Name: 등온선 적정 열 량 효소 안정성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 등온선 적정 열 량(ITC)을 이용한 효소 활성 열 안정성 측정 방법입니다. 이 기술은 전통적 분석법보다 적은 시간이 소요되며 다양한 효소에 적용 가능하여 산업용 효소 개발에 효율적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. 샘플 준비
<ol><li>
pH 4.6에서 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼의 1000 mL
	<ol>
<li>졸업 하는 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL를 측정 합니다.</li>
		<li>무수 나트륨 아세테이트의 8.2 g의 무게와 비 커에 추가.</li>
		<li>비 커 저 어 접시에, 비 커로 저 어 막대를 배치, 저 어 접시에 돌려 놓고 완전히 녹아 때까지 저 어.</li>
		<li>무수 나트륨 아세테이트는 완전히 해산, 보정 된 pH 미터를 가진 해결책의 pH를 측정 합니다.</li>
		<li>원하는 pH 4.6를 1 M HCl 이나 NaOH 적절 하 게 추가 합니다.</li>
		<li>때까지 총 볼륨은 1000 mL 증류수를 추가 합니다.</li>
		<li>사용까지 실내 온도에 상점.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
효소 솔루션
	<ol>
<li>효소 졸업 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.6 15 ml에서의 첫 번째 측정 8 mL에 의해 10-30 mg/mL 범위 내에서 솔루션 실린더의 10 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>효소와 함께 15 mL 원뿔 튜브에 버퍼 솔루션을 추가 하 고 효소 해산 했다 때까지 적극적으로 악수.</li>
		<li>총 볼륨은 10 mL 때까지 더 많은 버퍼 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>사용 될 때까지 4 ° C에서 효소 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기판 솔루션
	<ol>
<li>300-600 m m 범위 내 기판 솔루션을 준비, 기판 그램에 원하는 농도 확인 하는 데 필요한 금액을 계산 합니다.</li>
		<li>기판에 밖으로 무게와 100 mL 유리 비 커에 배치</li>
		<li>졸업 25 mL 실린더를 사용 하 여 버퍼 솔루션의 20 mL를 측정 하 고 유리 비 커에 추가.</li>
		<li>저 어 접시에 비 커를 놓고 비 커에 자석 저 어 막대를 배치 합니다. 더위를 켜고 교 반 속도 적절 하 게 조정.</li>
		<li>기판은 해산 될 때까지 계속 저 어 수 있습니다.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브로 기판 솔루션을 부 어 하 고 총 볼륨은 45 mL 때까지 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.6을 추가 합니다. 흔들어 섞는다.</li>
		<li>사용 될 때까지 실 온에서 기판 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 실험 수행
<ol><li>ITC는 악기를 준비<ol>
<li>참조 셀은 350 µ L의 증류수에 대 한 로드를 확인 합니다. 샘플 셀에 효소를 로드 하기 전에 샘플 셀 청소 되었는지 확인 합니다.</li>
		<li>프로토콜-채우기 로드 주사기 2% 청소 솔루션 (자료 테이블)의 500 µ L와 함께 청소, 신중 하 게 샘플 셀에 바늘을 삽입, 셀 채우기 및 천천히 같은 주사기를 사용 하 여 액체를 제거. 비 커에 액체를 폐기 합니다. 70% 에탄올과 2% 청소 솔루션 (재료의 테이블)을이 두 번 세 번 반복 하 고 증류수로 10 번을 씻어.</li>
		<li>효소 솔루션의 450 µ L 로드 주사기를 채우십시오, 신중 하 게 샘플 셀의 하단에 모든 방법을 바늘을 삽입 하 고 천천히 기포의 형성을 방지 하기 위해 100 µ L 라인 아래로 플런저를 누르십시오.</li>
		<li>물으로 바늘 끝을 배치 다음 천천히 차지는 주사기로 물 다음 폐기물 용기에 물을 분배 하 여 증류수로 50 µ L 적정 주사기 세 번을 씻어.</li>
		<li>세 번 기판 솔루션 rinsing 하 여 잔여 물을 제거 합니다.</li>
		<li>주사기는 어떤 공기 거품 없이 가득 될 때까지 솔루션을 그려서 기판 솔루션 적정 주사기를 채우십시오.</li>
		<li>여전히 기판 솔루션에에서 주사기 플런저를 제거 하 고 약 2 µ L 주사기의 상단을 입력 하는 플런저를 다시 공기의 허용.</li>
		<li>ITC의 buret 핸들을 제거, buret 핸들 안에 주사기를 놓고 나사를 꽉 때까지.</li>
		<li>보풀 없는 조직으로 활동가의 끝을 닦아 다음 신중 하 게 buret 핸들 ITC에 놓고 장소에 잠금.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 설정 ITCrun
<ol><li>컴퓨터에서 ITCrun 을 열고 설정을 클릭 합니다.</li>
	<li>교 반 속도 클릭 하 고 350 RPM으로 설정. 주사기 크기 (µ L)을 확인 하 고 그것은 50 µ L에 확인.</li>
	<li>온도 설정 하 고 업데이트를 누릅니다. 이 단계를 수행 하는 것이 좋습니다 ITC를 준비 하기 전에 적어도 1 시간. 열 또는 필요에 따라 진정 악기에 대 한 충분 한 시간 수 있습니다.</li>
	<li>실험 설정에 대 한 증분 적정을 선택 합니다.</li>
	<li>주사를 설정 하려면 삽입 을 클릭 합니다. 5400 주입 간격 조정 s, 4 및 4 주입 수 주입 볼륨 (µ L). 설정을 확인 하려면 확인 을 누릅니다.</li>
	<li>재래식 상자에서 자동 equilibrate 및 큰 예상 열을선택 합니다. (예상된가 열 작은 경우에, 사람은 예상된 열 아래 작은 선정할 수 있다; 그러나,이 평형 시간을 증가할 것 이다.)</li>
	<li>300으로 초기 기준선 설정 s.</li>
	<li>실행된, 클릭 시작 하려면 시작 감동 요금 옆에 있는 기호 하 고 시작 렌치 기호 옆에 위치를 클릭 합니다.</li>
	<li>파일을 저장 하 고 실행 하려면 악기를 허용.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>NanoAnalyze에서 파일을 엽니다. 데이터 를 클릭 하 고 데이터 열을 선택 합니다.</li>
	<li>모든 데이터를 선택, 복사 하 고 Microsoft Excel로 데이터를 붙여 넣습니다.</li>
	<li>300에서 필요한 값을 추가 하 여 0 기준선을 조정 하기 위해 s 0. 이 수정 열 속도 값의 전체 열에 적용 됩니다.</li>
	<li>방정식을 사용 하 여 각 주입에 대 한 열 속도의 최소 또는 최대 값 찾기: =MIN(cell:cell) 또는 MAX(cell:cell). 각 데이터 요소는 각 주입에 효소의 피크 효소 활동을 나타냅니다.</li>
	<li>값은 적정 하는 동안 발생 한 시간에 대 한 최소 또는 최대 값의 그래프를 플롯 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

여기에 설명 된 ITC 효소 안정성 분석 결과의 주요 이점은 자동화 이다. 일단 모든 적절 한 버퍼 및 솔루션은, 각 분석 결과 대 한 설정 시간 분석 결과 하 고 사람에 대 한 약 15 분입니다. 반면, 당화 및 lactase의 활동에 대 한 기존의 분석 하 고 분석 결과의 지속적인 참여와 함께 약 2 시간을 요구 하 고 많은 효소 활동 분석 실험을 상당히 더 많은 시간. 이전 발행물에서 우리는 당화 활동11에 대 한 더 전통적인 spectrophotrometric 방법에 ITC 메서드에서 데이터를 비교 하는 방법을 증명 하고있다.
ITC는 분석 결과의 또 다른 장점은 거의 모든 효소12의 적용입니다. 따라서, 특정 조건에서 다른 효소의 안정성 테스트 여러 다른 분석 실험 설정이 필요 하지 않습니다. 또한, ITC 분석 결과 새로운 효소 또는 적합 한 색도계 분석 결과 효소의 활동의 안정성을 ...

효소는 단백질 catalyzing 다양 한 유기 반응의 수 있습니다. 중립 pH 가혹한 용 매를 사용 하 여 피할 근처에서 수성 해결책에서 대부분 효소 기능. 그들의 높은 선택도 때문에 효소 촉매 반응 적은 생산 (일부 경우에 아무 부산물) 산 및 기초1등 선택적 비 촉매 보다 부산물. 이것은 특히 관련 식품 제조 최종 제품 인간의 소비를 위한 안전은 모든 화학 반응을 수행 해야 합니다 어디 에입니다. 현재, 효소는 높은 당 옥수수 시럽2, 치즈3, 맥주4, 유 당-무료 우유5및 다른 중요 한 식품을 생산 하는 데 사용 됩니다. 이 종이 식품 산업에서 효소 사용에 초점을 맞추고, 하는 녹색 화학 및 의약품 합성에 포함 하는 효소에 대 한 다른 많은 사용이 있습니다.
효소의 유틸리티는 효소의 3 차원 구조를 유지에 따라 효소 활동의 안정성에 의해 제한 됩니다. 효소 구조 수정 PEGylation6, 동원 정지 고체 지원7,8, 유전 수정 및 공식에 의해 안정 될 수 있다. 현재, 효소 안정성은 차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC)에 의해 일반적으로 측정 하 고 끝점 효소 활동 분석 실험9. DSC 측정 온도는 효소 펼쳐져; 더 높은 온도, 더 안정적인 구조. 그러나, 활동의 손실 효소 또는 효소10내 도메인을 전개 하는 데 필요한 보다 낮은 온도에서 자주 발생 합니다. 따라서, DSC 효소 수정 효소 활동의 안정성을 증가 여부를 확인 하려면 충분 하지 않습니다. 끝점 효소 분석 실험 보통 집중 시간, 여러 샘플을 필요로 하 고 종종 매우 색 또는 불투명 솔루션 또는 정지에 적용 되지 않습니다 하는 결합 된 색도계 반응을 포함.
이 작품 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 효소 활동의 안정성의 직접 측정 하는 방법을 보여 줍니다. ITC는 열 또는 반응의 과정에서 흡수의 속도 측정 합니다. 이후 거의 모든 반응 생성 하거나 열을 흡수, ITC는 우유와 같은 불투명 한 미디어에 반응 결합 반응을 하거나 발생 하지 않는 등 대부분 효소 촉매 반응에 대 한 사용할 수 있습니다. ITC는 많은 종류의 반응, 화학 운동 매개 변수를 측정 하기 위해 많은 수십 년 동안 사용 되었습니다 하지만 여기에 제시 된 프로토콜 ITC를 사용 하 여 효소 촉매 반응의 피크 열 속도 측정에 초점을 맞추고 효소 활동 선형 함을 보여 줍니다. 최대 열 속도와 상관 된다. ITC 피크 열 속도의 측정은 주로 자율 고 아주 작은 인사 시간 설정 및 분석 필요로.

<table><tbody><tr><td>a-락토오스</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>알 수 없음 (너무 오래된)</td> <td>500g</td></tr><tr><td>나트륨 아세테이트, 무수 99% 분</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250g</td></tr><tr><td>락타제&nbsp;</td><td>MP Bio</td><td>100780</td><td>5g</td></tr><tr><td>하이드로콜릭 애씨드 솔루션, 1N&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>SA48-500</td><td>500mL</td></tr><tr><td>벤치탑 미터- pH</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td>1갤런</td></tr><tr><td>Micro-90</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1L(세척액)</td></tr></tbody></table>

등온선 적정 열 량 효소 안정성 측정

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

이 작품에는 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 효소 활동의 안정성을 측정 하기 위한 새로운 방법을 보여 줍니다. 최대 열 속도 효소 솔루션으로 기판 솔루션의 단일 주사 효소 활동을 연관 후 관찰. 시간이 지남에 따라 동일한 효소 솔루션으로 기판의 여러 주사 효소 활동의 손실을 보여줍니다. 분석 결과, 아주 약간의 인사 시간을 요구 하는 자치 이며 대부분의 미디어와 효소에 적용 됩니다.

그림 1 및 그림 5 는 대표적인 결과 데이터 두 효소 lactase 및 당화를에서 보여줍니다. Lactase 및 당화 endothermically와 exothermically, 각각 두 개의 단으로는 당의 가수분해 촉매. 두 효소 반응 효소의 채도 배제 하는 농도에서 실행 되었습니다.
Lactase 데이터 ITC 데이터를 사용 하 여 효소 안정성을 추정 하는 방법을 보여 줍니다. 600 m m 유 당 (그림 1)의 4 개의 순차적 4 µ L 주사 20 mg/mL lactase로 적정 했다. 5400의 간격 각 주입 사이 s, 적용 하 고 각 주입 하기 전에 초기 기준선 돌아갈 충분 한 시간 수 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜 25 ° C와 35 ° C, 45 ° C, 55 ° c.에서 수행 되었다 또한, 유 당 600...

효소 활동의 열 안정성은 쉽게 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 측정 됩니다. 대부분 단백질 안정성 분석 실험은 현재 측정 단백질 전개, 사용 하지만 효소 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. ITC의 효소 활동의 안정성에 효소 수정 효과의 직접 측정을 수 있습니다.

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

반응에 촉매로 효소를 사용 하 여 반응에 필요한 에너지의 양을 줄일 수 있습니다., 독성 부산물을 줄일 수 있습니다. 그러나, 산업에서 효소의 사용은 제한적이다, 효소가 안정적이지 않고 비용이 많이 들 수 있기 때문에. 이 프로토콜은 조건이 효소 활동에 해로운지, 또는 효소에 대한 수정이 안정성을 증가시키는지 결정하는 데 걸리는 시간을 줄일 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 전통적인 효소 안정성 에세이보다 더 적은 수의 사람이 필요하다는 것입니다. 또한,이 프로토콜은 열을 방출하거나 흡수하는 모든 반응과 함께 사용할 수 있기 때문에 광범위한 효소와 함께 사용할 수 있습니다. 시작하려면 0.1 어금니 나트륨 아세테이트 버퍼를 준비하십시오.1, 000 밀리리터 졸업 비커에 증류수 800 밀리리터를 측정합니다. 그런 다음 8.2 그램의 무수성 아세테이트의 무게를 측정하고 비커에 추가합니다. 비커를 교반 접시에 놓습니다.교반 봉을 비커에 넣고 저어접시를 켜서 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 무수성 아세테이트 나트륨이 완전히 용해되면 보정된 pH 미터를 사용하여 용액의 pH를 측정합니다. 파이펫을 사용하여 4.6에서 원하는 pH를 얻기 위해 그에 따라 1 개의 어금다 산 또는 수산화 나트륨을 첨가하십시오.총 부피가 1, 000 밀리리터에 도달할 때까지 증류수를 비커에 넣습니다. 효소 용액을 준비하려면 15 밀리리터 졸업 실린더에서 0.1 어금니 나트륨 아세테이트 버퍼의 8 밀리리터를 측정합니다. 그런 다음 완충액을 효소로 15 밀리리터 원내 튜브에 넣고 효소가 용해될 때까지 힘차게 흔들어 줍니다.총 볼륨이 10 밀리리터에 도달할 때까지 버퍼 솔루션을 더 추가합니다. 사용 전까지 효소 용액을 섭씨 4도에 보관하십시오. 기판 용액을 준비하려면 기판을 계량하고 100 밀리리터 유리 비커에 넣습니다.완성된 실린더를 사용하여 버퍼 용액의 20밀리리터를 측정한 다음 유리 비커에 추가합니다. 비커를 교반판에 놓고 자기 교반 봉을 비커에 넣습니다. 열을 켜고 그에 따라 교반 속도를 조정합니다.기판이 용해될 때까지 교반을 계속할 수 있습니다. 기판 용액을 15밀리리터 원모 튜브에 붓고, 총 부피가 45밀리리터가 될 때까지 이전에 준비된 아세테이트 나트륨 버퍼를 추가합니다. 튜브를 흔들어 섞어 줍니다.기판 용액을 실온에 보관하여 사용할 때까지 보관하십시오. 컴퓨터에서 ITC 실행을 열고 설정을 클릭합니다. 교반 속도를 클릭하고 350 rpm으로 설정합니다.주사기 크기가 50 마이크로 리터에 있는지 확인하십시오. 온도를 섭씨 55도로 설정하고 업데이트를 누릅니다. ITC 기기가 필요에 따라 가열하거나 냉각할 수 있도록 진행하기 전에 최소 한 시간 이상 기다립니다.효소를 적재하기 전에 기준 셀에 증류수 350 마이크로리터가 적재되어 있는지 확인하십시오. 샘플 셀을 청소하려면 2% 세척 용액의 500 마이크로리터로 적재 주사기를 채웁니다. 조심스럽게 샘플 셀에 바늘을 삽입, 세포를 채우고, 천천히 같은 주사기를 사용하여 액체를 제거.액체를 비커에 넣습니다. 이 단계를 2% 세척 용액으로 두 번 반복하고, 70%의 에탄올로 3회, 증류수로 10회 세척합니다. 샘플 셀을 세척한 후 450마이크로리터의 효소 용액으로 적재 주사기를 채웁니다.조심스럽게 시료 세포의 바닥에 모든 방법을 바늘을 삽입하고 천천히 기포의 형성을 방지하기 위해 100 마이크로 리터 라인아래로 플런저를 누릅니다. 그런 다음 바늘 끝을 물에 넣고 천천히 물을 주사기로 가져 간 다음 물을 폐기물 용기에 분배하여 증류수로 50 마이크로 리터 적정 주사기를 세 번 씻으십시오. 잔류수를 제거하기 위해 기판 용액으로 세 번 헹구는 다.그 후, 주사기가 기포없이 가득 차 때까지 용액을 끌어서 기판 용액으로 적정 주사를 채웁니다. 기판 용액에 여전히 주사기를 사용하면 플런저를 제거하고 약 2 마이크로리터의 공기가 주사기의 맨 위에 들어가 플런저를 다시 삽입할 수 있습니다. ITC의 버렛 핸들을 제거하고 주사기를 버렛 손잡이 안에 놓고 꽉 다할 때까지 나사를 놓습니다.무분별한 티슈로 적정 주사기의 끝을 닦은 다음, 조심스럽게 BURETTE 핸들을 ITC 기기에 넣고 제자리에 잠급합니다. 실험 설정의 경우 증분 적도를 선택합니다. 삽입을 클릭하여 주사를 설정합니다.사출 간격을 5, 400초로 조정하고, 주사부도 4마이크로리터로, 주사 수를 4개로 조정한다. 확인을 눌러 설정을 확인합니다. 평형 상자에서 자동 평형과 예상 열을 선택합니다.초기 기준선을 300초로 설정합니다. 실행을 시작하려면 교반 속도 옆에 있는 시작 기호를 클릭한 다음 렌치 기호 옆에 있는 시작을 클릭합니다. 파일을 저장하고 계측기를 실행하도록 허용합니다.데이터를 분석하려면 나노 분석에서 파일을 엽니다. 데이터를 클릭하고 데이터 열을 선택합니다. 모든 데이터를 선택하고 복사한 다음 데이터를 Microsoft Excel에 붙여 넣습니다.0을 만들기 위해 300초에 필요한 값을 추가하여 기준선 0을 조정합니다. 열속도 값의 전체 열에 이 수정을 적용합니다. 그런 다음 적정 중에 값이 발생한 시간에 대해 최소 값 또는 최대 값의 그래프를 플롯합니다.이 프로토콜에서, lactase 활동의 ITC 데이터 추적은 55섭씨, 섭씨 45도, 섭씨 35도 및 섭씨 25도에서 pH 4.6 완충액에 락타제 용액에 4개의 순차적으로 주사하는 것으로 표시됩니다. 혼합의 열을 위해 55°C에서 효소 조절이 수행되지 않았습니다. 효소의 각 주입에 대해, 혼합의 초기 외열이 있고, 그 후, 락타제 촉매 인외성 인더리움 의 유당 가수 분해는 반응이 완료될 때까지 발생하며, 열속도는 기준선으로 반환된다.각 주사 다음 의 외열성 피크 최소, 효소 활성의 감소 로 인해 이전 주입 보다 조금 적은. 예상대로, 각 주사에 대한 효소 안정성은 온도 가 증가함에 따라 감소합니다. 대조군 실험은 25°C에서 락타제 활성을 보여 주며 4개의 주사 후 희석으로 인해 효소 활성이 8% 감소했습니다.네 번째 주사를 고려하면 분석에서 73 % 감소를 나타내며, 효소 활성의 실제 손실은 65 %였습니다. 따라서, 각 주사에서 유래된 락타제의 희석은 효소 활성에 11%의 비교적 작은 효과를 가졌다. 효소 및 기판 용액을 만드는 데 사용되는 버퍼가 가능한 한 밀접하게 일치하는 것이 중요합니다.pH 또는 농도의 불일치는 반응 열을 마스크 할 수있는 혼합의 더 큰 열을 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜을 효소 연구에 적용하고 반응 과정에서 방출또는 흡수되는 열 속도를 측정하여 안정성을 결정할 수 있습니다.

measuring-enzymatic-stability-by-isothermal-titration-calorimetry

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

ITC는 호스트에 리간드의 바인딩을 연구를위한 강력한 도구입니다. 복잡한 시스템에서 그러나, 몇 가지 모델은 동일하게 데이터를 맞을 수 있습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 복잡한 시스템에 적합한 바인딩 모델을 명료하게하다와 해당 열역학적 파라미터를 추출하는 수단을 제공합니다.

바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

Macromolecule - 리간드 친화력을 측정하기위한 등온 적정의 열량

박테리아 배양액을 연속적으로 희석하여 성장 배지가 들어 있는 열량 측정 바이알에 분취량을 추가합니다.밀봉된 바이알을 등온 미세열량계의 멀티웰 플레이트에 넣어 대사열 생성을 측정합니다.이 장치는 감지된 열이 박테리아 대사에서만 발생하도록 일정한 온도로 유지됩니다.박테리아는 영양분을 대사하고 증식하면서 센서가 실시간으로 감지하는 열을 방출합니다.동시에 인큐베이터에서 동일한 바이알을 배양합니다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정하여 박테리아 성장을 모니터링합니다.희석액의 열량 측정 신호를 사용하여 열 활성 곡선을 구성하고 이를 OD 값과 연관시킵니다.날카로운 첫 번째 피크는 기하급수적인 성장 중 유산소 호흡을 나타냅니다.산소가 제한되면 세포는 혐기성 발효로 전환하여 두 번째 날카로운 피크를 생성합니다.정지기에 들어가면 박테리아는 효소를 분비하여 세포외 단백질을 분해하고 신진대사를 유지하여 넓은 피크를 생성합니다.

박테리아의 대사 활동을 모니터링하기 위한 등온 미세 열량계

8 oxoguanine의 DNA glycosylase의 glycosylase 활동 시간 코스 제품의 형성과 선형 정상 상태 위상 버스트를 전시 이상성입니다. 각각 8-oxoguanine 및 제품 DNA에서 glycosylase 릴리스의 절제에 해당 담금질 흐름 기술, 버스트 및 정상 상태 속도를 측정 할 수 있습니다, 활용.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

등온 적정 열량 측정 열 흐름이 방출 또는 화학 반응에 흡수. 이 방법은 효소 - 촉매 반응을 정량화하는데 사용될 수있다. 본 논문에서는 악기 설정을위한 프로토콜, 실험 실행 및 데이터 분석은 일반적으로 기술되고, 잭 콩 요소 분해 효소에 의해 가수 분해 효소 요소의 특성에 적용.

핫 생물 촉매 : 등온 적정 열량 효소 반응의 특성을

체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

시차 주사 열량은 단백질을 변성시키는 데 필요한 열 전이 온도 (들) 및 전체 열 에너지를 측정한다. 얻어진 결과는 백신 제제에 단백질 항원의 열 안정성을 평가하기 위해 사용된다.

시차 주사 열량 - 단백질 항원의 열 안정성과 형태를 평가하기위한 방법

빠르게 열 교대 분석 실험 및 차동 스캔 fluorimetry 나노 통해 조건의 다양 한 단백질의 열 안정성을 테스트 하는 프로토콜 제공 됩니다. 버퍼 시스템, 소금 및 첨가물, 함께 기능 및 구조 연구에 대 한 적당 한 버퍼를 식별 하는 단백질 분석은 3 독특한 안정성 화면 구성.

단백질을 안정화 하는 방법: 열에 대 한 안정성 화면 이동 분석 및 나노 시차 바이러스 X 프로젝트에서 Fluorimetry

본 프로토콜은 샘플 준비, 실행 표준 및 샘플을 포함하여 DNA 압타머와 테트라사이클린 간의 결합의 연관성 및 해리 역학을 분석하고 결과 데이터를 해석하기 위한 등온 적정 열량측정법(ITC)의 사용을 설명합니다.

등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

식물에서 영양소 및 독성 플럭스의 측정은 식물 영양 및 독성 연구에 필수적입니다. 여기에서는 칼륨(K+) 및 암모니아/암모늄(NH3/NH4+) 플럭스를 예로 사용하여 온전한 식물 뿌리의 유입 및 유출 측정을 위한 방사성 추적자 프로토콜을 다룹니다. 이러한 기술의 장점과 한계에 대해 설명합니다.

방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

배우세요 등온선 적정 열 량(ITC)을 이용한 효소 활성 열 안정성 측정 방법입니다. 이 기술은 전통적 분석법보다 적은 시간이 소요되며 다양한 효소에 적용 가능하여 산업용 효소 개발에 효율적입니다.

등온선 적정 열 량 효소 안정성 측정

더 많은 동영상 탐색