Name: 코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 배우세요 태아줄혈 유래 만능줄기세포에서 각질형성세포와 섬유아세포로 분화시켜 3D 피부 오가노이드를 생성하는 방법을. 이 기술은 피부 재생의학 및 질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강, 복지 및 가족 업무, 한국 공화국 (H16C2177, H18C1178)에 대 한 한국 의료 기술 R & D 프로젝트, 정부에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

동물 관련 된 모든 절차는 실험실 동물 복지 행위, 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 했다 그리고 기관 동물 관리에서 지침 및 설치류 실험에 대 한 정책을 제공 하 고 한국 가톨릭 대학의 학부의 위원회 (IACUC)를 사용 합니다. 연구 프로토콜은 가톨릭 대학교의 한국 (CUMC-2018-0191-01)의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. Songeui 캠퍼스 2017 및 취득 협회 평가 대 한 식품 및 의약품 안전 청의 한국 우수 동물 실험실 시설 인가 IACUC, 가톨릭 대학교의 실험실 동물 (DOLA)의 부 고 2018 년에서 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC) 국제 전체 인증 인가
1. 피부 세포 분화 유도 만능 줄기 세포에서
<ol><li>중간 준비 참고: 어두운 환경에서 최대 3 개월까지 4 ° C에서 모든 매체를 저장 합니다. 살 균을 위해 사용 하기 전에 0.22 μ m polyethersulfone 필터 시스템을 사용 하 여 모든 매체를 필터링 합니다. 모든 매체의 500 mL 전체 볼륨에서 사용할 수 있었습니다.<ol>
<li>KDM1 준비 (keratinocyte 차별화 매체 1). 혼합 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) / 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 0.3 m m o l/L L-아 스 코르 빈 산, 5 μ g/mL 인슐린, 그리고 24 µ g/mL 아데닌과 F12 매체 (3:1).</li>
		<li>KDM2 준비 (keratinocyte 차별화 중간 2). 혼합 정의 keratinocyte 중간 혈 청 무료 ( 재료의 표참조)와 0.3 m m o l/l L-아 스 코르 빈 산, 5 μ g/mL 인슐린, 10 μ g/mL 아데닌. 참고: 정의 된 keratinocyte 혈 청 자유로운 매체 성장과 keratinocytes의 확장을 지원 하기 위해 최적화 되어 있습니다.</li>
		<li>KDM3 준비 (keratinocyte 차별화 매체 3). 혼합 정의 keratinocyte 혈 청 무료 매체 그리고 keratinocyte 혈 청 무료 매체 (1:1) 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 참고: Keratinocyte 혈 청 자유로운 매체의 성장 및 keratinocytes의 유지 보수에 대 한 최적화 됩니다.</li>
		<li>FDM1 준비 (구와 차별화 매체 1). 5 %FBS, 5 μ g/mL 인슐린, 0.18 m m 아데닌 그리고 10 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)와 함께 믹스 DMEM/F12 매체 (3:1).</li>
		<li>FDM2 준비 (구와 차별화 중간 2). 5%와 1 %FBS 불필요 한 아미노산 믹스 DMEM/F12 매체 (1:1).</li>
		<li>EP1 준비 (상피 매체 1). 믹스 DMEM/F12 (3:1)와 4 mM L-글루타민, 40 μ M 아데닌, 10 μ g/mL 올려진다, 10 μ g/mL 인슐린, 0.1 %FBS.</li>
		<li>EP2 준비 (상피 중간 2). EP1 1.8 m m 염화 칼슘을 믹스.</li>
		<li>E p 3를 준비 (상피 매체 3, cornification 매체). 믹스 F12 매체와 4 mM L-글루타민, 40 μ M 아데닌, 10 μ g/mL 올려진다, 10 μ g/mL 인슐린, 2 %FBS, 1.8 m m 칼슘 염화 물.</li>
	</ol></li>
	<li>배아 바디 생성
	<ol>
<li>CBMC-Ipsc 이전 연구12에 표시 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 합니다.</li>
		<li>문화 요리, vitronectin를 사용 하 여 코트. 100 mm 접시 코트 5 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>해 동 및 50 μ 0.5 mg/mL vitronectin의 resuspend (최종 농도: 5 µ g/mL) 5 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께. 요리에 솔루션을 추가 하 고 1 h. Aspirate 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재에 대 한 실 온 (RT)에서 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>CBMC 파생 Ipsc vitronectin 코팅 100 mm 접시 10% CO2와 37 ° C에서 매일 iPSC 매체 (E8)를 변경 유지.</li>
		<li>미 발달 기관 (EBs) (설명 간단히 다음과 같이) 이전 연구15 에 표시 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 합니다. Ipsc 셀 80% 합류에 도달 될 때까지 매체를 변경 하 여 확장 합니다. 80% 합류에 매체를 제거 하 고 PBS로 세척 합니다.</li>
		<li>셀 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL을 처리 합니다. 5% CO2 2 분 동안 37 ° C에서 품 어 그리고 E8 매체의 3 mL를 사용 하 여 셀을 수확. 250 x g 2 분 동안에 세포 원심</li>
		<li>상쾌한 발음을 E8 매체의 5 mL는 셀에 적용 됩니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 1 x 106 셀을 전송. 250 x g 2 분 동안에 세포 원심</li>
		<li>10 μ M로 관련 된 키 (바위) 억제제와 EB 대형 매체의 2.5 mL로 전송 된 셀 resuspend 1 x 104 의 세포 (25 µ L/드롭) 10-100 μ 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 noncoated 문화 접시 뚜껑에 드롭. 1 x 106 셀 (1 x 104 셀/1 EB)에서 양식 100 EBs. 접시를 뒤집어 놓고 뚜껑은 방울에 걸어. 참고: 락 억제제 단계에서 첨부 파일의 유지와 분화 과정에서 필요 합니다. EB 집계 단계에만 록 억제제를 추가 합니다.</li>
		<li>1 일 5% CO2 와 37 ° C에서 물방울을 품 어.</li>
		<li>다음 날, 수확 100 EBs 차별화에 대 한 그들을 사용 하 여. IPSC 매체 (E8 매체) 또는 PBS를 가진 접시의 뚜껑을 세척 하 고 그 내용을 50 mL 원뿔 튜브에 수확. 그들을 정착 1 분 RT에 EBs를 유지 합니다. 발음은 상쾌한, E8 매체와 EBs resuspend 고 분화까지 90 mm 페 트리 접시에에서 그들을 유지 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Keratinocytes로 CBMC Ipsc의 차별화 참고: CBMC Ipsc에서 keratinocyte 차별화의 체계, 그림 1A를 참조 하십시오.<ol>
<li>베스트 100 EBs iPSC 매체 또는 PBS 50 mL 원뿔 튜브를. RT EBs 정착 1 분 동안에 유지 합니다. 그들은 정착 원뿔 튜브의 하단에 다는 것을 확인 하십시오. 발음은 상쾌한 고 E8 매체 1 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 4 (BMP4)와 EBs를 resuspend. EBs 90 mm 페 트리 접시에 전송 하 고 1 일 5% CO2 와 37 ° C에서 그들을 유지 합니다.</li>
		<li>문화 요리, 유형 IV 교원 질을 사용 하 여 코트. 유형 IV 콜라겐 100 mm 접시를 코트의 5 mL을 준비 합니다.<ol>
<li>해 동 및 유형 IV 콜라겐 솔루션 resuspend (최종 농도: 50 µ g/mL) 0.05 N HCl. 요리에 솔루션을 추가 그리고 1 헤에 대 한 RT에서 품 어와 발음 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재. 참고: 격판덮개를 사용 하기 전에 설거지 3 x 어떤 산을 제거 하는 PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>EBs (단계 1.3.1) 50 mL 원뿔 튜브를 수확 하 고 그들을 정착 1 분 RT에서 그들을 유지 하는 것. 그들은 원뿔 튜브의 하단에 정착, 상쾌한, 발음 및 10 µ M 바위 억제제와 KDM1의 6 ml에서 EBs resuspend 다는 것을 확인 하십시오. 유형 IV 콜라겐 코팅 100 mm 접시에는 EBs를 전송 합니다. 참고: EB 첨부 파일 단계에서만 록 억제제를 추가 합니다.</li>
		<li>0-8 일 사이 매체 매일 KDM1 3 µ M retinoic 산 (RA)와 25 ng/mL 각 BMP4와 EGF의 변경. EBs 5% CO2와 37 ° C에서 유지 합니다.</li>
		<li>9-12 일 사이 변경 매체 매일 20 ng/mL EGF와 3 µ M RA, 25 ng/mL BMP4, KDM2.</li>
		<li>13-30 일 사이 변경 매체 매일 KDM3 10 ng/mL BMP4와 20 ng/mL EGF.</li>
	</ol></li>
	<li>섬유 아 세포에 CBMC iPSC의 차별화 참고: CBMC Ipsc에서 구와 차별화의 체계에 대 한 그림 2A를 참조 하십시오.<ol>
<li>문화 요리, 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 코트. 100 mm 접시 코트 5 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>지하실 막 매트릭스를 녹여 (최종 농도: 600 ng/mL) DMEM/F12 매체와 그것을 희석. 요리에 솔루션을 추가 하 고 30 분 Aspirate 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>베스트 100 EBs iPSC 매체 또는 PBS를 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브를. RT EBs 정착 1 분 동안에 유지 합니다. 그들은 정착 원뿔 튜브의 하단에 확인 하십시오. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>10 µ M 바위 억제제와 FDM1의 6 mL에 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 EBs resuspend (매체)와 EBs 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 100 mm 접시에 전송 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 품 어. 3 일 동안 매일은 FDM1를 새로 고칩니다. 참고: EB 첨부 파일 단계에서만 록 억제제를 추가 합니다.</li>
		<li>일 4와 6 사이 FDM1를 0.5 nM 뼈 morphogenetic 단백질 4 (BMP 4)을 추가 합니다.</li>
		<li>7 일에 매체를 변경 FDM2 1 주 동안 매일.</li>
		<li>14 일에 1 mM EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 2 분은 상쾌한 제거 하 고 resuspend FDM1의 5 mL에 셀 셀 FDM2 및 250 x g 에서 원심 분리기의 3 mL을 수확을 위해 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수, 2 x 106 셀 FDM1 매체, resuspend 그리고 noncoated 접시를 셀을 전송. 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 유지 하 고 매일 매체를 변경.</li>
		<li>코트 문화 요리를 사용 하 여 나에 게 콜라겐을 입력 합니다. 100 mm 접시 코트 5 mL를 준비 합니다. 희석 유형 I 교원 질 솔루션 (최종 농도: 50 µ g/mL) 0.02 N 초 산에. 요리에 솔루션을 추가 하 고 1 h. Aspirate 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재에 대 한 RT에서 품 어. 참고: 격판덮개를 사용 하기 전에 설거지 3 산 제거에 PBS 가진 x.</li>
		<li>21 일에 1 mM EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 2 분은 상쾌한 제거 하 고 resuspend FDM1의 5 mL에 셀 셀 FDM1 및 250 x g 에서 원심 분리기의 3 mL을 수확을 위해 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어. 수 hemocytometer 및 전송 사용 하 여 셀 2 x 106 세포 종류에 내가 FDM1 매체와 콜라겐 코팅 100 mm 접시입니다. 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 유지 하 고 매일 매체를 변경.</li>
		<li>28 일에 1 mM EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 2 분은 상쾌한 제거 하 고 resuspend FDM1의 5 mL에 셀 셀 FDM1 및 250 x g 에서 원심 분리기의 3 mL을 수확을 위해 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수와 FDM1 매체와 noncoated 접시 2 x 106 셀을 전송. 셀 5% CO2 와 37 ° C에서 유지 하 고 매일 매체를 변경. 참고: iPSC 파생 된 섬유 아 세포 증식 주된 fibroblast 세포 선 및 10 구절까지 통로 처럼. 이 연구에서 우리는 추가 분석을 위해 iPSC 파생 2 ~ 5 구절의 섬유 아 세포를 사용.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 차별화 된 셀 hiPSC 파생 응용
<ol><li>
3D 피부 organoid의 세대
	<ol>
<li>중화 유형 준비 나 얼음, 콜라겐 제조 업체의 권장 사항에 따라. 최종 농도 3 mg/mL 사용 하 여 유형 I 교원 질에 대 한 (재고 농도의 유형 I 교원 질은 3.47 mg/mL), 혼합물의 최종 볼륨 5 mL 확인. 10 x PBS의 볼륨 계산 (최종 볼륨/10 = 0.5 mL). 계산 볼륨의 유형 I 사용 될 콜라겐 (최종 콜라겐 농도 x 최종 볼륨 / 콜라겐 농도 주가 5 mL x 3 mg/mL = / 3.47 mg/mL = 4.32 mL). 계산 1 N NaOH의 볼륨 (사용 되는 콜라겐의 볼륨 0.023 mL = 0.1 mL x). DH2O의 볼륨 계산 (10 x PBS-1 N NaOH의 볼륨의 최종 볼륨-콜라겐의 볼륨-볼륨 5-4.32 mL-0.5 mL 0.1 mL = 0.08 mL =). 튜브의 내용을 혼합 하 고 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 그것을 유지.</li>
		<li>단계의 1.4.10 iPSC 파생 fibroblasts에 EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 분리 된 세포를 수확, hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 2 x 105 셀을 전송 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어. 250 x g 2 분에 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다. Resuspend FDM1의 1.5 ml에서 iPSC 파생 된 섬유 아 세포의 세포와 무력화는 유형 나 콜라겐 솔루션 (1:1). 참고: 부드럽게 거품을 피하기 위해 해결책 혼합.</li>
		<li>막 삽입 6 잘 microplate에, 삽입, 혼합물을 전송 놓고 30 분 동안 RT에서 품 어. 참고: 격판덮개를 이동 하지 마십시오.</li>
		<li>겔 화를 확인 한 후 삽입 및 우물의 바닥에 3 mL의 상단 중간의 2 개 mL를 추가 합니다. 5-7 일는 겔 화 완료 될 때까지, 더 이상 계약에 대 한 섬유 아 세포와 콜라겐 5% CO2 와 37 ° C에서의 매트릭스를 품 어.</li>
		<li>완전 한 겔 화 후 분리 (단계 1.3.6)에서 iPSC 파생 keratinocytes EDTA를 사용 하 여. EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 분리 된 세포를 수확, hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 1 x 106 셀을 전송 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어. 2 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 낮은 칼슘 상피 매체 1 (EP1)의 50-100 µ L에 1 x 106 셀 resuspend.</li>
		<li>행렬에서 모든 매체를 발음 (단계 2.1.5 참조) 및 1 x 106 세포 각 구와 레이어에 iPSC 파생 keratinocytes의 씨앗. 5% CO2 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어. 참고: 접시를 이동 하지 마십시오 그리고 keratinocyte의 첨부 파일에 대 한 모든 매체를 추가 하지 마십시오.</li>
		<li>삽입의 상단을 우물의 바닥에 EP1의 3 mL EP1의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>2 일 후 막 삽입 격판덮개에서 모든 매체를 발음 하 고 2 일 동안 정상적인 칼슘 EP2 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>2 일 후, 모든 매체를 발음 하 고는 공기 액체 인터페이스 생성 하 하단에만 cornification 매체의 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>3D 피부 organoid 5% CO2 와 37 ° C에서 최대 14 일 동안 유지 하 고 매일 매체를 변경. 3D 피부 organoid 삽입, 가장자리를 절단 하 여 수확 하 고 그것을 사용 하 여 얼룩 및 피부 이식의 추가 연구에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
피부 이식
	<ol>
<li>끄 덕/scid 쥐 (남성, 6 주 이전)에 흡입 마 취를 수행, 표준, 제도 승인 된 방법을 사용 하 여. 피부 이식, 각 마우스의 등 쪽 피부 모피를 면도.</li>
		<li>마우스의 피부, 곡선된가 위를 사용 하 여 집게와 1 cm x 2 cm 섹션을 제거 합니다.</li>
		<li>CBMC iPSC 파생 3D 피부 organoid를 결함 사이트와 실크 봉합 넥타이 위에 드레싱 메서드를 사용 하 여 봉합에 놓습니다.</li>
		<li>2 주 동안 생쥐를 관찰 하 고 조직학 분석을 위해 그들을 희생. 얼룩 프로토콜은 이전 연구16에 확인 했다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Running+Barbed+Tie-over+Dressing%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery+-+Global+Open%22%5BJournal%5D)">The Running Barbed Tie-over Dressing.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137(2014).</li>
<li>Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cell+sorting+of+fibroblasts+and+keratinocytes+creates+an+organotypic+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent.</a> Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).</li>
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저자는 공개 없다.

인간의 Ipsc 맞춤된 재생 의료17에 대 한 새로운 대안 제안 되어 있다. 맞춤된 Ipsc 환자 파생 질병 모델링, 약물 검사, 및 자가 이식18,19사용할 수 있는 환자 특성을 반영 합니다. 환자 파생 Ipsc의 사용 또한 1 차 셀, 적절 한 셀 숫자 및 면역 반응5,,1719의 부족에 관한 문제를 극복할 수 있다. 그러나, 맞춤된 Ipsc의 경제적으로 실현 가능한 시간, 비용, 및 노동 제한 되지 않습니다. HLA homozygous CBMC 파생 Ipsc는 새로운 가능성으로 떠오르고 있다. HLA homozygous Ipsc 경제적으로 귀중 한 될 수 있으며 환자8<...

피부는 신체의 가장 바깥쪽 표면 커버 하 고 내부 장기를 보호 한다. 피부는 병원 체에 대 한 보호, 흡수, 저장 물 등 다양 한 기능, 체온을 조절 하 고 신체를 검출 낭비2. 피부 이식 피부 소스;에 따라 분류 될 수 있다 다른 기증자 로부터 피부를 사용 하 여 이식 이식, 불린다 고 이식 환자 자신의 피부를 사용 하 여 autografts. autograft는 그것의 낮은 거부 위험으로 인해 선호 하는 치료, 피부 생 검은 심한 병 변 가진 환자 또는 피부 세포의 수가 부족에 수행 하기 어렵다. 환자에서 심한 화상, 피부 세포의 수 3 배 큰 부위를 커버 하는 데 필요한 있습니다. 환자의 몸에서 피부 세포의 제한 된 가용성 allogenous 식은 필요한 경우에 발생 합니다. 그것은 일반적으로 약 1 주3후 숙주의 면역 체계에 의해 거부 이후 자가 이식을 수행할 수 있습니다 때까지 일시적으로 이식 사용 됩니다. 환자의 면역 시스템에 의해 거부를 극복 하기 위해 이식 환자4같은 면역 정체성과 소스에서와 야 한다.
인간의 Ipsc는 줄기 세포 치료5셀의 신흥 소스입니다. 인간의 Ipsc OCT4, SOX2, Klf4, 및 c-Myc6등 재활 요소를 사용 하 여 신체 세포에서 생성 됩니다. 인간의 Ipsc를 사용 하 여 배아 줄기 세포 (ESCs)7,8의 윤리 문제와 면역 극복. 인간의 Ipsc pluripotency 있고 3 개의 세균 층9으로 분화 할 수 있다. HLA, 재생 의학에 중요 한 요인의 존재는 면역 반응과 거부10의 가능성을 결정합니다. 환자 파생 Ipsc 사용 하 여 셀 소스 제한 및 면역 시스템의 문제를 해결합니다. CBMCs는 또한 재생 의학11에 대 한 대체 셀 원본으로 나왔다. 필수 HLA 타이핑, CBMC 은행 중 발생 하는 연구와 이식에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 더, homozygous HLA 형 Ipsc 널리 다양 한 환자12에 적용할 수 있습니다. CBMC iPSC 은행 소설 및 세포 치료 및 재생 의학 allogenic12,,1314에 대 한 효율적인 전략 이다. 이 연구에서 우리는 CBMC-Ipsc, keratinocytes 및 섬유 아 세포로 분화를 사용 하 고 층 화 3D 피부 레이어를 생성. 이 연구에서 결과 3D 피부 CBMC iPSC 파생 organoid 생체 외에서 그리고 vivo에서 피부과 연구를 위한 새로운 도구는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>아데닌</td><td>시그마</td><td>A2786</td><td>섬유아세포에 대한 분화 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>AggreWell 배지 (EB 형성 배지)</td><td>STEMCELL</td><td>05893</td><td>EB 형성</td></tr><tr><td>항-피브로넥틴 항체</td><td>abcam ab23750</td><td></td><td>섬유아세포 마커</td></tr><tr><td>Anti-KRT14 항체</td><td>abcam ab7800</td><td></td><td>각질세포 마커</td></tr><tr><td>안티-로리크린 항체</td><td>abcam</td><td>ab85679</td><td>각질층 마커</td></tr><tr><td>Anti-p63 항체</td><td>abcam</td><td>ab124762</td><td>각질 세포 마커</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin 항체</td><td>Santa cruz</td><td>sc-7558</td><td>섬유 아세포 마커</td></tr><tr><td>BAND AID FLEXIBLE FABRIC</td><td>Johnson & </td><td></td><td>Johnson-Bandage</td></tr><tr><td>기저막 매트릭스 (Matrigel)</td><td>BD</td><td>354277</td><td>섬유아세포 분화 매체의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>BLACK SILK 봉합사</td><td>AILEEE</td><td>SK617</td><td>피부 이식</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>3D 피부 오가노이드용 상피 배지의 구성</td></tr><tr><td>요소 콜라겐 I 유형 I</td><td></td><td>BD 354236</td><td>3D 피부 오가노이드</td></tr><tr><td>콜라겐 유형 IV</td><td>Santa-cruz</td><td>sc-29010</td><td>각질 세포에 대한 분화 배지의 구성</td></tr><tr><td>요소 정의 된 각질 세포 - 세럼 프리 배지</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>각질 세포</td></tr><tr><td>DMEM, 고 포도당</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td>분화 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>DMEM / F12 매체</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>구성 요소 분화 매체</td></tr><tr><td>필수 8 매체</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>iPSC 매체</td></tr><tr><td>FBS, 인증된</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>섬유아세포 및 각질세포를 위한 분화 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 Glutamax 보충제&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>섬유아세포</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Invtrogen</td><td>12585-014</td>에 <td>대한 분화 배지의 구성 요소 섬유아세포 및 각질세포에 대한 분화 배지의 구성</td></tr><tr><td>요소 홍채 표준 곡선 가위</td><td>Professional</td><td>PC-02.10</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>각질 세포 무함유 배지</td><td>Gibco</td><td>17005-042</td><td>분화 배지의 구성 요소 각질 세포</td></tr><tr><td>L-아스코르브산 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>각질 세포</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid</td><td>Gibco</td><td>1140050</td><td>섬유아세포에 대한 분화 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>Meriam Forceps 엄지 손가락 16 cm</td><td>HIROSE</td><td>HC 2265-1</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc SCID/J</td><td>잭슨 연구소</td><td>001303</td><td>피부 이식</td></tr><tr><td>페트리 접시 90 mm</td><td>현대 마이크로</td><td>H10090</td><td>플라스틱 도자기</td></tr><tr><td>재조합 인간 BMP-4</td><td>R & D</td><td>314-BP</td> 각질 세포 재조합 인간 EGF 단백질<td>에 대한 분화 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td></td><td>R & D</td><td>236-EG</td><td>케라티노사이트 레티노산을 위한 분화 매체의 구성</td></tr><tr><td></td><td>요소 Sigma</td><td>R2625</td><td>케라티노사이트</td></tr><tr><td>T/C Petridish 100 mm, 240/bx</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>플라스틱 웨어</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T3705</td><td>3D 피부 오르가노이드를 위한 상피 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 Transwell-COL 콜라겐 코팅된 막 삽입물& 주의;</td><td>Corning</td><td>CLS3492</td><td>3D 스킨 오가노이드용 플라스틱 제품&nbsp;</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life technologies</td><td>A14700</td><td>iPSC 배양</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochloride</td><td>peprotech</td><td>1293823</td><td>iPSC 배양</td></tr></tbody></table>

코드 혈액 파생에서 3d 피부 organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

피부는 신체의 가장 큰 기관 이다 하 고 많은 기능을가지고 있다. 피부 물리적 장벽 및 시체의 수호자로 서 역할을 하며 신체 기능을 조절. Biomimetics 모델, 시스템 및 복잡 한 인간의 문제1을 해결 하기 위해 자연의 모방 이다. 피부 biomimetics 생체 외에서 질병 연구 그리고 vivo에서 재생 의학에 대 한 유용한 도구입니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 무제한 확산의 특성 있고 3 개의 세균 층을 차별화의 능력. 인간의 Ipsc는 다양 한 기본 세포, 혈액 세포, keratinocytes, 섬유 아 세포 등에서 생성 됩니다. 그 중, 탯 줄 혈액 단 세포 (CBMCs) 수용자 재생 의학의 관점에서 다른 셀 원으로 떠오르고 있다. 셀 뱅킹 시스템에 필수적 이다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 입력 하기 때문에 CBMCs는 재생 의학에 유용 합니다. 우리 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc의 차별화 및 3D 피부 organoid의 생성을 위한 메서드를 제공합니다. CBMC iPSC 파생 keratinocytes 및 섬유 아 세포 1 차 셀 라인에 유사한 특성이 있다. 3D 피부 organoids는 피부 층에 표 피 레이어 overlaying에 의해 생성 됩니다. 이 3D 피부 organoid, 이식으로 인간 답게 마우스 모델 생성 됩니다. 이 연구는 3 차원 인간의 iPSC 파생 피부 organoid 피부과 연구 생체 외에서 그리고 vivo에서 소설, 대체 도구가 될 수 있습니다 보여줍니다.

피부는 표 피와 진 피, 대부분의 경우, 구성 됩니다. Keratinocytes는 주요 세포 유형의 표 피, 고 섬유 아 세포는 진 피의 주요 셀 형식. Keratinocyte 차별화의 체계는 그림 1에 표시 됩니다. CBMC iPCSc vitronectin 코팅 접시 (그림 1B)에 유지 되었다. 이 연구에서 우리가 EB 형성을 사용 하 여 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc 분화. EBs는 교수형을 사용 하 여 생성 메서드 keratinocytes 및 섬유 아 세포 (그림 1C)의 균일 하 고 제어 차별화를 드롭. EBs 4 콜라겐 코팅 판 keratinocyte 차별화에 대 한 입력에 연결 된 그리고 매체 매일 변경 되었습니다. CBMC Ipsc RA,...

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

코드 혈액 단핵 세포, 또는 CBMC는 인간 백혈구 항원 타이핑이 세포 뱅킹 시스템에 필수적이기 때문에 재생 의학을 위한 잠재적인 세포 근원으로 부상했습니다. CBMC 유도 만능 줄기 세포, 또는 CMBC-iPSCs는 각질 세포 및 섬유아세포로 분화될 수 있다. 3D 피부 오르간노이드를 생성하기 위해 피부과 연구를 사용하고 있습니다.CBMC-iPSC를 비트론틴 코팅 100밀리리터 플레이트에 섭씨 37도, 이산화탄소 10%로 배양하는 것으로 시작합니다. 세포가 80%에 도달하면 PBS로 배양을 세척하고 접시당 1밀리리터 EDTA1밀리리터로 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 2분간 치료합니다. 세포가 분리되면 플레이트 당 E8 배지의 3 밀리리터로 반응을 멈추고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다.계산을 위해 E8 배지의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 원심분리를 위해 1회-10-6번째 세포를 15밀리리터 원뿔관으로 이송한다. 배아 체 형성 배지의 2.5 밀리리터로 이송된 세포를 다시 중단하고, 10-micromolar rho 관련 키나아제 또는 ROCK 억제제로 보충한다. 파이펫을 사용하여 125 마이크로리터 의 셀 방울을 코팅되지 않은 배양 판 뚜껑에 전달합니다.모든 물방울이 배치되면 접시를 뒤집어 물방울이 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 뚜껑에서 멈출 수 있도록 합니다. 다음 날, 신선한 E8 배지로 뚜껑을 세척하고 배아 체액을 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨냅니다. 배아 체는 상온에서 1 분 동안 정착할 수 있도록 허용하고, 상체를 심고 그들의 분화까지 90mm 페트리 접시에 그들의 문화에 대한 신선한 E8 매체로 배아 몸을 다시 중단합니다.CBMC-iPSC 각질 세포 분화의 경우, 배아 신체 배양에서 E8 배지를 신선한 E8 배지로 대체하고, 뼈 형태 유전학 단백질 4의 밀리리터당 1나노그램으로 보충되어 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 배양에 대한다. 다음 날, 배아 시체를 시연된 대로 50밀리리터 원뿔관으로 수확하고 실온에서 1분 동안 정착할 수 있도록 합니다. 다음으로, 상체를 각질 세포 분화 배지 1 또는 KDM1의 6밀리리터로 대체하고, 10마이크로몰러 ROCK 억제제로 보충하고 배아 체를 타입 IV 콜라겐 코팅 100mm 접시로 옮킨다.배양의 8일을 통해, 3 마이크로몰라 레티노산과 골 형태 유전학 단백질 4 및 표피 성장 인자의 각각 밀리리터 당 25 나노그램으로 보충된 신선한 KDM1로 매일 마다 배지를 대체하십시오. 9일부터 12일까지, 매일 배지를 KDM2로 대체하여, 3마이크로몰라 망막산, 뼈 형태유전학 단백질 4의 밀리리터당 25나노그램, 표피 성장 인자의 밀리리터당 20나노그램으로 보충한다. 일 13에서 30 일 사이, KDM3에 매일 배지를 변경, 뼈 형태 유전학 단백질의 밀리리터 당 10 나노 그램으로 보충 4, 표피 성장 인자의 밀리리터 당 20 나노 그램.CBMC-iPSC 섬유아세포 분화를 위해, 10마이크로몰라 ROCK 억제제로 보충된 섬유아세포 분화 배지 1의 6밀리리터에서 배아 체배 양을 다시 중단하고, 배아 체현탁을 지하 막 매트릭스 코팅 100mm 접시로 옮킨다. 3일간의 배양 후, 배지를 섬유아세포 분화 배지 2로 변경하기 전에 4일 동안 0.5 나노몰라 뼈 형태유전학 단백질 4로 배양을 치료한다. 문화7일째에는 1주일 동안 격일로 FDM2로 변경합니다.문화의 14일째에, 입증된 바와 같이 1밀리알러 EDTA로 세포를 분리하고, 원심분리를 위해 섬유아세포 분화 배지 2의 3밀리리터로 세포를 수집한다. 카피아세포 분화 배지 1의 5밀리리터에서 세포를 다시 중단하고, 2회-10-6번째 세포를 비코팅 된 접시로 옮기다. 문화의 21일째에, 배양에서 10-6세포를 신선한 섬유아세포 분화 배지 1에서 100mm 식으로 이송한다.문화의 28일째에, iPSC 유래 섬유아세포의 2회-10-6을 새로운 비코팅 요리로 옮기. 3차원 피부 오르가노이드 생성을 위해, 배양에서 iPSC 유래 섬유아세포를 수확하고, 원심분리를 위해 2회-10-5번째 세포를 15밀리리터 원추형 튜브로 이송한다. 섬유아세포 분화 배지 1의 1.5 밀리리터및 중화형 I 콜라겐 용액의 1.5 밀리리터에서 섬유아세포 펠릿을 다시 중단한다.실온에서 30분 동안 6웰 마이크로 플레이트에 삽입된 셀을 배양합니다. 용액이 고형화되면 인서드 상단에 2밀리리터의 매체를 추가하고 웰 하단에 3밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 섬유아세포 매트릭스를 겔화가 완료될 때까지 5~7일 동안 인큐베이터에 넣고 매트릭스는 더 이상 수축하지 않습니다.인큐베이션의 끝에서, iPSC 유래 각질 세포를 수확하고, 원심분리를 위해 15 밀리리터 원추형 튜브로 1회-10-6세포를 이송한다. 낮은 칼슘 상피 배지 1의 50- 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 섬유아세포 매트릭스를 통해 매질을 각질 세포 용액으로 대체한다. 섭씨 37도에서 15분 후, 인서트 상단의 배지를 상피 매체 1의 2밀리리터로 교체하고, 하단의 배지를 동일한 3밀리리터로 잘 교체하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌리보도록 한다.이틀 후, 배지를 인서트와 잘 정상 칼슘 상피 배지 2로 2일 간 추가로 배양한다. 문화의 4 일째에, 모든 매체를 제거하고, 공기 액체 인터페이스를 생성하기 위해, 잘 바닥에 옥수수 화 매체의 3 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 다운스트림 분석을 위해 3D 스킨 오가노이드를 수확하기 전에 최대 14일 동안 플레이트를 인큐베이터에 반품합니다.CBMC-iPSC 유래 각질 세포는 1차 각질 세포와 유사한 형태를 가지며, 이러한 세포에서 각질 세포 마커의 발현이 증가한다. CBMC-iPSC 유래 섬유아세포는 1차 섬유아세포와 유사한 형태를 가지며, 만능 줄기 세포 마커 10-4의 발현은 하향 조절되고 섬유아세포 마커는 최대 조절된다. 3D 피부 오르가노이드의 두께는 3D 배양 중에 증가하며, 3D 피부 오르가노이드가 iPSC 유래 각질 세포및 섬유아세포로부터 생성되는 것을 확인합니다.2 주 후, 이식 된 3D 피부 오르가노이드 이식은 HNE 분석에 의해 확인된 바와 같이 수신자 마우스 피부에 효율적으로 통합됩니다. 또한, 각질세포 성숙및 표피 분화 마커는 CBMC-iPSC 유래 3D 피부 오르가노이드로 표현되어 마우스 피부 결함의 기능적 분화, 효율적인 이식 및 효과적인 치유를 입증한다. 우리는 피부 근처를 모방하기 위해 3D 피부 오르가노이드의 계층화 층을 유도 높은 칼슘 배지와 과거에 사용합니다.분석은 피부가 계층화된다는 것을 보여줍니다. CBMC-iPSC는 피부 이식에 대한 잠재적인 세포 공급원이며, CBMC-iPSC 유래 3D 피부 오르가노이드는 피부과, 화장품 스크리닝 및 재생 의학과 관련된 연구에서 사용될 수 있다.

generation-3d-skin-organoid-from-cord-blood-derived-induced

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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