Name: Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 번데기 망막 해부법을 통해 면역조직화학, 서쪽 분석, RNA 추출을 위한 고품질 조직을 분리하는 효율적인 방법을 익히세요. 이 기술은 신경과학 및 발생생물학 연구에 필수적인 자원을 제공합니다.

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우리는 원고에 잭 드럼과 도움이 의견에 대 한 우리의 검토 감사합니다. 이 작품은 R15GM114729에 의해 지원 되었다.

1. 조직 준비
<ol><li>초파리 를 설정 (앞에서 설명한20) 십자가 또는 원하는 유전자 형의 번데기를 특정 초파리 긴장 문화. 되도록 많은 pupae coincidently 등장, 그 영양소 풍부한 음식 미디어 또는 표준 식품 미디어 아낌없이 효 모-붙여넣기 보충에 중복이 비행 문화를 확립.</li>
	<li>25 ° c.에 초파리 문화 유지 십자가 UAS GAL4 시스템을 활용 하 여, GMR GAL4 애벌레 눈 디스크 세포 후부 번데기 개발21,,2223, 를 통해 전체적 밭 고 랑을 표현 하는 이상적인 드라이버입니다. 24. 이상적인 제어 크로스 UAS lacZ X GMR GAL4 역할 크로스 비 생 및 불활성 β-galactosidase 단백질의 표현을 드라이브.</li>
	<li>6"대나무 부 목 젖어 증류수 부드럽게 백색 사전 pupae (그림 1B) 건강 한 문화 튜브 (그림 1A)의 측면에서 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (그림 1C)에 배치 된 팁을 사용 합니다.</li>
	<li>튜브 건조 (그림 1D)에서 번데기를 보호 하기 위해 충분 한 습도 챔버를 유지 하기 위해 증류수에 배어 조직의 작은 조각 함께 플라스틱 피 펫 팁 상자에 놓습니다. 해 부까지 25 ° C에서 번데기를 품 어.</li>
	<li>건조 6"대나무 부 목 사용 하 여 부드럽게 밀어 번데기 microcentrifuge 튜브에서와 해 부 접시 블랙에. 번데기에서 해 접시에 양면 테이프의 새로운 조각을 하다.</li>
	<li>신중 하 게 집게의 쌍을 사용 하 여, 테이프 (그림 2A)에 번데기 등 쪽 (즉, operculums 향하도록, 그림 1B)를 배치 합니다. 번데기는 테이프에 잘 고착 확인 합니다. 참고: 번데기 사건에 수 분 억제 보안 접착 테이프, 어떤 경우에, 이중 면 테이프에 배치 하기 전에 건조 하 pupae 허용 것 이다.</li>
</ol>2입니다. 눈-두뇌 단지의 해 부
<ol><li>집게를 사용 하 여 각 번데기 (그림 2C)의 operculum 제거.</li>
	<li>서가 위를 사용 하 여 슬라이스 또는 각 번데기의 번데기 케이스를 자르면. 플랩 머리, 흉부, 그리고 이중 면 테이프 (그림 2C) 번데기 케이스의 가장자리를 확보 하는 앞쪽 복 부 세그먼트 공개 번데기 케이스를 엽니다. 참고: 그것은 전적으로 번데기를 밝힐 필요가 아니다.</li>
	<li>날카로운 집게, 동물, 파악 된 각 번데기의 복 부를 관통 하 고 번데기의 경우 (그림 2C)에서 그것을 제거 합니다.</li>
	<li>검은 해 부 접시, 테이프에서에 번데기를 놓고 차가운 인산 염-버퍼링-솔루션 (PBS, pH 7.4)의 약 400 µ L로 커버 합니다.</li>
	<li>복 각 번데기 잡고 집게와 서가 위, 반에 번데기를 절단 전체 흉부를 통해 깨끗 한 횡단면 컷 (그림 2D).</li>
	<li>PBS에서 각 시체의 후부 잔재를 제거 하 고 해 접시에 한쪽에 넣어 (할 하지, 단계 3.2.1 참조).</li>
	<li>두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 열고 흉부 눈 두뇌 복잡 한 (그림 2E)을 각 번데기의 머리. 이렇게 하려면 흉부 상피의 잘라 가장자리를 파악 하 고 점차적으로 흉부를 열고 캡슐, 눈-뇌 복잡 하 고 주변 지방 조직의 노출 머리를 찢 어.</li>
	<li>조직 파악 없이 집게를 사용 하 여 머리 캡슐의 나머지에서 눈 뇌 복잡 한 가이드 또는 찢어진 오픈 헤드 캡슐에서 눈 뇌 복잡 한 특 종. 참고: 눈-두뇌 복잡 한 아령 모양의 오프 화이트, 그리고 주변 크림 지방 (그림 2B, E) 보다 더 반투명입니다.</li>
	<li>집게, 신중 하 게 대부분 지방 눈 조직을 건드리지 않고 눈 두뇌 단지와 관련 된 제거.</li>
</ol>3. 면역 형광 검사에 대 한 조직의 처리
<ol><li>설명된 (2.1-2.9 단계)으로 적어도 6 10 pupae를 해 부. 참고: 각 해 부의 3 ~ 4 독립적인 복제 가설 테스트를 충분 한 데이터를 얻을 경향이 있다.</li>
	<li>
세척 및 고정
	<ol>
<li>p 20의 끝 또는 P100 피 펫 팁 반경 m m ~ 1 팁 열기 고 PBS와 지방 위쪽 및 아래쪽의 믹스를 pipetting으로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라. 이 지방 단계 2.6에서에서 제거 하는 시체 잔해에서 얻을 수 있습니다.</li>
		<li>얼음 9 잘 유리 접시에 PBS의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송. 참고: 눈-두뇌 단지 것 이다 pipetting 동안 unlubricated 팁 준수 및 수 손상 또는 손실.</li>
		<li>아래로 부드럽게 눈 두뇌 단지 소용돌이에 PBS에 pipetting 여 눈 조직와 관련 된 나머지 지방을 제거 합니다. 이에 모든 후속 세척 단계, 할 하지 직접 플라스틱 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지가 연약한 눈 조직 손상 것입니다.</li>
		<li>최소 볼륨에서 눈 뇌 단지 전송 (< 20 µ L) 정착 액의 적어도 250 µ L로 PBS의. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 35 분, 얼음에 품 어. 참고: 단계 3.1.1에서에서 준비 같은 윤 활된 팁이이 전송에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>동일한 피 펫 팁, PBS의 잘 포함 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 전송. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 씻어 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다. 참고: 눈-두뇌 단지 최종 PBS 세척, 얼음, 또는 3.3.1 단계로 진행 하기 전에 4 ° C에서에서 몇 시간 동안 유지할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 체 얼룩이 지기
	<ol>
<li>차단 항 체 솔루션에 노출 이전 조직, 눈-두뇌 단지 ~ 400 µ L PBT의 전송. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 전송. 10 ~ 60 분, 얼음에 품 어.</li>
		<li>PBT에 적절 한 항 체를 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다. 눈-두뇌 단지 항 체 솔루션의 10 µ L aliquots에서 알을 품는, 준비 볼륨 10의 복제 됩니다.</li>
		<li>72-잘 microwell 쟁반의 깨끗 한 우물에 항 체 솔루션의 aliquot 10 µ L (내용 참조).</li>
		<li>반경에 ~0.5 m m 팁 열기 고 pipetting PBT에 의해 아래로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 P10 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
		<li>전송의 볼륨에 더 이상 5 눈-두뇌 단지 < P10 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁을 사용 하 여 항 체 솔루션의 각 10 µ L로 PBS의 3 µ L.</li>
		<li>솔루션을 위아래로 pipetting으로 항 체 솔루션을 균질. 이 조직에 손상을 것입니다 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지 플라스틱 하지 않습니다.</li>
		<li>항 체 해결책의 증발을 최소화 하려면 microwell 쟁반으로 증류수에 배어 조직의 작은 조각을 놓고 (예를 들어, 함께 제공 하는 뚜껑) 트레이 인감. 4 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>씻고 9 던 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 microwell 트레이에서 전송. P10 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 (준비 단계 3.3.4에에서 설명 된 대로)를 사용 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어.</li>
		<li>세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다. 세척 솔루션 사이 눈 두뇌 단지를 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.</li>
		<li>적절 한 fluorophore 태그 2 차 항 체 PBT에서 필요에 따라를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 100 µ L 6-10 pupae의 배치 당 충분 하다. 약 수 9 던 유리 해 부 접시에 이차 항 체 솔루션.</li>
		<li>눈-두뇌 단지 이차 항 체 솔루션에 전송 합니다. 전송에 대 한 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.</li>
		<li>실 온에서 1-2 시간 또는 3-5 h 4 ° c.에 대 한 이차 항 체 솔루션에서 눈 뇌 단지 품 어 빛에 의해 fluorophores의 표백 방지 하기 위해 호 일 준비 커버. 참고: 이차 항 체 솔루션에 외피의 최적의 기간 사용 하는 차 및 2 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>씻고 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 이 세척 단계는 두 번 이상 반복 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
보조 고정
	<ol>
<li>보조 고정을 위한 정착 액의 적어도 200 µ L 눈 두뇌 단지 전송 하 고 실내 온도에 또는 4 ° c.에 35 분 20 분 동안 품 어 참고: 보조 고정 장착 (3.5 단계) 에이즈 눈 조직 자나.</li>
		<li>눈-두뇌 단지 5 분 동안 씻어 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.</li>
		<li>세척 단계를 한 번 이상 반복 합니다.</li>
		<li>사용은 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 ~ 400 µ L 1-2 분에 대 한 린스에 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBS의 눈-두뇌 단지 소프트웨어인 모션 pipetting PBS에 의해 조직 하지만 조직 하지 유지 눈-두뇌 단지 정착 하 고 PBS 린스 중 유리 접시에 고착에서 방지 하기 위해 아래로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
장착
	<ol>
<li>미디어를 마운트의 ~ 200 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 눈-두뇌 단지 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다. 1-2 h에 대 한 미디어의 장착에 equilibrate을 조직을 수 있습니다.</li>
		<li>깨끗 한 현미경 슬라이드에 신선한 설치 미디어의 5-8 µ L 드롭 장소.</li>
		<li>P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 열기를 증가 하 고이 고 P10 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 슬라이드에 미디어를 마운트의 드롭에 미디어를 장착의 5-8 µ L에서 눈 뇌 단지 전송를 깨끗 한 면도날으로 잘라.</li>
		<li>두 개의 텅스텐 바늘을 사용 하 여 시 돌출부에서 눈을 분리. 견고한 텅스텐 바늘으로 슬라이드에 복잡 한 눈-뇌를 고정 하 고 좋은 텅스텐 바늘 (그림 2F)의 연결된 시 엽 멀리 각 눈을 슬라이스.</li>
		<li>좋은 텅스텐 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 인접 한 각 눈의 기저 표면으로 현미경 슬라이드의 표면에 각 눈 기동. 부드럽게 조직을 통해 깨끗 한 커버 슬립을 낮은 및 매니큐어와 보안. 참고: 그렇게 그들은 서로 가까이 또는 라인에서 슬라이드에 눈 정리 후속 현미경을 촉진할 것 이다.</li>
		<li>형광 또는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 망막을 이미지. 참고: 슬라이드 해야 될 4 ° C에서 저장 아니라면 즉시 몇 군데 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 서 부 럽 눈 조직의 준비:
<ol><li>10-16 pupae (단계 2.1-2.9) 다음 수정 해 부: a) 수집 및 두 개의 배치, 10-15 분 간격에 번데기를 해 부 및 b) PBS (PBS + pi) 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제와 보충에서 해 부.</li>
	<li>눈-두뇌 단지는 p 20을 사용 하 여 전송 또는 P100 변위 micropipette 공기와 PBS + 얼음, 9 잘 유리 접시에 파이 씻어 짧게 ~ 400 µ L로 팁 (단계 3.2.1에서 준비)을 윤 활. 참고:이 윤 활된 팁 4.3 및 4.4 후속 단계에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>두 번 린스 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>모든 눈-두뇌 단지 얼음 차가운 PBS + 깨끗 한 검은 해 접시에 decanted pi ~ 400 µ L로 전송 합니다.</li>
	<li>각 눈 (눈 뇌 복잡 한 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서. 참고: 눈이이 단계에서 '스티커'는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다.</li>
	<li>' 청소 ' 모든 눈 '더미'에 PBS + 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여 해 접시에 pi.</li>
	<li>P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 개방을 확대 하 여 아래로 팁 내부에 의해 pipetting 서 조직 세포의 용 해 버퍼 (WTLB)에 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라.</li>
	<li>5 µ L의 PBS + pi에서 눈 뇌 단지 500 µ L microcentrifuge 튜브로 전송 합니다. 이 윤 활된 팁과 P10 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송 완료.</li>
	<li>얼음에 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. 샘플, WTLB 그리고 2 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 10 µ L (또는 5 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 2.5 µ L)의 1 볼륨 (5 µ L)를 추가 합니다. 두 드려서 믹스.</li>
	<li>소용돌이 microcentrifuge 짧게 튜브 고 데스크탑 미니 원심 분리기를 사용 하 여 샘플 아래로 회전.</li>
	<li>분석까지-20 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 표준 프로토콜을 사용 하 여 분석 합니다.</li>
</ol>5. 눈 조직의 RNA 추출 준비:
<ol><li>입고 장갑, 깨끗 한 벤치탑, 현미경, 해 부 도구, 블랙 후 RNase 오염 제거 시 약 70% 에탄올으로 처음 요리를 해 부. 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>30-40 번데기 단계로 설명 (2.1-2.9) 다음 수정 해 부:는) 수집 및 배치, 15-20 분;에 6 ~ 8 pupae를 해 부 b) nuclease 무료 PBS와 c 해 부) 눈의 각 일괄 처리를 별도로 분리 하지만 모든 망막 조직 같은 microcentrifuge 튜브 (단계 5.5)으로 축적. 참고: 두 사람이 동시에 해 부를 데 좋은 눈 조직의 효율적인 분리를 가속화할 것 이다.</li>
	<li>각 일괄 처리에 대 한 눈-두뇌 단지 (단계 2.1-2.9)와 얼음, 짧게, 린스를 9 잘 유리 접시에 nuclease 무료 PBS의 ~ 400 µ L로 전송 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁 (준비 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로)를 사용 하 여 격리 합니다. 참고:이 윤 활된 팁 5.4, 5.5-5.8 후속 단계에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>두 번 린스 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 검은 해 부 접시에 얼음 처럼 차가운 nuclease 무료 PBS의 신선한 400 µ L 드롭 눈 두뇌 단지 전송할.</li>
	<li>(복잡 한 눈 두뇌 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 각 눈을 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서. 참고: 눈이이 단계에서 '스티커'는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다.</li>
	<li>' 청소 ' 모든 눈 '더미'로 nuclease 무료 PBS 해 접시에 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여에서.</li>
	<li>살 균 RNase 무료 microcentrifuge 튜브에 눈 전송 및 액체 질소에 플래시 동결.</li>
	<li>Pupae의 각 배치의 해 부 (5.3-5.8 단계)를 반복 합니다. 액체 질소 (단계 5.5)를 축적 한 튜브에 모든 눈에서에서 유지 관리 하는 동일한 microcentrifuge 튜브에 눈의 각 일괄 처리를 전송 합니다.</li>
	<li>RNA 추출까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 초파리 번데기 눈 해 부 방법 10 ~ 15 분 이내 6-10 눈 두뇌 단지의 격리에 대 한 수 있습니다. 그러나, 인 내와 연습 절 개 기술을 지배 품질 및 해의 속도 향상 시키기 위해 필수적입니다. 이 짧은 해 부 시간 각 눈 약 동일한 개발 단계, 표현 형 또는 유전자 표현의 데이터 집합에서 망막에 있는 가변성을 감소를 통해. 우리의 프로토콜은 조직적으로 찢 어 또는 깎기, 눈에 손상을 수 있는 스트레스 통로 활성화를 유도 또는 때문에의 위험을 최소화 하면서 섬세 한 망막 조직을 분리 하도록 대체 프로토콜 마스터를 덜 연습 해야, 하는 동안 세포 죽음입니다. 우리는 초보자 첫 번째 마스터 pupae 젊은 눈 해 부를 하기 전에 40 h APF 경작의 해 부를 조언. 거기는 항상 충분 한 pupae 컬렉션 (1.3 단계)에 사용할 수 있도록 것입니다 모든 실험 (단계 1.1)에 대 한 복제 설정 교차 하는 것이 좋습니다. 망막은 번데기 개발 연구원에 관심의 뚜렷한 전체적 이벤트에 따라 다양 한...

초파리 망막 색소 세포 벌집 격자1,2,,34배열에 의해 포위 하는 약 750 ommatidia 구성 됩니다. 각 ommatidium 8 포토 리셉터 신경, 4 렌즈 은닉 원추 세포, 그리고 두 가지 기본 안료 세포에 포함 되어 있습니다. 각 ommatidium를 주변 안료 생산 격자 세포와 감각 강 모 그룹 있습니다. 포스트 mitotic 자연 및 틀에 박힌 6 각형 배열, 초파리 번데기 망막 세포 접착5,6,를 포함 하 여 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공 7,8,9,10 및 apoptosis11,12,13,,1415.
여러 게시 프로토콜 초파리 번데기16,,1718에서 눈 뇌 단지 추출 공기 압력을 이용 한다. 프로토콜 설명 여기 대신 활용 하 서 도구를 신중 하 고 정확 하 게 격리 눈-뇌 손상된 망막 조직을 얻기의 목적으로 단지. 이것은 망막에 대 한 활용 하는 경우 중요 한 형태학, 단백질, 또는 유전자 발현 분석 때문에 망막 손상 세포 스트레스 또는 죽음, 세포 표현 형 또는 진 식을 수정할 수 발생할 수 있습니다. 또한, 연습 후, 6 ~ 10 눈 두뇌 단지 10 ~ 15 분, 나이 및 해 부 눈 조직의 발달 단계에서 가변성을 최소화의 목표를 용이 하 게 고립 될 수 있다.
고정, immunostaining, 및 아래에 설명 된 전체 마운트 프로토콜은 형광 현미경 검사 법에 대 한 초파리 눈의 준비에 적합 하다. 망막은 관심사의 단백질을 대상으로 하는 항 체와 알을 품을 수 있다. 예를 들어 외화 접합 부품에 항 체 특성 셀을 포함 하 여, 모양 및 배치 평가19될 수 있도록 셀의 꼭대기 크기를 시각화 하기 위해 활용할 수 있습니다. 고정, 이전 서쪽 분석, 단백질 또는 RNA qRT-PCR에 사용 하기 위해 또는 RNA 시퀀싱을 추출 하기 위해 뇌에서 눈 죽 습 수 대신 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>대나무 부목, 6"&nbsp;</td><td>Ted Pella Inc</td><td>116</td><td></td></tr><tr><td>베타 메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>베타-글리세롤 포스페이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>검은색 해부 접시</td><td></td><td></td><td>가장자리까지 SYLG170 또는 SYLG184(곱게 간 숯 가루로 검은색)으로 채워진 유리 페트리 접시. 중합을 위해 24-48시간 동안 실온에 두십시오.</td></tr><tr><td>블레이드 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA free 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope (Zeiss LSM 501)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>또는 이와 유사한 현미경</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila 식품 매체, 영양이 풍부한&nbsp;</td><td></td><td></td><td>7.5% 자당, 15% 포도당, 2.5% 한천, 20% 맥주 효모, 5% 펩톤, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H2</sub</td></tr><tr><td>>0Drosophila 식품 매체, 표준</td><td></td><td></td><td>블루밍턴 초파리 스톡 센터 옥수수 가루 레시피.&nbsp; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>PBS의 고정액</td><td></td><td></td><td>4% 포마데히드, pH 7.4.</td></tr><tr><td>형광 현미경 (TCS SP5 DM 현미경)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>또는 유사한 현미경</td></tr><tr><td>집게&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>집게는 자주 날카롭게 해야 합니다.</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>유리 9-웰 디쉬&nbsp;</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>9-웰 디쉬라고도 함&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드 (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio 소프트웨어 버전 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>웨스턴 블롯의 정량화를 위한 이미지 처리 소프트웨어.</td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>2X 농축 단백질 샘플 버퍼, 제조업체의 지침에 따라 베타 메르캅토에탄올을 보충합니다.</td></tr><tr><td>샘플 버퍼를 줄이는 레인 마커&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>39000</td><td>5X 농축 단백질 시료 버퍼.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>미세해부 가위&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Microwell 트레이 (72 x 10 &micro; L wells)</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td></td><td></td><td>PBS N-프로필갈레이트에 0.5% N-프로필갈레이트 및 80% 글리세롤</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 PBS(0.1% DEPC의 PBS, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>PBS에 적절한 양의 DEPC를 첨가하고 잘 섞은 후 실온에서 일정한 교반으로 밤새 배양합니다. 최소 20분 동안 오토클레이브합니다. 4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수 pH 7.4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>제조업체의 지시에 따라 준비</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS 플러스 프로테아제 및 포샤타제 억제제)</td><td></td><td></td><td>10mM NaF, 1mM 베타-글리세롤 포스페이트 및 1mM Na3VO4 PBS, pH 7.4.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0.15% TritonX 및 0.5% 소 혈청 알부민, PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>핀 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>1차 항체: 염소 항-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>웨스턴 블로팅용. 1:3000에서 사용</td></tr><tr><td>1차 항체: 토끼 anti-cleaved Dcp-1</td><td>세포 신호</td><td>9578S</td><td>면역형광용. 1:100 1차</td></tr><tr>항체에서 사용: 면역형광을 위한<td>쥐 anti-DEcad</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>DCAD2</td><td>. 1:20</td></tr><tr><td>1 차 항체 : rat anti-DEcad</td><td>DOI : 10.1006 / dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp; 우에무라 타다시의 선물. 1:100에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>RNA 제거 키트: Relia Prep RNA 조직 Miniprep 키트&nbsp;</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>Rnase 오염 제거 시약(RNase Away)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050</td><td>스케이프 블레이드의 작은 조각을 부수고 블레이드 홀더에 고정합니다.</td></tr><tr><td>2차 항체: 488-conjugated&nbsp; 당나귀 항쥐 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>면역형광용. 1:200</td></tr><tr><td>2차 항체: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>면역형광용. 1:100</td></tr><tr><td>2차 항체에서 사용: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7077</td><td>웨스턴 블로팅용. 1:3000</td></tr><tr><td>2차 항체: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>웨스턴 블로팅용. 1:3000</td></tr><tr><td>나트륨 염화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 플루오라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215309</td><td></td></tr><tr><td>바나데이트 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계 (NanoDrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>실체 해부 현미경 (M60 또는 M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>또는 이와 유사한 현미경</td></tr><tr><td>Sylgard (black)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (투명)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>색상 곱게 분쇄 된 숯 가루가있는 검정색</td></tr><tr><td>조직 : Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride pH7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘, 미세</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>핀 홀더에 삽입</td></tr><tr><td>텅스텐 바늘, 견고한</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>핀 홀더에 삽입</td></tr><tr><td>WTLB (Western Tissue lysis Buffer)</td><td></td><td></td><td>50mM Tris-HCl (pH 7.5)에서 150mM NaCl, 1.5 % Triton X-100, 1mM EDTA, 20 % 글리세롤, 10mM NaF, 1mM 베타 글리세롤 인산염 및 1mM Na3VO4. 10mL 용액당 1개의 cOmplete 프로테아제 칵테일 테이블을 보충하십시오.</td></tr><tr><td>효모 페이스트</td><td>(현지 슈퍼마켓)</td><td></td><td>~20mL 증류된 H2O에 용해된 Fleischmann's ActiveDry 효모(또는 이와 유사한 것) 약 2테이블스푼</td></tr></tbody></table>

immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 rna 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

초파리 번데기 망막 개발 하는 동안 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 이 종이에 선물이 섬세 한 초파리 번데기 망막의 해 부에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜. 외과 접근 pupae를 열고 정확 하 게 추출 눈 두뇌 단지를 쉽게 사용할 수 서 도구를 활용 합니다. 이러한 수 고정, 들어서는 immunohistochemistry, 망막에 다음 현미경 슬라이드에 장착 되며 목표 세포 또는 subcellular 구조를 감지 하는 경우를 몇 군데. 또는, 떼어낸된 망막 뇌 조직에서 분리, 적절 한 버퍼에 lysed 고 단백질 젤 전기 이동 법 또는 mRNA 추출 (각각 단백질 또는 유전자 식 평가)에 대 한 활용. 상당한 연습과 인내심, 기정 프로토콜을 마스터 해야 할 수 있습니다 하지만 일단 마스터, 프로토콜 수 주로 손상된 망막의 상대적으로 빠른 절연 있습니다.

번데기 눈은 그 드라이브 morphogenesis 발달 과정을 조사 하는 우수한 모델 역할을 쉽게 액세스할 수 있는 조직 이다. 여기, 우리 망막 해 부는 면역 형광 꼭대기 외화 접합 (그림 3A, C) 또는 apoptosis (그림 3)25동안 활성화 되는 Dcp-1 caspase (그림 3D)를 감지 하는데. 이러한 방식을 명확 하 게 모집 등 (18 h APF)에서 1 차 셀의 morphogenesis 키 전체적 과정 동안 세포를 관찰 할 수, 격자의 윤 각 ommatidium (18-24 h APF), 주위 세포의 설립은 3 차 틈새 (21-24 h APF), 셀 크기와 모양 (18 h 40 h APF)에서 및 apoptosis (18 ~ 33 h APF)에서 변경 합니다. 이러한 전체적 이...

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

이 프로토콜은 여러 다운스트림 응용 프로그램에 대한 Drosophila pupal 눈 조직의 격리를위한 효율적인 방법이기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 조직을 손상시키지 않고 많은 수의 pupal 눈의 빠른 해부를 허용한다는 것입니다. 드로소필라 푸팔 망막의 해부는 초보자에게 도전이 될 것입니다.이 기술을 연습하는 것이 해분의 속도와 결과의 품질을 향상시키는 가장 좋은 방법입니다. 드로소필라 푸파를 검은 해부 접시에 넣은 후, 양면 테이프를 해부 접시에 놓고, 강아지에서 멀리 떨어진 곳에 양면 테이프를 놓고, 강아지 등쪽을 테이프위에 조심스럽게 올려놓습니다. 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 각 강아지의 오퍼쿨룸을 제거합니다.미세 절 부 가위를 사용하여 각 pupal 케이스를 슬라이스하여 머리, 흉부 및 전방 복부 세그먼트를 드러내고 푸팔 케이스의 가장자리를 양면 테이프로 고정할 수 있도록 합니다. 날카로운 집게로 각 강아지의 복부를 관통하고, 푸팔 케이스에서 강아지를 제거합니다. 강아지를 해부 접시에 놓고 테이프에서 멀리 떨어진 곳에 놓고 400 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS로 강아지를 덮습니다.집게를 사용하여 복부에 의해 각 것을 파악하고 미세 절 가위를 사용하여 흉부를 통해 하나의 깨끗한 단면 절개를 만들어 새끼를 반으로 자른다. 두 쌍의 미세 한 개의 미세 한 집게를 사용 하 여 각 흉부 상피의 절단 된 가장자리를 잡고 점차적으로 흉부와 머리 캡슐을 열고 눈물, 눈 - 뇌 복합체와 주변 지방 조직을 노출. 그런 다음 조직을 파악하지 않고 집게를 사용하여 각 반투명, 오프 화이트, 아령 모양의 눈 - 뇌 복합체를 머리 캡슐의 잔해에서 멀리 안내하십시오.6~10개의 강아지를 해부한 후 깨끗한 면도날로 마이크로피펫 팁을 직경 약 1mm로 자르고 PBS와 지방이 혼합된 팁을 윤활합니다. 윤활피 팁을 사용하여 눈-뇌 복합체를 얼음에 400 마이크로리터가 들어있는 9웰 유리 접시의 한 우물로 옮은 다음, 20마이크로리터의 PBS 마이크로리터로 조직을 얼음에 35분 간 배양하기 위해 최소 250마이크로리터로 옮길 수 있습니다. 고정의 끝에서, 얼음에 5 ~ 10 분 동안 신선한 PBS의 400 마이크로 리터를 포함하는 세 번째 우물로 조직을 전송하는 동일한 파이펫 팁을 사용합니다.비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 눈-뇌 복합체를 PBS 400 마이크로리터와 트리톤 X로 옮겨 얼음에

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

이 비디오는 번데기에서 눈-뇌 복합체를 해부하고 분리하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 예를 들어 면역 염색 및 다른 유전자 발현 실험과 호환되는 고품질 조직을 생성하는 절차를 보여줍니다.

파리 번데기에서 눈-뇌 복합체의 해부: 망막 조직을 분리하는 방법

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 기술의 목표는 연구자들이 모든 연령의 Drosophila melanogaster에서 번데기 안구 디스크의 해부, 면역 염색 및 장착을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.

해부와의 설치<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 아이 디스크

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

배우세요 Drosophila melanogaster 번데기 망막 해부법을 통해 면역조직화학, 서쪽 분석, RNA 추출을 위한 고품질 조직을 분리하는 효율적인 방법을 익히세요. 이 기술은 신경과학 및 발생생물학 연구에 필수적인 자원을 제공합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

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