Name: 산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 학습하세요 Mitis 그룹 Streptococci가 생성한 과산화수소에 의한 Caenorhabditis elegans의 산화 스트레스 반응을 연구하는 방법을. 이 생물학적 활성산소종을 이용한 지속 가능한 기술은 병원성과 스트레스 반응 활성화를 효과적으로 분석합니다.

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우리 감사 박사 빙 연의 왕, 박사 장군이 Tribble (텍사스 대학, 치과의 학교), 박사 리처드 Lamont (루이스 빌 대학, 치과의 학교), 및 실험실 및 임상 긴장의 제공에 대 한 박사 사무엘 셸 번 (MD 앤더슨 암 센터) mitis streptococci 그룹. 우리는 또한 선 충 C. 긴장에 대 한 박사 키이 스 블랙 웰 (유전학의 부, 하버드의과 대학) 감사합니다. 마지막으로, 우리 감사 박사 다니엘 Garsin와 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥 거 번의과 대학) 시 약 및 연구 수행을 웜 변종. 일부 웜 변종 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

1. 네 (토 드-휴이 트 효 모 추출 물) 한 천 배지 준비
<ol><li>미디어의 1 L, 토 드-휴이 트 분말, 효 모 추출 물 및 2 L 삼각 플라스 크를 한 20 g 2 세대의 30 g 추가. 이온된 수의 970 mL 플라스 크의 내용에 추가 하 고 볶음 바 포함. 압력솥에서 121 ° C의 온도 압력 30 분 동안 15 파운드/인치2 의 미디어. 그 후, 저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 부드러운 감동으로 냉각 허용.</li>
	<li>층 류 흐름에서 적절 한 크기의 멸 균 페 트리 디쉬 (성장 및 유지 보수의 박테리아를 죽이 분석 실험을 위한 35 m m x 10 m m 요리 요리 100 m m x 15 m m)에 미디어를 붓으십시오. 미디어 층 류 후드 2 h 동안 건조를 허용 합니다. 그 후, 1 개월 4 ° C에서 격판덮개를 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 선 충 류 성장 매체 (NGM) 및 RNAi 먹이 접시 (NGM RNAi)의 준비
<ol><li>저 막대를 사용 하 여 2.5 g 펩의 및 이온된 수 2 L 삼각 플라스 크에 970 mL에 NaCl의 3 세대 분해. 언론에의 한 천 20g을 추가 합니다. 압력솥에서 121 ° C의 온도 압력의 30 분의 15 파운드/인치2 미디어 저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 부드러운 감동으로 냉각 허용.</li>
	<li>NGM 접시의 준비에 대 한 미디어 다음 솔루션 추가: 1 M 칼륨 인산 염 버퍼의 25 mL (pH = 6.0), 1 M MgSO4, 1m CaCl2, (95% 에탄올에 5 mg/mL) 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1 mL (에탄올에 10 %v / w) nystatin의 1 mL 및 25 mg/mL 스의 1 mL.</li>
	<li>NGM RNAi 먹이 접시의 준비에 대 한 미디어 다음 솔루션 추가: 1 M 칼륨 인산 염 버퍼의 25 mL (pH = 6.0), 1 M MgSO4, 1m CaCl2, (95% 에탄올에 5 mg/mL) 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1 mL (에탄올에 10 %v / w) nystatin의 1 mL, 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL 및 IM IPTG의 1 mL.</li>
	<li>층 류에서 멸 균 페 트리 디쉬 60 m m x 15 m m으로 언론을 따르십시오. 미디어 층 류 후드 2 h 동안 건조를 허용 합니다. 그 후, 1 개월 4 ° C에서 접시를 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. C. 선 충 의 유지 보수
<ol><li>시드 하룻밤의 스포팅 50 µ L에 의해 NGM 접시는 접시의 중앙에 대장균 OP50 성장. 대장균 문화는 이전 Luria Bertani (파운드) 미디어에서 준비 하 고 몇 달 동안 4 ° C에서 저장. 번호판을 커버 하 고 층 류 후드 24 h 동안 건조 하 고 그 후 폴리스 티 렌 용기에 접시를 저장 하도록 허용.</li>
	<li>해 현미경 10 12 벗 성인 살 균 웜 선택을 사용 하 여 선택 하 고 벌레는 대장균 에 전송 OP50 시드 NGM 접시. 하룻밤 20 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>다음 날, 살 균 웜 선택을 사용 하 여 성인을 제거 하 고 20 ° c (~2.5 일) L4 애벌레를 개발 하기 위해 배아를 허용.</li>
</ol>4. 벌레의 동기 인구 나이의 준비
<ol><li>
2 M9W를 사용 하 여 4 개의 NGM 접시 벗 성인을 세척 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 수집.
	<ol>
<li>M9W 준비: NaCl의 3 세대, 나2HPO4, 6 g 및 3g KH2포4 의 결합 하 고 마지막 양의 이온을 제거 된 물 1 L에 용 해. 고압 솔루션 1 M MgSO4의 1 mL을 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 분, g 450 x 튜브를 회전 한 다음 웜 펠 릿 그대로 유지 하면서는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>8.25% 염소 (가정용 표 백제)의 400 µ L 및 웜 세포 솔루션 준비 5 N NaOH의 100 µ L를 추가 합니다. 웜 펠 릿을 세포 솔루션을 추가 하 고 어른 벌레의 70%는 lysed 때까지 튜브를 터치 하 여 내용을 혼합. 정기적으로 계란의 아무 overbleaching는 되도록 해 현미경 튜브의 내용을 준수 합니다.</li>
	<li>M9W의 10 mL 원뿔 튜브의 내용에 추가 하 여 표 백제 혼합 희석.</li>
	<li>450 x g 1 분 Decant 상쾌한에 튜브를 회전 다음 M9W의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4.5 단계를 두 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>M9W의 3-5 mL에 결과 계란 펠 릿을 resuspend. 튜브 회전에 튜브를 놓습니다. 하룻밤 실 온 (RT)에서 18 rpm의 속도로 회전 하는 튜브를 허용 합니다.</li>
	<li>다음 날, 작은 L1 유 충을 1 분 동안 g 450 x 튜브를 회전 합니다. 포부, 관에 있는 액체의 ~ 250 µ L을 남겨두고 여 M9W의 대부분을 제거 합니다. L1 애벌레를 resuspend 하 고 3 5 µ L Petri 접시 뚜껑, 다음 견적 해 현미경을 사용 하 여 µ L 당 벌레의 수에 벌레의 서 스 펜 션의 상품.</li>
</ol>5입니다. 벌레에 RNAi의 유도
<ol><li>살 균을 사용 하 여 루프 또는, 100 m m x 15 m m 파운드 한 천 배지 50 µ g/mL carbenicillin 및 항생물질의 15 µ g/mL에 냉동된 주식 (Ahringer 및 비 달 라이브러리)에서 RNAi 포함 된 대장균 의 원하는 변종 밖으로 행진. 24 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>선택 하 고 원하는 RNAi 스트레인에서 고립 된 식민지 파운드 50 µ g/mL carbenicillin 보충의 2 개 mL를 포함 하는 살 균 15 mL 원뿔 관에 접종. 150 rpm에서 궤도 통에 16 h 37 ° C에서 튜브를 품 어.</li>
	<li>다음 날, 150 µ L 65 m m x 15 m m NGM RNAi 먹이 접시 살 균 분산기를 사용 하 여에 하룻밤 성장 문화 확산. 24 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>37 ° c.에 외피 후 rt 냉각 접시를 허용 ~ 200 L1 유 충 (벌레 단계의 동기 나이 인구에서 얻은) 대장균 에 포함 된 M9W의 적절 한 볼륨 시드 NGM RNAi 먹이 접시 추가 합니다. 애벌레 (~2.5 일) L4 단계에 도달할 때까지 20 ° C에서 접시를 품 어.</li>
</ol>6. 감염 Mitis 그룹 Streptococci의 준비
<ol><li>네 agar는 100 m m x 15 m m에 원하는 변종의 streptococci 밖으로 행진 (번호판 4 ° C에서 저장, 미리 따뜻한 37 ° C에 접시 각각 긴장을 질주 하기 전에), 다음 제공 하는 microaerophilic en 촛불 항아리에 37 ° C에서 하룻밤 (h ~ 18) 번호판을 품 어 (질주 된 접시는 4 ° C에서 1 주일 동안 저장할 수 있습니다) streptococci의 성장에 대 한 vironment.</li>
	<li>임상 분리 streptococci의 전파, tryptic 간장 혈액 한 천 사용 합니다. 37 ° C 하룻밤 촛불 항아리에 (h ~ 18)에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>다음 날, 촛불 항아리에서 플레이트를 제거 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 고립 된 식민지를 선택 합니다. 네 국물의 2 개 mL를 포함 하는 15 mL 살 균 원뿔 관 예방 Streptococci의 임상 격리 된 것을 전파 하는 THY 보충 5 %v / v 양 혈액의 국물. 뚜껑 꽉 닫고 정적 조건에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.</li>
</ol>7. 생존 분석
참고: 이 분석 결과에 포함 된 단계는 그림 1에 묘사 된다. H2O2 는 mitis에 의해 파생 된 입증 그룹은 벌레의 살인에 대 한 책임, 카 탈 라 제, 또는 돌연변이 스트레인 ΔspxB 미디어를 보충 하 고 보완 변형 ΔspxB; spxB + 미 gordonii 의 수 있습니다. 사용할 수 있습니다. SpxB는 mitis 그룹에서 H2O2 의 생산에 대 한 책임은 pyruvate 산화 효소에 대 한 인코딩합니다.
<ol><li>미리 따뜻하게 35 m m x 10 m m 37 ° c 그 대 접시 Streptococci의 원하는 긴장의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L을 추가 하 고 완전히 살 균 분산기를 사용 하 여 한 천 표면에 걸쳐 박테리아를 확산. 37 ° C 하룻밤 촛불 항아리에 (h ~ 18)에서 번호판을 품 어. 컨트롤, 씨 두 35 m m x 10 m m NGM 접시 대장균 OP50의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L로. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.</li>
	<li>H2O2 는 mitis 그룹에 의해 생산 벌레의 살인에 대 한 책임은 확인, 추가 THY에 catalase c 1000 단위를 포함 하는 50 µ L 플레이트. 살 균 분산기를 사용 하 여 카 탈 라 제 솔루션을 확산 하 고 접시 30 분 씨 7.1 단계에서 설명한 대로 각각 연쇄 상 구 균 긴장으로 그 후 접시에 대 한 층 류에 건조를 허용.</li>
	<li>다음 날, 촛불 항아리에서 플레이트를 제거 하 고 메 마른 벌레를 사용 하 여 10-15 분에 대 한 rt 냉각 플레이트 선택, 전송 30 L4 애벌레 NGM 또는 NGM RNAi는 연쇄 상 구 균을 먹이 접시에서 시드 네 접시 허용. 사용 2 시드 연쇄 상 구 균의 변형 당 60 웜 총 네 접시. 25 ° c.에 번호판을 품 어</li>
	<li>해 현미경을 사용 하 여, 여러 timepoints 각 접시에 라이브 하 고 죽은 L4 애벌레의 수를 계산 합니다. 처음에, 죽은 벌레를 점수 또는 매 30 분을 산다. 그 후, 웜 급속 하 게 죽을 시작, 점수 그들 15 분 간격. 살 균 웜 선택을 사용 하 여 부드럽게 벌레를 자극 하 고 그들은 죽 었 거 나 살아 확인. 경우에 괴롭히는에 대 한 응답 운동 벌레 죽은 간주 됩니다.</li>
	<li>분석 결과 완료 5-6 시간 소요 됩니다. 실험 두 번 더 반복 합니다. 분석 결과의 완성 후 두 접시에서 데이터 풀. 각 그룹의 데이터를 입력, 생존 곡선을 비교 하 고 카 플 란-마이어 생존 분석 통계 소프트웨어를 사용 하 여 수행.</li>
</ol>8입니다. 현미경 Agarose 패드의 준비
<ol><li>전자 레인지에 솔루션을가 열 하 여 이온된 수에 agarose의 2 %w / v를 분해. 솔루션의 5 mL의 볼륨은 20 슬라이드를 준비 하는 충분 한.</li>
	<li>두 개의 유리 슬라이드를 따라 세로로 랩 테이프 스틱. 이 agarose 패드의 두께 결정 합니다. 두 개의 녹화 슬라이드 사이의 깨끗 한 유리 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>깨끗 한 슬라이드의 중앙에 녹은 agarose의 장소 100 µ L. 즉시 다른 깨끗 한 유리는 녹은 agarose 위에 놓고 부드럽게 눌러 패드를 확인을 합니다. Agarose 고형화 하 고 이후 최고의 슬라이드를 제거를 허용 합니다. Agarose 패드 사용 하기 위해 준비가 되어있습니다.</li>
</ol>9. SKN 1 지역화 연쇄 상 구 균 감염에 대 한 응답에서의 관찰
참고: 이 분석 결과에 포함 된 단계는 그림 2에 묘사 된다. SKN-1의 지역화 SKN-1B/C::GFP 유전자 변형 웜 변형 사용 하 여 결정 했다. 지역화 SKN-1의 H2O2 는 mitis 그룹, 야생-타입의 생산으로 인해 (WT), ΔspxB, 및는 보완 스트레인 ΔspxB; spxB + 미 gordonii 의 사용 되었다. 또한, 유전자 변형 기자 스트레인 SKN-1B/C::GFP와 RNAi 간섭 기법 p38 MAPK 통로의 구성 요소 1 SKN의 지역화 규제를 설명 하기 위해 사용 되었다.
<ol><li>미리 따뜻하게 35 m m x 10 m m 37 ° c 그 대 접시 연쇄 상 구 균의 원하는 긴장의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L을 추가 하 고 완전히 살 균 분산기를 사용 하 여 한 천 표면에 걸쳐 박테리아를 확산. 37 ° C 하룻밤 촛불 항아리에 (h ~ 18)에서 번호판을 품 어. 컨트롤, 씨앗 3 35 m m x 10 m m NGM 접시 대장균 OP50의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L로. 이 접시 ~ 18 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거 하 고 10-15 분 세척 L4 애벌레 NGM에서 M9W를 사용 하 여에 대 한 rt 냉각 플레이트 및 NGM RNAi 먹이 접시. 15 mL 원뿔 튜브에 벌레를 수집 합니다.</li>
	<li>450 x g 1 분 Decant는 상쾌한에 튜브를 회전을 M9W의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>9.3 단계 세 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 Petri 접시 뚜껑에 벌레의 서 스 펜 션의 M9W 및 장소 3 5 µ L 상품 ~ 250 µ L에서 벌레를 resuspend 고 해 현미경을 사용 하 여 µ L 당 벌레의 수를 예상.</li>
	<li>각 네 구 시드 및 시드 NGM 대장균 접시에 100 ~ L4 애벌레를 추가 합니다. 박테리아의 스트레인 당 세 접시를 사용 합니다. 2 ~ 3 h 25 ° c.에 대 한 번호판을 품 어</li>
	<li>그 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 M9W로 그들을 씻어 15 mL 원뿔 튜브에 벌레를 수집.</li>
	<li>벌레 3 워시 x에 설명 된 대로 단계 9.3.</li>
	<li>포부로는 M9W의 대부분을 제거 하 고 웜 펠 릿에 M9W 포함 2 m m 나트륨 아 지 드 또는 2 mM tetramisole 염 산 염의 500 µ L를 추가 합니다. 이 벌레를 현미경 군데 발생 하는 운동 보장 anesthetize 것입니다. 주의: 나트륨 아 지 드를 처리할 때 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 화학 후드 아 지 드 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>15 분 동안 RT에서 웜 펠 릿을 품 어. 그런 다음 준비한 agarose 패드에 벌레의 서 스 펜 션의 15 µ L 자리. 부드럽게 마 취 벌레를 포함 하는 agarose 패드 번호 1.5 coverslip 장소.</li>
	<li>형광 현미경을 사용 하 여, SKN-1 이용 FITC와 DAPI 필터의 지역화 시각화. 이미지는 10 x 20 x 배율에서 벌레.</li>
	<li>SKN-1의 지역화의 수준에 따라 벌레를 점수. 아니 핵 지역화, SKN-1B/C::GFP 앞쪽 또는 웜, 후부의 지역화 및 SKN-1B/C::GFP 모든 창 자 세포에서의 핵 지역화 낮음, 보통 및 높은 수준의 지역화로 각각 분류 됩니다.</li>
	<li>형광 현미경, 득점 후 chi-제곱 및 피셔의 정확한 시험 통계 소프트웨어를 사용 하 여 통계적 차이 확인 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Enterococcus faecium, H2O2 에서 혐 기성 성장 생산 등 다른 병원 성 세균에 대 한 설명 하는 메서드를 사용할 수 있습니다 microaerophilic26조건 또는. 일반적으로, 대부분 병원 성 유기 체를 위한 그것은 걸립니다 몇 일 주 생존 분석 실험. 그러나, mitis 그룹의 구성원에 의해 H2O2 의 강력한 생산으로 인해 이러한 분석 5-6 h 설명 된 조건 내에서 완료 될 수 있습니다. 이렇게 하면 짧은 시간 동안 호스트 면역에 관련 된 여러 유전자 후보 및 산화 긴장 응답을 화면에 기능.
이 프로토콜에서는 H2O2 는 박테리아에 의해 생산 몇 가지 장벽을 교차 해야 하는 다른 외 인 선생님 소스 반대로 벌레의 장 세포와 직접 접촉에 있다. 이렇게 하면 H2</sub...

Mitis 그룹 streptococci oropharyngeal 구멍1의 인간의 공생입니다. 그러나, 이러한 생물이이 틈새를 탈출 하 고 침략 적인 질병2의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 이러한 미생물에의 한 감염 등 bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 cellulitis2,,34,,56. 또한, 그들은 혈 류 감염의 원인으로 대리인은 신흥 시내 immunocompromised, neutropenic, 그리고 화학 요법5,,78,9 받은 암 환자 .
몇 가지 독성 요인 확인 되었습니다 있기 때문에 기본 mitis 그룹 병 인은 애매 한 메커니즘. Mitis 그룹은 H2O2, 구강 미생물 커뮤니티10에서 중요 한 역할을 보여줘 생산으로 알려져 있다. 최근 여러 연구 cytotoxin 상피 세포 죽음11,12-유도로 H2O2 에 대 한 역할을 강조 했습니다. S. 폐 렴, 이 그룹에 속하는 DNA 손상 및13치경 세포 있는 apoptosis를 유도 하는 H2O2 의 높은 수준의 생산을 보였다. 급성 폐 렴 동물 모델을 사용 하 여, 동일한 연구원은 박테리아에 의해 H2O2 의 생산 독성 우위를 수 여 한다 설명 했다. 폐 렴 균 성 수 막 염에 대 한 연구 또한 그 병원 체 파생 된 H2O2 를 신경 세포 죽음14트리거 pneumolysin와 synergistically 역할 표시. 이 관측은 명확 하 게 박테리아의이 그룹에 의해 생산을 H2O2 는 그들의 pathogenicity에 대 한 중요 한 설정 합니다.
흥미롭게도, 그것은 또한 보였다는 mitis의 회원 그룹 S. mitis 및 H2O215,16의 생산을 통해 선 충 C. 선 충 의 죽음의 원인이 S. oralis . 이 살아있는 선 충 류는 많은 생물 학적 과정을 공부 하 간단 하 고, 유전으로 온순한 모형으로 사용 되었습니다. 더 최근에, 웜은 호스트 병원 체 상호 작용17,18연구 모델로 떠오르고 있다. 또한, 여러 연구 공부 하는이 유기 체19,20,21을 사용 하 여 산화 스트레스의 중요성을 강조 했습니다. 그것의 짧은 라이프 사이클, RNAi에 의해 관심의 최저의 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP)의 사용-융합된 기자 유전자 발현을 모니터링 하는 특성을 그것에 게 매력적인 모델 시스템의 일부. 더 중요 한 것은, 산화 스트레스와 벌레에 타고 난 면역 조절 경로 높은 포유류20,22보존 됩니다.
이 프로토콜에서 그것는 연쇄 구 균 파생 된 H2O2로 인 한 pathogenicity 명료 하 C. 선 충 을 사용 하는 방법은 보여 줍니다. 수정 된 생존 분석 결과 표시 하 고 mitis 그룹의 구성원을 급속 하 게 벌레를 죽 일 수 있습니다 통해 H2O2의 생산. 반응 산소 종의 지속적인된 생물 소스 mitis 그룹의 구성원을 사용 하 여 (선생님) 제공, 벌레에 산화 스트레스를 유발 하는 화학 원본에 반대 합니다. 또한, 박테리아는 H2O2 (여러 방 벽을 교차 하 고 있는 다른 소스에 비해) 창 자 세포에 직접 타겟이 될 수 있는 벌레를 빠르게, 식민지 수 있습니다. 분석 결과 중 1)으로 skn-1 돌연변이 스트레인의 또는 2) skn-1 웜 N2 야생-타입 기준 및 벡터 제어 처리 벌레에 RNAi를 사용 하 여 아래로 노크 하 여 생존을 결정 하는 유효성이 검사 됩니다. SKN-1 C. 선 충23,,2425의 산화 스트레스 반응을 조절 하는 중요 한 전사 요소입니다. 생존 분석, 뿐만 아니라 SKN-1B/C::GFP 유전자 변형 기자 표현 웜 변형 mitis 그룹은 산화 긴장 응답을 통해 H2O2 의 생산의 활성화를 모니터링 하는 데 사용 됩니다.

<table><tbody><tr><td><강한>미디어 및 화학 물질</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>박토 펩톤&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Todd Hewitt Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td></td></tr><tr><td>BD BBL 양 피, 제세공&nbsp; &nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>B11947</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco 한천&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LB 육수</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>혈액 한천 (양 피가 있는 TSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 염화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>카탈라제&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1345-1G</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP21021012</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Acros 유기물</td><td>AC455500050</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>8.25% 하이포아염소산나트륨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>시그마 알드리치</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>(&마이너스;)-테트라미솔 하이드로클로라이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><강력한>소모품&nbsp; </강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리 튜브&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>일회용 폴리스티렌 혈청학 피펫 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>일회용 폴리스티렌 혈청학 피펫 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 세균 페트리 접시 뚜껑 (35 mm x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>No. 1.5&nbsp; 18 mm x 18 mm 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>투명 뚜껑이 있는 페트리 접시 (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>투명 뚜껑이 있는 페트리 접시 (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>일반 유리 현미경 슬라이드 (75 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. oralis ATCC 35037</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. mitis ATCC 49456</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. gordonii DL1 Challis&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. 대장균 OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. 대장균 HT115</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strain</td><td>Genotype</strong</td><td>>Transgene</td><td>Source </td></tr><tr><td>N2</td><td>C. 예쁜꼬마선충 야생 분리 CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EU1</td><td>skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?( n754) 하자-?] (IV;V)</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>LD002</td><td>IdIs1</td><td>SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td><td>키스 블랙웰</td></tr></tbody></table>

산화 스트레스는 mitis 그룹 streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 (C. 선 충), 살아있는 선 충 류, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하는 매력적인 모델로 떠오르고 있다. 제시 프로토콜이이 모델을 사용 하 여 H2O2의 생산을 통해 mitis 그룹 streptococci 기인한 pathogenicity 결정. Mitis 그룹 streptococci bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 봉와 직 염 등 많은 인간의 질병을 일으키는 원인이 되는 신흥 위협입니다. 여기에 설명 된 H2O2 에 대 한 응답에이 벌레의 생존을 결정 하는 프로토콜에 의해 생산 병원 체의이 그룹. 산화 긴장 응답 녹음 방송 요인에 대 한 유전자 skn-1 인코딩을 사용 하 여,이 모델은 연쇄 구 균 감염에 대 한 필수적인 호스트 유전자를 식별 하는 데 중요 한 표시 됩니다. 또한, 유전자 변형 기자 웜 변형, SKN-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 융합은 사용 하 여이 병원 균의 존재 산화 스트레스 반응의 활성화를 모니터링할 수 있습니다 표시 됩니다. 이 분석 실험 것 반대로 생물 소스에 의해 파생 된 H2O2 로 산화 스트레스 반응을 기회 반응성 산소 종 (선생님) 소스를 추가 제공 합니다.

mitis의 회원 그룹 S. mitis, S. oralis, S. gordonii 빠르게 사망 S. mutans, S. salivarius, 및 비 병원 성 대장균 에 반대 벌레, OP50 (그림 3A). S. mitis, S. oralis, S. gordonii 메디아 생존이 이었다 300 분, 300 분, 345 분, 각각. 살인 H2O2에 의해 중재 된 경우를 확인 하려면 catalase 네 agar에 보충 되었다. 벌레의 살인 catalase (그림 3B)의 폐지 되었다. 추가 연쇄 구 균 파생된 H2</su...

선 충 류 꼬마 선 충 호스트 병원 체 상호 작용을 해 부에 우수한 모델입니다. 여기에 설명 된 멤버 mitis 그룹 streptococci와 웜 감염 유 기체의이 그룹에 의해 생산 H2O2 에 대 한 산화 스트레스 반응의 활성화를 결정 하는 프로토콜이입니다.

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

이 프로토콜에서 우리는 미티스 그룹 연쇄상 구균을 통해 생성된 과산화수소에 의한 병원성을 해명하기 위해 무료 생활 방법 c. elegans를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 화학 소스와 반대로 반응성 산소 종의 지속 가능한 생물학적 소스를 사용하여 벌레의 병원성과 스트레스 반응의 활성화를 연구 할 수 있다는 것입니다 메디 휴트 분말 의 30g, 효모 추출물 2g과 20g의 에이거2 리터 에를.플라스크의 내용물에 970ml의 탈이온된 물을 넣고 저어줄에 넣습니다. 알루미늄 호일을 사용하여 개구부를 덮습니다. 121도의 온도에서 플라스크에서 미디어를 오토클레이브하고 30 분 동안 평방 인치 당 15 파운드의 압력.그 후 부드러운 교반으로 식히기 위해 교반 접시에 플라스크를 설정합니다. 라미나르 후드 아래에 미디어를 적절히 크기로 멸균 페트리 접시에 붓습니다. 미디어를 2시간 동안 건조시키십시오.그 후 최대 1 개월 동안 섭씨 4도에 접시를 저장합니다. 미티스 그룹 연쇄상 구균의 준비 전에, 37섭씨에 인큐베이터에 THY 한천 판을 따뜻하게. 그 후 장소에 strepticocci의 원하는 긴장을 줄무늬멸 루프를 사용합니다.그런 다음 양초 항아리에 접시를 넣고 약 18 시간 동안 밤새 섭씨 37도에서 항아리를 배양하여 미세 한 환경을 제공합니다. 다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거하고 고립 된 식민지를 선택하는 멸균 루프를 사용합니다. THY 국물 2ml를 함유한 멸균 원추형 튜브 15ml를 접종합니다.캡을 단단히 닫고 정적 조건에서 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 인큐베이터에서 37도까지 미리 따뜻하게 하는 THY 플레이트는 1000단위의 카탈라아제를 함유한 50마이크로리터의 용액을 THY 플레이트에 추가합니다. 멸균 스프레더를 사용하여 카탈라제 용액을 확산시키고 플레이트가 라미나르 플로우 후드에서 30분 동안 건조되도록 합니다.연쇄상 구균 균주로 플레이트를 시드하려면 파이펫을 사용하여 하룻밤 재배 배양 80 마이크로 리터를 접시에 추가하고 멸균 스프레더를 사용하여 식기 표면에 박테리아를 완전히 퍼뜨리습니다. 하룻밤 사이에 촛불 항아리에 37도에서 접시를 배양하십시오. 대조군으로, 두 NGM 플레이트에, 종종에 대한 E.coli OP-50의 하룻밤 재배 문화의 80 마이크로 리터를 추가합니다.하룻밤 사이에 37도에서 접시를 배양하십시오. 다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거하고 접시가 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 멸균 웜 픽을 사용하여 NGM 급식 플레이트에서 30 L4 애벌레를 연쇄상 구균 시드 THY 플레이트로 옮길 수 있습니다.섭씨 25도에서 접시를 배양하십시오. 해부 현미경에서, 여러 시간 지점에서 각 접시에 살아있는 L4 애벌레의 수를 계산합니다. 멸균 웜 픽을 사용하여 웜을 부드럽게 프로딩하고 죽었는지 살아 있는지 확인합니다.처음에 벌레를 죽은 것으로 채점하거나 30분마다 살 수 있습니다. 벌레가 빠르게 죽기 시작하면 15 분 간격으로 점수를 매습니다. 분석이 완료되는 데 5~6시간이 소요됩니다.그 후 실험을 두 번 더 반복합니다. 아가로즈 패드를 준비하려면 두 개의 유리 슬라이드를 따라 실험실 테이프를 세로로 붙입니다. 이렇게 하면 아가로즈 패드의 두께가 결정됩니다.두 개의 녹화된 슬라이드 사이에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 아가로즈를 탈온화된 물에 녹여 체중 2%를 만들고 전자레인지에서 용액을 가열합니다. 파이펫을 사용하여 100 마이크로리터의 용융 아가로즈를 깨끗한 슬라이드 의 중앙에 놓습니다.즉시 용융 아가로즈 위에 또 다른 깨끗한 유리 슬라이드를 놓고 부드럽게 아래로 눌러 패드를 만듭니다. 아가로즈가 고체화되고 그 후 상단 슬라이드를 제거하도록 허용합니다. 아가로즈 패드는 사용할 준비가 되어 있습니다.37섭씨까지 미리 따뜻합니다. 생존 성 약에서 이전에 수행 된 바와 같이 연쇄상 구균 균주로 플레이트를 시드. 종자 3 NGM 플레이트 E-coli OP-50 제어 및 하룻밤 섭씨 37도에서 배양.다음 날, 실온으로 접시를 식힙니다. M9W 버퍼를 사용하여 NGM 또는 NGM RNAi 급식 플레이트에서 L4 애벌레를 15ml 원추형 튜브로 세척하십시오. 원심분리기에서 1분 동안 튜브를 450배 g로 회전시합니다.상류제를 데칭하고 각 튜브에 10ml의 M9W를 추가합니다. 원심 단계를 세 번 더 반복합니다. M9W의 250 마이크로리터에서 웜을 다시 중단하고 벌레 서스펜션 35방울을 깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다.해부 현미경에서 마이크로 리터 당 웜수를 추정합니다. 파이펫을 사용하여 각 THY 연쇄상 구균 시드 및 NGM E.coli 시드 플레이트에 약 100 L4 애벌레를 추가합니다. 박테리아의 변형 당 세 접시를 사용합니다.섭씨 25도에서 2~3시간 동안 접시를 배양합니다. 그 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. M9W로 씻어 내고 15ml 원물 튜브로 벌레를 수집합니다.원심 단계에서 이전에 했던 것처럼 벌레를 세 번 씻으세요. 포부로 대부분의 M9W를 제거하십시오. 그리고 마취를 위한 벌레 펠릿에 2 밀리머 나트륨 아지드 또는 테트라미솔 염산염을 포함하는 M9W의 500 마이크로리터를 추가합니다.15 분 동안 실온에서 벌레 펠릿으로 튜브를 배양하십시오. 그런 다음, 웜 서스펜션의 15 마이크로리터를 준비된 전초 패드에 떨어뜨립니다. 형광 현미경으로 Fitzy 및 Dappy 필터를 사용하여 skn-1의 국소화를 시각화합니다.이미지 웜은 10배, 20배 배율로 합니다. 핵 국산화가 관찰되지 않는 국소화; 낮은 국소화, 중간 국소화, SKN 1 BCGFP가 웜의 전방 또는 후방에 있는 및 모든 장 세포에서 핵 국산화가 관찰되는 높은 현지화를 기반으로 웜을 점수. 이 실험에서, 미티스 그룹의 구성원은 신속하게 S.mutans반대로, S.salivarius 및 비 병원성 대장균 OP-50반대로 벌레를 죽였다.카탈라제가 THY 에이거로 보충되었을 때, 벌레의 학살은 폐지되었다. 웜의 죽음은 야생 형 및 칭찬 균주에 비해 델타 spxB 돌연변이 균주에서 관찰되지 않았다. 이 데이터는 Mitis Group에 의해 생성된 과산화수소가 벌레의 살인을 중재한다는 것을 건의합니다.skn-1 녹다운 웜의 생존율이 벡터 제어 처리 웜에 비해 현저한 감소가 관찰되었다. skn-1 돌연변이 균주와 N2 야생형 웜과 유사한 살인 표현형이 관찰되었다. 이것은 skn-1이 미티스 그룹에 벌레의 생존에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.skn-1 BCGFP의 국소화는 S 코르도나에의 델타 spxB 돌연변이 균주에 대한 응답이 아닌 야생 형 N-칭찬 균주에 노출 된 웜에서 관찰되었다. P38 맵 키나아제 통로의 성분이 쓰러진 후, skn-1 BCGFP의 국소화를 감소시키고, 벡터 제어 처리 웜에 비해 처리된 웜을 녹다운하였다. 연쇄상 구균 c를 사용 하 여.elegans 시스템, 과산화수소가 내피 성 구균 스트레스, 미토콘드리아 손상, 미토포이 및 토포지에 미치는 영향은 더 연구 될 수 있습니다. 또한, 과산화수소가 세포의 핵심 공정을 방해하여 면역 반응을 유도하는 virilescence 인자로서 작용하는 메커니즘을 확인할 수 있다.

studying-oxidative-stress-caused-mitis-group-streptococci

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

중간 신진 대사 유량의 가스 크로마 토그래피 질량 spectrometric 분석하여 안정 원소 프로파일은 선충류에 설명되어...

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스</em

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

출처: Naji, A., et al. Caenorhabditis elegans의 Mitis 그룹 연쇄상 구균에 의해 유발된 산화 스트레스 연구. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 박테리아 배양을 준비하기 위해 Todd-Hewitt 효모 추출물 또는 THY 한천 배지를 사용하여 미호기성 조건에서 Streptococcus mitis를 배양하는 방법을 보여줍니다.

숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 Streptococcus mitis 배양 준비

출처: 나지, A. 외. 카에노르합디티스 엘레간스에서 미티스군 연쇄상구균에 의해 유발되는 산화 스트레스 연구. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 C. elegans에서 녹색 형광 단백질 표지 SKN-1을 사용해 산화 스트레스를 모니터링하기 위해 녹색 형광을 추적하는 방법을 보여줍니다. S. gordonii 에 노출된 벌레는 강한 핵 형광을 보여 병원체 유발 스트레스를 확인시킴으로, 대 장균 을 먹인 벌레는 세포질에서 확산된 녹색 형광을 보여 SKN-1 활성화가 최소화됨을 나타냅니다.

GFP 태그 SKN-1을 이용한 C. elegans 의 병원체 유발 산화 스트레스 시각화

C. elegans는 산화 스트레스 저항성과 관련된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 매력적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 96개의 웰 플레이트에서 여러 산화제를 사용하여 액상에서 C. elegans 동물의 산화 스트레스 저항성을 측정하는 프로토콜을 제공합니다.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

지속적인 화학 물질의 트랜스 및 다세대 효과는 환경과 인간의 건강에 대한 장기적인 결과를 판단하는 데 필수적입니다. 우리는 자유로운 살아있는 선충 예쁜 꼬마 예쁜꼬마선충을 사용하여 트랜스 및 다세대 효과를 연구하기위한 새로운 상세한 방법을 제공합니다.

독성물질의 트랜스 및 다세대 효과를 연구하기 위한 예쁜꼬마선충 사용

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충의장 투과성을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 장 내 박테리아와 숙주 간의 상호 작용과 관련된 장 건강에 대한 기본 생물학적 연구와 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환을 치료하는 프로바이오틱 및 화학 약제 식별 스크리닝에 유용합니다.

케노하브디티스 예쁜꼬마선충의 장 내 침투성에 대한 박테리아와 화학물질의 영향 측정

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

학습하세요 Mitis 그룹 Streptococci가 생성한 과산화수소에 의한 Caenorhabditis elegans의 산화 스트레스 반응을 연구하는 방법을. 이 생물학적 활성산소종을 이용한 지속 가능한 기술은 병원성과 스트레스 반응 활성화를 효과적으로 분석합니다.

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

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