후 핵염을 약 반 시간 동안 염색하기 위해 핵염을 사용하십시오. 스테인드 오르가노이드를 PBS에서 3회 5분간 씻습니다.챔버 슬라이드를 사용하는 경우 커버 슬립으로 마운트하십시오. 최대 2 주 동안 섭씨 4도에 호일에 싸여 오르가노이드를 저장합니다. 조사된 오르가노이드는 저접착 플레이트 또는 지하 막 내에서 배양될 수 있지만, 가장 빠른 성장은 저유착판에서 발생하였다.오르가노이드는 유방 선특성을 재구성했습니다. 덕트 및 로브와 형태학적으로 유사한 구조가 관찰되었다. 성장 동향은 오르가노이드가 소화 및 정렬 후 즉시 시드되었을 때, 비 조사 된 오르가노이드가 DNA 손상 수리 메커니즘으로 인한 세포 성장 체포로 인해 조사 된 오르가노이드보다 빠르게 성장했다고 지적했습니다.오르가노이드는 면역 형광 염색을 통해 평가된 상피 특성을 발현했습니다. 조사된 오르가노이드는 상피 마커를 발현했습니다. 심근의 마커인 세포근-14는 조사된 오르가노이드의 표면에 강하게 표현되었다.또한, E-cadherin 및 단단한 접합 단백질 하나는 오르가노이드의 세포 접합 부당 내에서 발현되었다. 이 단백질은 적당한 세포 접착을 위해 필수적입니다. 조사 후, 오르가노이드는 그들의 상피 특성을 계속 유지했습니다.유기체의 형광 염색은 형광 현미경 검사를 사용하여 저접착 판 내에서 시각화 될 수 있습니다. 그러나, 가장 명확한 시각화는 공초점 현미경 검사를 통해 얻어졌다. 보정된 총 형광 강도는 배경을 빼고 오르가노이드 부위에 의해 정상화함으로써 계산되었다.96웰저접착 플레이트에서 성장하는 오르가노이드도 공동 배양 실험을 단순화하였다. 유방 선에서 전형적인 농도에서 씨를 뿌린 경우, 대식 세포 화는 조사 된 오르가노이드로 증가했습니다. 이 절차를 수행 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 오르가노이드를 과도하게 소화하지 않고 원심 분화를 적절하게 정화하는 것입니다.이 절차에 따라 추가 공동 배양 실험을 수행할 수 있습니다. 오르가노이드는 종양 세포, 다른 면역 세포 및 기질 세포와 함께 배양되어 재발과 관련된 조사 된 미세 환경을 재현 할 수 있습니다. 이 방법은 정상적인 조직 손상이 특히 면역 세포 역학에 미치는 영향을 평가하는 데 중요하며 결국 종양 세포 모집 메커니즘을 이해하는 데 사용될 것입니다.유방 오르가노이드는 유방 선 발달의 해명 기계장치를 가지고 있고, 시험관에서 강하게 유방암을 재수량했습니다. 우리는 우리의 모형이 방사선 유도한 종양 세포 모집에 관하여 통찰력을 제공하기를 바랍니다.

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Research

연구

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Bioengineering

생명공학

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

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환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.

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전립선암 이질성과 치료 저항성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 주요 부모 종양 특성을 보존하는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 표준화된 모델은 약물 스크리닝 및 정밀 의학 발전을 지원합니다.

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독특한 조직 공학 방법은 축삭 스트레치 성장을 recapitulating하여 문화의 수많은 신경 섬유를 길어지다하기 위해 개발되었다; 신경이 확대 본체의 성장과 함께 길어지다 약자 신경계의 성장의 한 형태.

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유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

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